本發明涉及融(rong)合蛋白(bai)表達純化(hua)方法技術領(ling)域，具體為一種融(rong)合蛋白(bai)表達純化(hua)方法。

背景技術：

在生(sheng)(sheng)命(ming)科學研(yan)究(jiu)和生(sheng)(sheng)物制品的(de)生(sheng)(sheng)產過(guo)程(cheng)中，利用表(biao)達(da)載(zai)體制備重(zhong)組(zu)蛋(dan)白時(shi)最重(zhong)要的(de)技術之一，獲得大(da)量有活(huo)性(xing)的(de)重(zhong)組(zu)蛋(dan)白是(shi)進行生(sheng)(sheng)物制品研(yan)究(jiu)和生(sheng)(sheng)產的(de)必要條件。構建有效的(de)表(biao)達(da)載(zai)體是(shi)表(biao)達(da)目的(de)基因(yin)的(de)基本(ben)要求，同時(shi)也是(shi)影(ying)響基因(yin)表(biao)達(da)水平及蛋(dan)白活(huo)性(xing)的(de)重(zhong)要因(yin)素。一般來說(shuo)，非融(rong)合型表(biao)達(da)載(zai)體雖然能(neng)較好(hao)的(de)保持(chi)外源蛋(dan)白的(de)一級結構，但其表(biao)達(da)量較低、外源蛋(dan)白分(fen)離純化困難，回(hui)收率低，分(fen)離純化工(gong)(gong)藝復雜，工(gong)(gong)業(ye)上大(da)規模生(sheng)(sheng)產的(de)成本(ben)較高。

技術實現要素：

本(ben)發明的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)在于提(ti)供一種融合蛋白表(biao)達(da)純化(hua)(hua)方法，具有表(biao)達(da)量高、外源蛋白分離(li)(li)純化(hua)(hua)簡(jian)單、回(hui)收率高、分離(li)(li)純化(hua)(hua)工藝簡(jian)便和成本(ben)低的(de)(de)(de)優點(dian)，以解(jie)決(jue)上述背景技(ji)術中提(ti)出的(de)(de)(de)問題。

為(wei)實現上述(shu)目(mu)的，本發明提供(gong)如下(xia)技術方案：一種融合(he)蛋(dan)白表(biao)達純(chun)化方法(fa)，包括以下(xia)實驗用品：1ul重(zhong)組的pET32a質粒、BL21(DE3)菌(jun)株、100ug/ml氨(an)芐青(qing)霉素(su)、0.5mM的IPTG、PBS緩沖液、220rpm、2M尿素(su)、50mMTris、300mMNaCl、1mMDTT、溶菌(jun)酶、0.2%TritonX-100、5mL NI-NTA、EK酶、鎳瓊脂糖親和(he)層(ceng)析和(he)SK3071 非干(gan)擾型蛋(dan)白濃度(du)測(ce)定試劑盒。

一種融合蛋白表達純化方法(fa)，包括(kuo)以下實(shi)驗過(guo)程：

S1:融(rong)合蛋白的(de)原核(he)表達；

S2:融合蛋白的純(chun)化；

S3:分析(xi)純化后融合(he)蛋白(bai)，通過SDS-PAGE電泳和灰度(du)分析(xi)，檢(jian)測(ce)分析(xi)純化后融合(he)蛋白(bai)的純度(du)，用(yong)SK3071 非干擾型蛋白(bai)濃度(du)測(ce)定試劑盒測(ce)定蛋白(bai)濃度(du)。

優(you)選的，所述S1包(bao)含以下(xia)步(bu)驟：

S1-1：轉(zhuan)化(hua)，取(qu)1ul重組的pET32a質粒轉(zhuan)化(hua)BL21(DE3)菌(jun)株，42℃熱擊90s，冰上靜置2min后涂平(ping)板(ban)(100ug/ml氨芐青霉素)，37℃培(pei)養過夜；

S1-2：選擇誘導條件；

S1-3：大(da)量誘(you)導，將培(pei)養(yang)(yang)的菌液(ye)按(an)1:100比例(li)接種(zhong)于4L 的LB液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)(yang)基中(zhong)，添(tian)加100ug/ml氨芐青霉素，37℃，220rpm培(pei)養(yang)(yang)，當OD值達到0.6左右時，添(tian)加終濃度為0.5mM的IPTG，20℃，220rpm，誘(you)導過(guo)夜(ye)，離心收集細(xi)胞菌體(ti)。

優選的，所述(shu)S2包(bao)含以下步(bu)驟(zou)：

S2-1：超聲破(po)碎菌體(ti)；

S2-2：鎳瓊脂(zhi)糖(tang)親和層析。

優選的，所述S3包含(han)以(yi)下步驟(zou)：

S3-1：融合蛋白的(de)表達及定(ding)位，通過S1和S2步驟小試(shi)樣(yang)品進行SDS-PAGE分析；

S3-2：融合蛋(dan)(dan)白的純(chun)化，SerD融合蛋(dan)(dan)白鎳瓊脂糖(tang)親(qin)和層(ceng)析純(chun)化后，SDS-PAGE分析；

S3-3：融合蛋白Western-Blot分析，SerD純化的融合蛋白經過(guo)Western-Blot分析；

S3-4：SerD融(rong)合蛋(dan)白(bai)EK酶切鎳瓊脂糖(tang)親和層析SDS-PAGE分(fen)析，SerD融(rong)合蛋(dan)白(bai)EK酶切后(hou)鎳瓊脂糖(tang)親和層析純化SDS-PAGE分(fen)析；

S3-5：蛋(dan)白(bai)(bai)濃(nong)度測(ce)定，用SK3071 非干擾型(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)濃(nong)度測(ce)定試劑盒(he)測(ce)定蛋(dan)白(bai)(bai)濃(nong)度:0.8mg/ml，BSA濃(nong)度為2mg/ml，測(ce)定的蛋(dan)白(bai)(bai)體(ti)積為20ul。

優選的，所(suo)述S1-2還包括以(yi)下步驟：

S1-2-1：挑(tiao)取(qu)表達菌株BL21(DE3)的單菌落于試管中（4mL LB培(pei)養基加(jia)100ug/ml氨(an)芐(xia)青(qing)霉素）37℃，220rpm過夜培(pei)養；

S1-2-2：將培養(yang)(yang)的菌液(ye)按1:100比例(li)分別接種于4mL的LB培養(yang)(yang)基中(zhong)，添加100ug/ml氨芐青(qing)霉素，37℃，220rpm培養(yang)(yang)；

S1-2-3：當OD值達到0.6左右時，添加(jia)終(zhong)濃度為(wei)0.5mM的IPTG，分(fen)別20℃，220rpm，誘導16h和(he)37℃，220rpm誘導4h，未(wei)加(jia)IPTG 誘導劑的作為(wei)陰(yin)性(xing)對照；

S1-2-4：收集菌體并用PBS緩沖液懸(xuan)浮；

S1-2-5：SDS-PAGE電泳檢(jian)測，選擇最佳的蛋白表達誘導條(tiao)件(jian)。

優選的，所述S2-1還包括以(yi)下步驟：

S2-1-1：將收集的細菌(jun)菌(jun)體(ti)用破碎Buffer（2M尿素，50mMTris，300mMNaCl，1mMDTT，溶(rong)菌(jun)酶，0.2%TritonX-100，pH=8.0）溶(rong)解，冰浴中超聲破碎菌(jun)體(ti)，功率(lv)400W，20min（超聲3S，暫停(ting)5S為一(yi)個循環）；

S2-1-1：超聲完畢，12000rpm，4℃，離心20min，上清(qing)做下一步純化。

優選的，所述(shu)S2-2還(huan)包括以下步驟：

S2-2-1：取5mL NI-NTA，用10倍柱床(chuang)體積的(de)Binding buffer清洗平(ping)衡柱子，流速5mL/min。將樣品和平(ping)衡好的(de)柱料4℃孵(fu)育1h；

S2-2-2：樣品上柱(zhu)，流(liu)速為(wei)2mL/min，收集穿透(tou)液；

S2-2-3：10倍柱床體積的結合(he)緩(huan)沖(chong)液清洗柱子，流(liu)速10mL/min；

S2-2-4：洗雜，流速(su)5ml/min，收(shou)集洗脫(tuo)液；

S2-2-5：洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液。

與現有技術相比，本(ben)發明(ming)的(de)有益效果(guo)是(shi)：本(ben)融(rong)合蛋(dan)白表達(da)純(chun)化(hua)(hua)方法(fa)，采用SDS-PAGE檢測，將(jiang)(500mM咪唑)含目標(biao)蛋(dan)白洗(xi)脫液透(tou)析(xi)到1M尿素，50mMTris，300mMNaCl，pH8.0緩沖(chong)液中(zhong)，4℃透(tou)析(xi)過夜，將(jiang)透(tou)析(xi)過夜的(de)樣品加入EK酶(mei)(EK酶(mei)的(de)量(liang)是(shi)1：1000（EK酶(mei)量(liang)：蛋(dan)白量(liang)）)，4℃酶(mei)切(qie)過夜，酶(mei)切(qie)后(hou)的(de)蛋(dan)白過鎳瓊脂糖(tang)親和(he)(he)層析(xi)，去除標(biao)簽(qian)和(he)(he)EK酶(mei)，通過SDS-PAGE電泳和(he)(he)灰度(du)(du)分(fen)(fen)析(xi)，檢測分(fen)(fen)析(xi)純(chun)化(hua)(hua)后(hou)融(rong)合蛋(dan)白的(de)純(chun)度(du)(du)，用SK3071 非(fei)干擾型(xing)蛋(dan)白濃度(du)(du)測定試劑盒測定蛋(dan)白濃度(du)(du)，使其相比較非(fei)融(rong)合型(xing)表達(da)載體具(ju)有表達(da)量(liang)高、外源蛋(dan)白分(fen)(fen)離純(chun)化(hua)(hua)簡單、回(hui)收率(lv)高、分(fen)(fen)離純(chun)化(hua)(hua)工藝簡便(bian)和(he)(he)成本(ben)低的(de)優點。

附圖說明

圖1為本發明的小試樣品進行SDS-PAGE分析結(jie)果圖；

圖(tu)(tu)2為本發明的SerD融合蛋白鎳瓊脂糖親和(he)層(ceng)析純化后(hou)，SDS-PAGE分析結果圖(tu)(tu)；

圖(tu)3為本(ben)發明的SerD純(chun)化的融合蛋白經過Western-Blot分析結果圖(tu)；

圖4為(wei)本(ben)發(fa)明的(de)SerD融合蛋白EK酶切后鎳瓊脂糖親和層析純化(hua)SDS-PAGE分析結果圖；

圖5為本(ben)發明的蛋白濃度測(ce)定結果(guo)圖。

具體實施方式

下面將結(jie)合本(ben)發明實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)中(zhong)的(de)附(fu)圖(tu)，對本(ben)發明實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)中(zhong)的(de)技術(shu)方案進行親楚、完(wan)整地描述，顯然，所(suo)描述的(de)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)僅(jin)僅(jin)是本(ben)發明一部(bu)分實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)，而不是全部(bu)的(de)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)。基于(yu)本(ben)發明中(zhong)的(de)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)，本(ben)領域普通(tong)技術(shu)人(ren)員在沒有做出創造性勞動(dong)前提(ti)下所(suo)獲得的(de)所(suo)有其他實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)，都(dou)屬于(yu)本(ben)發明保護的(de)范圍。

本發(fa)明提供一(yi)種(zhong)技術(shu)方案：一(yi)種(zhong)融合蛋白(bai)表(biao)達(da)純化方法，包括以下實(shi)驗用品：1ul重組的(de)pET32a質(zhi)粒、BL21(DE3)菌株、100ug/ml氨芐青霉素、0.5mM的(de)IPTG、PBS緩沖液、220rpm、2M尿(niao)素、50mMTris、300mMNaCl、1mMDTT、溶菌酶(mei)(mei)、0.2%TritonX-100、5mL NI-NTA、EK酶(mei)(mei)、鎳(nie)瓊脂糖親和(he)層析和(he)SK3071 非干擾(rao)型蛋白(bai)濃度測(ce)定試劑盒。

一種融合蛋(dan)白表達純(chun)化方法，包(bao)括以(yi)下實驗過程：

S1:融合蛋白的(de)(de)(de)原核(he)表(biao)(biao)達(da)(da)，轉化，取1ul重組的(de)(de)(de)pET32a質粒轉化BL21(DE3)菌(jun)(jun)株，42℃熱擊90s，冰(bing)上靜置2min后涂平板(100ug/ml氨(an)芐(xia)(xia)(xia)青霉(mei)素)，37℃培(pei)養(yang)(yang)(yang)過夜；選(xuan)擇誘(you)導條件(jian)，挑取表(biao)(biao)達(da)(da)菌(jun)(jun)株BL21(DE3)的(de)(de)(de)單菌(jun)(jun)落(luo)于試管中（4mL LB培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)加(jia)100ug/ml氨(an)芐(xia)(xia)(xia)青霉(mei)素）37℃，220rpm過夜培(pei)養(yang)(yang)(yang)；將培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)(de)菌(jun)(jun)液按1:100比例(li)分(fen)別接種于4mL的(de)(de)(de)LB培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)中，添(tian)加(jia)100ug/ml氨(an)芐(xia)(xia)(xia)青霉(mei)素，37℃，220rpm培(pei)養(yang)(yang)(yang)：當OD值達(da)(da)到(dao)0.6左右(you)時，添(tian)加(jia)終(zhong)濃度(du)為0.5mM的(de)(de)(de)IPTG，分(fen)別20℃，220rpm，誘(you)導16h和37℃，220rpm誘(you)導4h，未加(jia)IPTG誘(you)導劑的(de)(de)(de)作為陰性對照：收集(ji)菌(jun)(jun)體并(bing)用PBS緩沖液懸浮；SDS-PAGE電泳檢測，選(xuan)擇最佳的(de)(de)(de)蛋白表(biao)(biao)達(da)(da)誘(you)導條件(jian)；大量誘(you)導，將培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)(de)菌(jun)(jun)液按1:100比例(li)接種于4L 的(de)(de)(de)LB液體培(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)中，添(tian)加(jia)100ug/ml氨(an)芐(xia)(xia)(xia)青霉(mei)素，37℃，220rpm培(pei)養(yang)(yang)(yang)，當OD值達(da)(da)到(dao)0.6左右(you)時，添(tian)加(jia)終(zhong)濃度(du)為0.5mM的(de)(de)(de)IPTG，20℃，220rpm，誘(you)導過夜，離(li)心收集(ji)細胞菌(jun)(jun)體；

S2:融合蛋白的純(chun)化，超聲(sheng)(sheng)破(po)碎菌(jun)(jun)體(ti)，將收(shou)(shou)集(ji)(ji)的細菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)體(ti)用(yong)破(po)碎Buffer（2M尿(niao)素，50mMTris，300mMNaCl，1mMDTT，溶菌(jun)(jun)酶(mei)，0.2%TritonX-100，pH=8.0）溶解，冰浴(yu)中超聲(sheng)(sheng)破(po)碎菌(jun)(jun)體(ti)，功率(lv)400W，20min（超聲(sheng)(sheng)3S，暫停5S為(wei)一個循環）；超聲(sheng)(sheng)完畢，12000rpm，4℃，離心20min，上(shang)(shang)清(qing)做下一步純(chun)化；鎳瓊脂糖親(qin)和(he)層析，取5mL NI-NTA，用(yong)10倍柱(zhu)床(chuang)體(ti)積(ji)的結合緩沖液(ye)清(qing)洗平(ping)衡(heng)柱(zhu)子，流速(su)5mL/min。將樣(yang)品(pin)和(he)平(ping)衡(heng)好的柱(zhu)料(liao)4℃孵育1h；樣(yang)品(pin)上(shang)(shang)柱(zhu)，流速(su)為(wei)2mL/min，收(shou)(shou)集(ji)(ji)穿透液(ye)；10倍柱(zhu)床(chuang)體(ti)積(ji)的結合緩沖液(ye)清(qing)洗柱(zhu)子，流速(su)10mL/min；洗雜（2M尿(niao)素，50mMTris，300mMNaCl，10/50mM咪(mi)唑(zuo)(zuo)，pH=8.0），流速(su)5ml/min，收(shou)(shou)集(ji)(ji)洗脫液(ye)；洗脫（2M尿(niao)素，50mMTris，300mMNaCl，500mM咪(mi)唑(zuo)(zuo)，pH=8.0），流速(su)2ml/min，收(shou)(shou)集(ji)(ji)洗脫液(ye)；

S3:分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)后融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，通(tong)(tong)過SDS-PAGE電泳和灰度(du)分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，檢測(ce)(ce)分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)后融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)純(chun)(chun)度(du)，用SK3071 非干擾型(xing)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)濃度(du)測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)試劑盒(he)測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)濃度(du)，融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)表達及定(ding)(ding)(ding)位，通(tong)(tong)過S1和S2步驟小(xiao)試樣(yang)品(pin)進行SDS-PAGE分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，結果(guo)如圖一；融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)，SerD融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)鎳(nie)瓊(qiong)(qiong)脂(zhi)(zhi)糖親(qin)(qin)和層析(xi)(xi)(xi)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)后，SDS-PAGE分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，結果(guo)如圖二；融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)Western-Blot分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，SerD純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)的(de)融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)經過Western-Blot分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，結果(guo)如圖三(san)；SerD融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)EK酶切(qie)鎳(nie)瓊(qiong)(qiong)脂(zhi)(zhi)糖親(qin)(qin)和層析(xi)(xi)(xi)SDS-PAGE分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，SerD融(rong)(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)EK酶切(qie)后鎳(nie)瓊(qiong)(qiong)脂(zhi)(zhi)糖親(qin)(qin)和層析(xi)(xi)(xi)純(chun)(chun)化(hua)(hua)(hua)SDS-PAGE分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，結果(guo)如圖四；蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)濃度(du)測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)，用SK3071 非干擾型(xing)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)濃度(du)測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)試劑盒(he)測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)濃度(du):0.8mg/ml，BSA濃度(du)為(wei)2mg/ml，測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)的(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)體積為(wei)20ul，測(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)結果(guo)如圖五。

綜上所(suo)述：本發(fa)明使(shi)用(yong)了一種融合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)表達純(chun)化(hua)(hua)(hua)的方法，采用(yong)SDS-PAGE檢測(ce)，將(500mM咪(mi)唑)含目標蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)洗脫(tuo)液(ye)透析(xi)(xi)(xi)到1M尿素，50mMTris，300mMNaCl，pH8.0緩沖液(ye)中，4℃透析(xi)(xi)(xi)過(guo)(guo)夜，將透析(xi)(xi)(xi)過(guo)(guo)夜的樣品(pin)加入EK酶(mei)(mei)(EK酶(mei)(mei)的量(liang)是1：1000（EK酶(mei)(mei)量(liang)：蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)量(liang)）)，4℃酶(mei)(mei)切過(guo)(guo)夜，酶(mei)(mei)切后(hou)的蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)過(guo)(guo)鎳瓊脂糖親和層析(xi)(xi)(xi)，去除標簽和EK酶(mei)(mei)，通過(guo)(guo)SDS-PAGE電(dian)泳和灰度(du)分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，檢測(ce)分(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)后(hou)融合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的純(chun)度(du)，用(yong)SK3071 非干(gan)擾型蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)濃(nong)度(du)測(ce)定(ding)試劑盒測(ce)定(ding)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)濃(nong)度(du)，使(shi)其相比較非融合型表達載體具有(you)表達量(liang)高(gao)、外(wai)源蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)分(fen)(fen)離純(chun)化(hua)(hua)(hua)簡單、回收率高(gao)、分(fen)(fen)離純(chun)化(hua)(hua)(hua)工藝簡便(bian)和成(cheng)本低的優(you)點(dian)。

以(yi)上所述(shu)，僅為(wei)本(ben)發(fa)明(ming)較佳的(de)(de)具體實施方式，但本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)保(bao)護(hu)范(fan)圍并不局限于此(ci)，任何(he)熟悉本(ben)技(ji)術(shu)(shu)(shu)領域的(de)(de)技(ji)術(shu)(shu)(shu)人(ren)員(yuan)在本(ben)發(fa)明(ming)揭露(lu)的(de)(de)技(ji)術(shu)(shu)(shu)范(fan)圍內，根據本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)技(ji)術(shu)(shu)(shu)方案(an)及(ji)其(qi)發(fa)明(ming)構(gou)思加以(yi)等同(tong)替換或改變，都應(ying)涵蓋在本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)保(bao)護(hu)范(fan)圍之內。