一種源于極端抗鹽堿曲霉的纖維素酶基因及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物工程和酶工程技術領域，具體涉及一種纖維素酶及其編碼基因、含 有編碼基因的重組載體、基因工程菌株以及其生物學活性和應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素酶是一種高活性生物催化劑，是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總 稱，包括三類酶，即外切B-1，4-葡聚糖苷酶（簡稱CBH)、內切B-1，4-葡聚糖苷酶（簡稱EG) 和B-1，4-葡萄糖苷酶（簡稱BG)，在這3種酶的協同作用下，纖維素最終被分解成葡萄糖。
[0003] 纖維素類物質是自然界中最豐富的一種可再生資源。生物資源是可再生性資源， 地球上每年光合作用的產物高達1. 5X10n_2.OX10nt，是人類社會賴以生存的基本物質 來源，其中90%以上為木質纖維素類物質，其中的纖維素是地球上最豐富的多糖物質，這類 物質是植物細胞壁的主要成分。據報道，我國的纖維素類資源極為豐富，僅秸桿和皮殼每年 可達7X10s噸。但是這些物質的利用率卻很低，多采用燃燒的方法處理，這樣不僅造成了 環境污染，也是資源和能源的巨大浪費。隨著世界人口迅速增長、糧食、礦產資源日漸枯竭， 開發高效轉化木質纖維素類可再生資源的微生物技術，利用工農業廢棄物等發酵生產人類 急需的燃料、飼料及化工產品，即化工原料綠色化，具有極其重大的現實意義和光明的發展 前景。
[0004] 自從纖維素酶被人類認識和利用以來，在食品、飼料、釀酒、紡織、中藥提取和造紙 等眾多的工業領域都有著廣泛的應用價值。當前，人們在研究纖維素酶過程中認識到，提高 酶產量、活力和穩定性，將在應用中顯現巨大的優勢。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種酶活力高和穩定性強的纖維素酶，及其編碼基因、重組 載體、基因工程菌株及其應用。
[0006] 本發明采用的技術方案如下：
[0007] 本發明從極端抗鹽堿曲霉CCHA獲得一種纖維素酶基因的全長cDNA，命名為 CCHA333〇
[0008] 該基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，該基因序列長度為1509bp，編碼502個 氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發 現屬于糖苷水解酶第5家族，該酶含有一個纖維素結合位點。
[0009] 構建含有纖維素酶基因CCHA333序列的重組表達質粒載體pPIC9K-CCHA333,利用 電轉儀進行電擊轉化PIChiapastoriSGsll5,在MD和MM培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽 性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母重組基因工程菌 株GS115-pPIC9K-CCHA333。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C、200rpm/min搖床 培養2d后，以5:1比例濃縮轉接于BMMY培養基中，在25°C、200rpm/min搖床培養誘導表達 2d后，纖維素酶產量達0. 2mg/ml。本發明的纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉實驗中，最適pH 值為6,最適酶反應溫度為55°C。酶在pH范圍4-12,溫度80°C加熱2h，酶活性能保持50% 以上，具有較高的熱穩定性。在眾多金屬離子存在環境下，酶活性明顯提高，在ImMCo2+和 Cu2+濃度環境下，酶活性提高分別為1. 95倍和1. 53倍，在500mMNa2+濃度環境下酶活性提 高2. 15倍。在分解玉米秸桿的試驗中，每0. 05g玉米秸桿粉可產生0. 253mg葡萄糖。
[0010] 通過構建重組載體并在畢赤酵母中超量表達的產物具有高效的水解羧甲基纖維 素鈉和玉米秸桿的功能，本發明的纖維素酶及其編碼基因在纖維素降解中可廣泛應用。
【附圖說明】
[0011] 圖1為纖維素酶SDS-PAGE凝膠電泳圖
[0012] 圖2為纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉的最適酶反應溫度示意圖
[0013] 圖3為纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉的最適pH值的測定結果示意圖
[0014] 圖4為纖維素酶熱穩定性的測定結果示意圖
[0015] 圖5為纖維素酶pH穩定性的測定結果示意圖
[0016] 圖6為纖維素酶在不同金屬離子環境下酶活性的測定結果示意圖
[0017] 圖7為纖維素酶在NaCl環境下酶活性的測定結果示意圖
[0018] 圖8為纖維素酶在Co2+環境下酶活性的測定結果示意圖
[0019] 圖9為纖維素酶水解玉米秸桿前后葡萄糖產量測定結果示意圖
【具體實施方式】
[0020] 實施例1:極端耐鹽曲霉CCHA的cDNA合成
[0021] (1)極端耐鹽曲霉CCHA總RNA的提取：參照TriZol試劑盒說明。
[0022] (2)cDNA鏈的合成：按照Takara公司的TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver3. 0 試劑盒說 明書進行：取l_2yg總RNA，加RnaseFreeddH20至9. 5yL，將RNA樣品在75°C變性5min， 立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分：10mmol/L dNTPMixture2yL, 10XRTBuffer(Mg2+) 2μL, 25mmol/LMgcl24μL, 01igod(T)-Adaptor PrimerlμL，RnaseInhibiter0. 5μL,AMVReverseTranseriptase1μL(FinalVolume 20μL)，將反應液混合后，室溫下放10min，然后42°C溫育60min，再煮沸5min以滅活反轉錄 酶。加入180yLDEPC處理的ddH20,稀釋至200yL，混勾，稍微離心，-20°C保存，備用。
[0023] 實施例2:纖維素酶基因CCHA333的克隆與表達載體的構建
[0024] (1)引物設計：根據纖維素酶基因同源序列的保守區，結合所用載體設計引物，在 引物的5'端分別引入EcoRI和NotI酶切位點（下劃線部分）：
[0025]上游引物：5' -CCGGAATTCATGAGATTCACCAGTTTG(SEQIDNO. 3)
[0026]下游引物：5'-TTGCGGCCGCAATCACTGGCACTGT(SEQIDNO. 4)
[0027] (3)PCR擴增：以極端耐鹽曲霉CCHAcDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系 (25μL)如下：
[0028] 10XExTagBuffer2. 5μL，2. 5mmol/L的dNTPsmixture1μL，10μmol/L的上 下游引物各1μL，ExTagDNA擴增酶0. 5μL，模板10-100ng，無菌去離子水18μL。PCR擴 增條件：94°C預變性 3min;94°C30s，50°C30s，72°C90s，共 30 個循環；72°C再延伸 10min。 利用PCR產物純化試劑盒進行純化。
[0029] (4)表達載體的構建：純化后的PCR產物連接到pMD_18TVector，轉化E.coli DH5α感受態細胞，PCR篩選陽性重組質粒并測序。利用EcoRI和NotI將目的基因和 PPIC9K載體分別雙酶切后進行連接，連接產物轉化E.coliDH5a感受態細胞，PCR篩選陽 性重組質粒并提取重組質粒。經酶切驗證的重組質粒（PPIC9K-CCHA333)測序確認表達載 體構建正確。
[0030] 實施例3:表達纖維素酶基因CCHA333的酵母工程菌株的構建、篩選與誘導表達
[0031] (1)重組表達質粒的線性化：將重組表達質粒PPIC9K-CCHA333用限制性內切酶 SalI線性化。
[0032] (2)轉化：電擊轉化酵母菌株PichiapastoriSGS115酵母感受態細胞，轉化方法參 見工nvitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
[0033] (3)篩選：用滅菌牙簽挑取轉化子對應點種在MM和MD平板上，30°C培養2-4d，挑 取在MD/MM平板上均生長良好的轉化子為陽性轉化子。挑取陽性轉化子分別點種于lmg/ mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mLG418的YPD平板上篩選多拷貝轉化子。
[0034] (4)誘導表達：工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C、200rpm/min搖床培養 2d后，以5:1比例濃縮轉接于BMMY培養基中，在25°C、200rpm/min搖床培養誘導表達2d， 每12h補充甲醇終濃度為1%，每12h取樣，12000rmp/min離心5min，取上清進行SDS-PAGE 凝膠電泳分析。
[0035] 實施例4:纖維素酶活性測定
[0036] (1)沒活力單位的定義：lmL液體酶在最適酶反應條件下，每分鐘水解羧甲基纖維 素鈉產生1μg葡萄糖，為一個酶活力單位（U/mL)。
[0037] (2)酶活性測定方法：酶活性測定采用DNS法，蛋白含量測定采用Bradford法。
[0038] (3)纖維素酶的最適反應溫度、最適pH及熱穩定性和pH的測定：誘導表達的纖維 素酶經過DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的纖維素 酶測定其性質。分別在20-90°C，梯度為10°C的溫度和pH3-11，梯度為1的pH條件下測定 纖維素酶的酶活力。將纖維素酶在不同的溫度（60°C和80°C)下保溫不同的時間（lh，2h， 3h，4h)后和在不同pH(3-12)緩沖液下4°C放置12h后，分別測定剩余酶活力。
[0039] (4)纖維素酶在不同金屬離子中酶活力的測定：分別在終濃度為lmmol的Co2+、 Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg'Mn2+、Ba2+、Ni2+、EDTA中測定纖維素酶的酶活力。分別在不同Co2+離子 濃度和不用Na+離子濃下測定纖維素酶的酶活力。
[0040] 實施例5:纖維素酶水解玉米秸桿的應用
[0041] (1)玉米秸桿樣本的制備：將粉碎過的玉米秸桿用蒸餾水沖洗干凈，加入1. 0%的 稀硫酸，于120 °C下保溫2h。取出后過濾至濾出液呈中性，將玉米秸桿殘渣于75 °C下烘24h， 待試樣品。
[0042] 纖維素酶水解玉米秸桿：取0. 05g待試樣品放入400μL的pH為5的緩沖液中，加 入100μL的纖維素酶液，在纖維素酶的最適溫度條件下進行反應30min。對照取0. 05g待 試樣品放入400μL的pH為5的緩沖液中，加入100μL的蒸餾水，在纖維素酶的最適溫度 條件下進行反應30min。反應完畢，將水解物過濾，測定濾出液中還原糖的含量。
[0043]


【主權項】
1. 一種纖維素酶基因CCHA333,其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 按權利要求1所述的纖維素酶基因CCHA333,其特征在于所述纖維素酶基因CCHA333 的編碼序列如SEQIDNO. 2所示。3. -種重組載體，以及重組載體轉化得到的重組基因工程菌，其特征在于含有權利要 求2所述的纖維素酶基因CCHA333的編碼序列。4. 一種權利要求1所述的纖維素酶基因CCHA333的應用，其特征在于作為水解羧甲基 纖維素鈉的酶動力學特性鑒定。5. 權利要求1所述的纖維素酶基因CCHA333在纖維素降解中的應用。
【專利摘要】一種源于極端抗鹽堿曲霉的纖維素酶基因及應用屬生物工程和酶工程技術領域，本發明公開的纖維素酶基因CCHA333的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；纖維素酶基因CCHA333的編碼序列如SEQ？ID？NO.2所示；纖維素酶基因CCHA333可在水解羧甲基纖維素鈉的酶動力學特性鑒定中應用；纖維素酶最適pH值為6，最適酶反應溫度為55℃，在pH范圍4-12，溫度80℃加熱2h，酶活性能保持50％以上。在眾多金屬離子存在環境下，酶活性明顯提高，如Cu2+，Co2+和Na2+。通過構建重組載體并在畢赤酵母中超量表達的產物具有高效的水解羧甲基纖維素鈉和玉米秸稈的功能，本發明的纖維素酶及其編碼基因可廣泛應用于纖維素降解。CGMCC602520120420
【IPC分類】C12P19/14, C12N1/19, C12N9/42, C12R1/84, C12N15/81, C12N15/56
【公開號】CN105420259
【申請號】CN201610005024
【發明人】張世宏, 李正群, 魏毅, 陳麗娜, 劉少帥, 周曉陽, 宋妍悅, 裴雪
【申請人】吉林大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月6日