專利名稱：靶向釋藥的抗癌蛋白質或多肽聚合物前藥及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種含酸敏感斷裂鍵的聚乙二醇修飾的抗癌蛋白質或多肽及其修飾方法。
背景技術：
中藥及天然藥物抗腫瘤活性成分多且復雜，以往主要聚焦于小分子抗癌化合物，由于蛋白質類生物大分子相對不穩定易降解，容易受溫度、酸堿度等的影響而變性，同時從生物體中分離提取活性蛋白比較復雜費時，對中藥及天然藥物中提取的 生物大分子的研究相對淺薄；隨著生物技術及其相關研究技術的發展，活性蛋白質的研究已經引起了國內外的廣泛關注。因此，從天然藥物中尋找蛋白多肽類活性成分，嘗試從生物大分子的角度揭示中藥及天然藥物作用的物質基礎和機理，將是中藥及天然藥物研究的一個重要方向。目前，大量研究結果表明，從中藥及天然藥物中提取純化的蛋白質具有多種活性，特別是抗腫瘤活性作用明顯，但由于蛋白質類藥物自身的缺點，最終限制了臨床應用。目前還沒有一種抗腫瘤蛋白質上市或進入臨床研究。大分子蛋白質藥物存在諸多缺點，主要表現為1)由于本身為異原性蛋白質，體內給藥易產生免疫原性從而不利于多次給藥。2)由于體內血液系統的蛋白酶的降解作用以及免疫系統的吞噬等作用使得其體內半衰期很短，全身給藥，藥物本身難以達到腫瘤組織。3)天然抗腫瘤蛋白質類活性成分往往為非特異細胞毒性藥物，全身給藥不良反應多。鑒于抗癌蛋白質類活性成分的缺陷，盡管體外顯示一定的抗腫瘤作用，體內給藥達到腫瘤組織濃度極低，若大劑量給藥，必將產生較大的毒副反應。到目前為止，還沒有一個活性成分上市或進入臨床研究。目前主要采用抗體與天然毒素如蓖麻毒素A鏈制成免疫毒素，甚至采用基因重組技術進行人源化，減少異源化蛋白質的免疫源性，開展免疫毒素(蓖麻毒素A鏈-抗體)的臨床腫瘤治療。絕大多數腫瘤內部血管生長迅速不規則，組織血管大量再生，同時腫瘤細胞膜和腫瘤血管內皮細胞膜上一些蛋白質高度表達，構成腫瘤細胞和血管靶向識別的作用靶點，如整合素(ct V ￠3)、核仁素(nucleolin)、表皮生長因子受體(Epidermal Growth FactorReceptor, EGFR)等；血管結構有缺陷，內部淋巴系統消除慢，存在“增強滲透和滯留效應”(Enhanced Permeability and Retention, EPR),使大分子和納米顆粒易滯留到腫瘤內部。另外，腫瘤組織的PH明顯比正常組織和血液低，達到6. 5左右。大多數抗癌藥物對腫瘤靶向性差，有嚴重不良反應(如骨髓抑制、脫發、腹瀉、強烈惡心等)，患者順應性差，甚至終止治療。目前蛋白質類藥物載藥轉運體系有脂質體、納米粒、聚乙二醇修飾等，由于蛋白質類藥物不太穩定且水溶性強，脂質體、納米粒作為載藥轉運體系載藥率不高(一般不超過30% )，目前還沒有全身給藥的蛋白質類脂質體或納米率上市；采用長鏈聚乙二醇共價修飾蛋白質，延長其體內半衰期同時減少其免疫原性，降低蛋白藥物在轉運過程中的降解是聚乙二醇修飾蛋白質的公知技術，目前有較多的聚乙二醇化蛋白質類藥物上市，大大減少
給藥頻率。本人的研究結果也表明采用高分子量的聚乙二醇分別通過硫醚鍵和二巰鍵連接蓖麻毒蛋白A鏈，研究其免疫原性、體內外毒性、抗腫瘤活性和組織分布。結果表明，蓖麻毒蛋白A鏈經聚乙二醇修飾后毒性、免疫原性和抗癌活性均有明顯下降，斷鏈后其免疫原性、毒性和抗腫瘤活性基本可以恢復；體內研究結果顯示，與蓖麻毒蛋白A鏈相比，偶聯物的生物半衰期明顯延長，肝脾等組織攝取率顯著下降，隨時間延長逐漸濃集于腫瘤組織，顯示一定的腫瘤靶向作用。由此可見，蛋白質類藥物可以通過其表面聚乙二醇化，利用高分子量的聚乙二醇等聚合物長鏈分子的空間障礙作用和其強親水性而在其表面形成水分子云的“遮蔽”作用，可以減少其進入體內后免疫原性，減少體內血液系統的蛋白酶的降解作用以及免疫系統的吞噬等作用使得其體內半衰期大大延長。但簡單的共價修飾往往使修飾的蛋白質活性大大下降，而聚乙二醇通過可以斷裂的連接鍵修飾的蛋白質類藥物達到靶組織或細胞后，連 接鍵斷裂，釋放活性藥物，可發揮其抗癌效果，是目前蛋白質或納米粒聚乙二醇化研究的方向。抗癌蛋白質或多肽類，如蓖麻毒素A鏈等表面活性基團有伯氨基和巰基，其中由于賴氨酸引入的伯氨基較多，聚乙二醇修飾蓖麻毒素A鏈伯氨基，可能由于修飾的位點較多且多為隨機修飾，修飾后易造成蛋白質活性的損失和最終產品的不均一。而蓖麻毒素A鏈表面巰基較少，試驗表明，利用蓖麻毒素A鏈表面的巰基進行聚乙二醇化修飾，基本是
I I修飾，故利用巰基作為活性基團進行聚乙二醇化修飾，可以是修飾的終產物的形態和活性均一。盡管聚乙二醇化修飾的蛋白質或多肽類藥物可以減少體內血液系統的蛋白酶的降解作用、降低其免疫原性、延長其體內半衰期大大，最終聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽通過腫瘤EPR作用獲得腫瘤靶向作用，但由于聚乙二醇的長鏈纏繞在抗癌蛋白質或多肽表面，阻礙了抗癌蛋白質或多肽活性位點，降低其抗腫瘤活性。因此利用腫瘤組織與循環系統PH的不同設計在微酸性環境下水解斷裂的化學鍵是目前聚乙二醇修飾蛋白質藥物或納米粒腫瘤靶向給藥體系的研究方向，正常組織，如血液循環系統pH為7. 4左右，而腫瘤組織的PH值偏酸(6. 5以下)，通過長鏈聚乙二醇作用使蛋白質藥物或多肽的體內半衰期延長，利用腫瘤組織EPR作用，被動靶向聚集，在腫瘤組織微酸性環境中，聚合物與抗癌蛋白質藥物或多肽連接鍵腙鍵水解斷裂，釋放活性抗癌蛋白質藥物或多肽，發揮其殺滅腫瘤細胞作用，減少其全身毒副作用。

發明內容
為解決簡單聚乙二醇修飾的問題，本發明提供一種聚乙二醇修飾的抗癌蛋白質藥物或多肽。實現本發明的技術方案是本發明提供的這種聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，是聚合物通過酸敏感斷裂的腙鍵與抗癌蛋白質或多肽偶聯而獲得的靶向釋藥的抗癌蛋白質聚合物前藥。所述的聚合物為水溶性聚合物，如聚乙二醇、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素等，其中優選聚合物為聚乙二醇。所述的抗癌蛋白質或多肽是天然植物提取或動物提取的具有抗癌活性的蛋白質或多肽。所說的腙鍵具有-CO-NH-N =結構，該結構在微酸性條件下逐漸水解斷裂。本發明提供 的聚合物修飾的 抗癌蛋白質或多肽，其聚合物最終是通過巰基或氨基與抗癌蛋白質或多肽偶聯，優選以單鏈或分支鏈的形式與抗癌蛋白質或多肽偶聯。本發明提供的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其抗癌蛋白質或多肽是含有游離巰基或伯氨基的抗癌蛋白質或多肽，優選含單個游離巰基或單個氨基的抗癌蛋白質或多肽，可以是蓖麻毒素a鏈、相思豆毒素a鏈或白喉毒素a鏈。水溶性聚合物通過pH敏感的腙鍵，利用抗癌蛋白質藥物或多肽表面游離的伯氨基或巰基偶聯，構建靶向釋藥的抗癌蛋白質或多肽聚合物前藥。本發明優選的聚乙二醇修飾的蓖麻毒素a鏈具有以下式(I)、式(II)所示結構
O 式(I)
權利要求
1.一種聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，它是聚合物通過酸敏感斷裂的腙鍵與抗癌蛋白質或多肽偶聯而獲得的靶向釋藥的抗癌蛋白質聚合物前藥。
2.根據權利要求I所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質，其特征在于，所述的聚合物為水溶性聚合物。
3.根據權利要求2所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，所述的水溶性聚合物為聚乙二醇、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素。
4.根據權利要求I所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，所述的抗癌蛋白質或多肽為植物提取或動物提取或基因重組或人工合成的具有抗癌活性蛋白質或多肽；所說的腙鍵具有-CO-NH-N =結構，該結構在微酸性條件下逐漸水解斷裂。
5.根據權利要求I所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，聚合物最終是通過巰基或氨基與抗癌蛋白質或多肽偶聯。
6.根據權利要求I所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，聚合物以單鏈或分支鏈的形式與抗癌蛋白質或多肽偶聯。
7.根據權利要求I所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，所述的抗癌蛋白質或多肽是含有游離巰基或伯氨基的抗癌蛋白質或多肽。
8.根據權利要求I所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，所述的抗癌蛋白質或多肽是含單個游離巰基或單個氨基的抗癌蛋白質或多肽。
9.根據權利要求I所述的聚合物修飾的抗癌蛋白質或多肽，其特征在于，所述的抗癌蛋白質或多肽是蓖麻毒素a鏈、相思豆毒素a鏈或白喉毒素a鏈。
10.具有以下式(I)或式(II)結構聚乙二醇修飾的蓖麻毒素a鏈
11.聚乙二醇修飾的蓖麻毒素a鏈的制備方法，包括以下步驟 (1)活性末端基團為馬來酰亞胺并含有腙鍵連接鍵的聚乙二醇的合成mPEG-CHO(mPEG10KD-butyraldehyde)聚乙二醇與雙功能交聯劑([N-e-Maleimidocaproicacid]hydrazide, EMCH)的酰肼鍵進行氨醒縮合反應,純化； (2)靶向釋藥的聚合物修飾的蓖麻毒素a鏈的合成將步驟⑴獲得的聚乙二醇與含游離巰基的蓖麻毒素a鏈偶聯，純化，得到靶向釋藥的聚合物修飾的蓖麻毒素a鏈前藥。
全文摘要
本發明涉及一種聚乙二醇修飾的抗癌蛋白質及其制備方法，抗癌蛋白質通過自身的巰基與聚乙二醇衍生物長鏈共價結合，且聚乙二醇衍生物是通過mPEG-CHO與雙功能交聯劑([N-e-Maleimidocaproic acid]hydrazide，EMCH)的一端形成腙鍵，另一端與抗癌蛋白質的巰基偶聯，合成靶向釋藥的抗癌蛋白質聚合物前藥。
文檔編號A61K47/48GK102652836SQ201110050930
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月3日 優先權日2011年3月3日
發明者衛樂樂, 方凱, 舒成仁, 黎維勇 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院