用于篩選抗癌癥醫藥組合物的多肽分子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供至少一種多肽分子，用于檢測樣品中之三磷酸腺苷結合盒運輸蛋白抗體含量，進而篩選出富含三磷酸腺苷結合盒運輸蛋白抗體之樣品，作為毒殺抗藥性癌細胞之抗癌癥醫藥組合物。
【專利說明】用于篩選抗癌癥醫藥組合物的多化分子及其應用 【【技術領域】】
[0001] 本發明系關于一種用于篩選抗癌癥醫藥組合物之多膚分子及其應用，特別 是關于一種用于篩選H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白抗體（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)之多膚分子及其應用。 【【背景技術】】
[0002] 化學治療是中晚期癌癥的主要治療方法。一般而言，癌癥病人在經過一段時間的 化學治療后，雖然大多數的癌細胞都會死亡，但仍有少數未被毒殺成功的癌細胞會留存在 體內，數量約在1爐?1〇 9之間。該些留存的癌細胞會表現大量的H磯酸腺巧結合盒運輸蛋 白（ATP binding-cassette transporter, W下簡稱ABC運輸蛋白），并將ABC運輸蛋白運 送到細胞膜上，W執行排除細胞內化學治療藥物的工作。亦即，留存的癌細胞會利用ABC運 輸蛋白將癌細胞內的化學治療藥物轉移到細胞外，因此，化學治療藥物不再能有效攻擊該 些留存的癌細胞。此即臨床上所謂的癌細胞抗藥性。亟待找尋化學治療W外的方法毒殺該 些具有抗藥性的癌細胞。
[0003] 獻 Sarkadi B. Homolva L.Szakdcs G.Vdradi A. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters:participation in a chemoimmunity defense system. Physiol Rev. 2006, 86 (4) : 1179-1236中提及與癌細胞抗藥性有關的ABC運輸蛋白，主要包 括下列亞家族：
[0004] H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白亞家族B(ATP-binding cassette protein subfamily B) ;例如ABCBl,又稱為多重抗藥性蛋白1 (multi化ug resistance protein 1，簡稱MDRl), 亦稱為P醋蛋白（perme油ility glycoprotein);又例如ABCB4(又稱為MDR3);另外還有例 如ABCBll，系P甜的同系家族（Sister of P甜）。
[0005] H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白亞家族C(ATP-binding cassette protein subfamily C) ;例如ABCCl,又稱為多重抗藥性相關蛋白1 (multi化ug resistance related protein 1，簡稱MRPl);又例如ABCC2,又稱為多重抗藥性相關蛋白2(multi化ug resistance related protein 2,簡稱 MRP2);可能還包括 ABCC3-6、ABCCIO-11。
[0006] H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白亞家族G(ATP-binding cassette protein subfamily G):例如ABCG2,又稱為雙輕意釀抗藥性蛋白（mitoxantrone resistance protein,簡稱 MXR),亦稱為乳癌抗藥性蛋白化reast cancer resistance protein,簡稱 BCRP)。
[0007] 美國專利US7785812描述了一種毒殺抗藥性癌細胞的方法，系利用表現在抗藥 性癌細胞表面的大量ABC運輸蛋白進行標祀攻擊。其W人為方式制造ABC運輸蛋白抗體 (anti-ATP binding-cassette transporter antibody),且利用該 ABC 運輸蛋白抗體攜帶 足W毒殺細胞之藥物，形成一抗體標祀藥物。則，該抗體標祀藥物藉由ABC運輸蛋白抗體而 結合在抗藥性癌細胞上，并W其所攜帶的藥物在抗藥性癌細胞周圍進行毒殺作用。
[000引然而，無論是直接制備ABC運輸蛋白抗體或是先制備ABC運輸蛋白后再用W篩選 ABC運輸蛋白抗體，其中制備ABC運輸蛋白抗體/ABC運輸蛋白的過程都必需考慮其是否能 被折疊成正確構型，制備中要考慮的因素困難且復雜，使成本難w降低。此外，依現有技術 所制造出的ABC運輸蛋白抗體，僅能辨識單一種ABC運輸蛋白，難W適用于所有種類的抗藥 性癌細胞。再者，現有技術利用藥物對抗藥性癌細胞進行毒殺，長期下來，將對身體及腎臟 造成不小的負擔。 【
【發明內容】
】
[0009] 有鑒于現有技術的缺陷，本發明提供一種制程簡單之多膚分子，W取代結構復雜 之ABC運輸蛋白，作為篩選ABC運輸蛋白抗體之主要依據。
[0010] 另外，本發明提供多種多膚分子及其組合，使能篩選出含有多種ABC運輸蛋白抗 體之醫藥組合物，而能適用于各種不同種類的抗藥性癌細胞。
[0011] 本發明亦提供一種對身體及腎臟負擔較小的癌癥醫藥組合物，W對抗抗藥性癌細 胞。
[0012] 本發明再提供一種癌癥醫藥組合物，可提升自然殺手細胞毒殺癌細胞之整體能 力。
[0013] 本發明更提供一種癌癥醫藥組合物，可解決抗藥性癌細胞的抗藥性問題，進而與 化學治療藥物發生協同作用，抑制抗藥性癌細胞之數量。
[0014] 于一較佳實施例中，本發明提供一種多膚分子，該多膚分子之氨基酸序列包含SEQ ID N0;1 序列、SEQ ID N0;2 序列、SEQ ID N0;3 序列、SEQ ID N0;4 序列、SEQ ID N0;5 序 列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或其組合。
[0015] 于一較佳實施例中，該多膚分子可與至少一種H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白之抗體 (anti-ATP binding-cassette transporter antibody)結合。
[0016] 本發明亦提供一種多膚分子之用途，用于篩選出一癌癥醫藥組合物，其中該多膚 分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO ;1序列、SEQ ID NO ;2序列、SEQ ID NO ;3序列、SEQ ID NO ;4序列、SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或 其組合。
[0017] 于一較佳實施例中，用于從分離自人體之一血液、一血漿、或一血清中篩選出該癌 癥醫藥組合物。
[0018] 于一較佳實施例中，該癌癥醫藥組合物中包含至少一種H磯酸腺巧結合盒運輸蛋 白之抗體。
[0019] 于一較佳實施例中，該癌癥醫藥組合物可提升自然殺手細胞毒殺癌細胞之效果。
[0020] 于一較佳實施例中，該癌癥醫藥組合物能與化學治療藥物發生協同作用，抑制抗 藥性癌細胞之數量。
[0021] 本發明另外提供一種分離（或純化）之抗體或人工生產之抗體，可與如下所述之 多膚分子結合：
[0022] 包含 SEQ ID NO ;1 序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序 列、SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或其組合 之多膚分子。
[0023] 于一較佳實施例中，可提升自然殺手細胞毒殺癌細胞之效果。
[0024] 于一較佳實施例中，可與化學治療藥物發生協同作用，抑制抗藥性癌細胞之數量。
[00巧]本發明更提供一種檢測套組，用W檢測樣品中之H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白之抗 體（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)含量；該檢測套組中包含一多膚 分子，且該多膚分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO ;1序列、SEQ ID NO ;2序列、SEQ ID NO : 3 序列、SEQ ID N0;4 序列、SEQ ID N0;5 序列、SEQ ID N0;6 序列、W及 SEQ ID N0;7 序列 中之至少一者或其組合。
[0026] 于一較佳實施例中，本發明提供一種檢測方法，系W-多膚分子作為一探針， 檢測一樣品中之H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白之抗體（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)含量，其中該多膚分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO ;1序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序列、SEQ ID NO ;5 序列、SEQ ID NO ;6 序 列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或其組合。
[0027] 于一較佳實施例中，系利用酵素免疫吸附法、西方墨點法、生物芯片法、磁珠分離 暨定量方式、W及其他探針檢測方式之至少一者，檢測該樣本中之H磯酸腺巧結合盒運輸 蛋白之抗體含量。
[0028] 于一較佳實施例中，其至少包括下列步驟：
[0029] 涂覆（coating)該多膚分子至一容器中；
[0030] 去除該容器中之一第一息浮液；
[0031] 置入該樣品之一適當濃度樣本至該容器中；
[0032] 去除該容器中之一第二息浮液；
[0033] 置入一第二抗體；
[0034] 去除該容器中之一第H息浮液；W及 [00巧]檢測該容器中之該第二抗體之含量。
[0036] 于一較佳實施例中，該容器系96孔盤。
[0037] 于一較佳實施例中，該樣品系分離自人體之一血液、一血漿或一血清中之至少一 者。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0038] 圖1 ;系一方塊流程圖，表示出本申請檢測ABC運輸蛋白抗體含量之一方法實施 例。
[0039] 圖2 ;系癌癥醫藥血漿對癌細胞抗藥性之影響之直方圖。
[0040] 圖3 ;系癌癥醫藥血漿對自然殺手細胞毒殺癌細胞之影響之直方圖。
[0041] 圖4;系一方塊流程圖，表示出利用本申請多膚分子純化ABC運輸蛋白抗體之一方 法實施例。 【【具體實施方式】】
[0042] 鑒于現有技術的限制及缺陷，本發明提供至少一種篩選癌癥醫藥組合物之多膚分 子及其應用方法，系W構型簡單的多膚分子篩選富含抗體的醫藥組合物，并利用該醫藥組 合物達到毒殺抗藥性癌細胞的效果。
[0043] 已知自然殺手細胞（化化ral killer cells ;通常被定義為CD3-CD56+亞群的淋己 細胞）在人類免疫系統上扮演對抗癌細胞的重要角色，主要系通過抗體依賴性細胞介導的 細胞毒殺作用（antibody-cbpendent cell-mediated c}ftotoxicity，簡稱 ADCC)殺死癌細 胞。詳言之，當癌細胞表現ABC運輸蛋白（因而具有抗藥性），而被身體內或外來的ABC運 輸蛋白抗體結合時，自然殺手細胞表面的CD16分子【化濁III ;系抗體恒定區（化agment of constant region)之受體，會專一'f生結合于所有人類抗體之恒定區】會辨識并與該ABC運 輸蛋白抗體的恒定區（例如IgG抗體的恒定區）結合，繼而引發自然殺手細胞之抗體依賴 性細胞介導的細胞毒殺作用（W下簡稱ADCC作用），釋放丙型干擾素（IFN-y)等細胞因子 來毒殺該抗藥性癌細胞。
[0044] 依發明人多年之經驗及研究結果，認為應能揃取現有技術W ABC運輸蛋白為標祀 之優點，去除需制備構型復雜之抗體/蛋白質W及需利用藥物毒殺等兩種缺點，發展出一 種更簡便、對身體負擔較小之毒殺抗藥性癌細胞的方法。亦即，研發一種線性多膚抗原，W 篩選含有多種ABC運輸蛋白抗體之醫藥組合物。該醫藥組合物中的ABC運輸蛋白抗體會與 抗藥性癌細胞表面的ABC運輸蛋白結合，形成標祀，且該ABC運輸蛋白抗體能引發自然殺手 細胞之ADCC作用，使自然殺手細胞毒殺該些抗藥性癌細胞。此外，發明人認為若線性多膚 抗原設計得當，所篩選出的醫藥組合物中之ABC運輸蛋白抗體應能同時阻斷ABC運輸蛋白 之功能，抑制抗藥性癌細胞將化學治療藥物轉移到胞外，進而解決抗藥性癌細胞的抗藥性 問題。
[0045] W下系提供利用本發明之實施例之詳細說明書，W及本發明之技術及特點。然本 實施例并非用W限定本發明，任何熟悉此技術者，在不脫離本發明之精神和范圍內所完成 之各種更動或潤飾，均應包含于本申請之申請專利范圍內。
[004引實驗一；ABC運輸蛋白線性多膚分子的設計
[0047] 利用生物信息學方法，從各種ABC運輸蛋白（指能引發化學治療抗藥性的ABC運 輸蛋白）序列中，找尋與人類白血球抗原化uman leukocyte antigen,簡稱HLA;即人類之 Major histocompatibility complex,簡稱MHC)有較高親和力的序列位置。W此方法找出 的線性多膚序列較可能剛好位于ABC運輸蛋白表面，而能取代ABC運輸蛋白，專一性地與 ABC運輸蛋白抗體結合。
[0048] 經過一系列地設計改良及實驗篩選，研發出7種ABC運輸蛋白線性多膚分子（多 膚分子一般由20?50個氨基酸組成，但不W此為限），即SEQ ID N0;1、SEQ ID N0;2、 沈Q ID N0;3、沈Q ID N0;4、沈Q ID N0;5、沈Q ID N0;6、W及沈Q ID N0;7。此 7 種 ABC運輸蛋白線性多膚分子或其組合，均可與至少一種ABC運輸蛋白之抗體（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)結合，而能篩選出癌癥醫藥組合物。尤其，此 7種ABC運輸蛋白線性多膚分子或其組合，均與至少一種引發癌癥化學治療藥物抗藥性之 ABC運輸蛋白之抗原表位（epitope)構型相似，因此可和該些引發化學治療藥物抗藥性之 ABC運輸蛋白之抗體結合，W篩選出能對抗抗藥性癌細胞之癌癥醫藥組合物。
[0049] 其中，該些ABC運輸蛋白線性多膚分子與該至少一種ABC運輸蛋白之抗體間的結 合力，大于磯酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,簡稱PBS;pH 7. 4)與該至少一種 ABC運輸蛋白之抗體間的結合力。
[0050] 實驗二：制備ABC運輸蛋白線性多膚分子
[0051] W化學法合成該些ABC運輸蛋白線性多膚分子，純度須大于95%。可委巧勝膚 合成服務公司合成該些ABC運輸蛋白線性多膚分子。 申請人:系委巧明欣生物科技有限公 司（地址；臺北市南港區園區街3號10樓之1 ;電話；02-26557128 ;網址；//www. missionbio. com. tw/)制備該7種ABC運輸蛋白線性多膚分子。
[005引將合成的ABC運輸蛋白線性多膚分子溶于67%的己酸中巧mg線性多膚分子/I血 之67%己酸），于-2(TC之低溫冰箱中保存。
[0053] 實驗H ;篩選癌癥醫藥組合物
[0054] 將上述7種ABC運輸蛋白線性多膚分子之至少一種與樣品（例如分離自人體之一 血液、一血漿、或一血清中之至少一者）混合，檢測樣品中ABC運輸蛋白線性多膚分子-ABC 運輸蛋白抗體復合物下簡稱多膚分子-抗體復合物）之含量。多膚分子-抗體復合物含 量較多者，代表原樣品中含有大量ABC運輸蛋白之抗體，可作為癌癥醫藥組合物，W引發自 然殺手細胞之抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，殺死表現ABC運輸蛋白之抗藥性癌細胞。
[0055] 其中，可利用酵素免疫吸附法巧nzyme-linked immunosorbent assay,簡稱 ELISA)或其他利用多膚分子為探針之檢測方式（例如西方墨點法、生物芯片法、磁珠分離 暨定量方式），檢測樣品中ABC運輸蛋白抗體之含量，W篩選適合作為癌癥醫藥組合物之 樣品，尤指含有至少一種引發癌癥化學治療抗藥性之ABC運輸蛋白之抗體的癌癥醫藥組合 物。W下W酵素免疫吸附法為例進行詳細說明：
[0056] 請參閱圖1，其系一方塊流程圖，表示出本申請檢測ABC運輸蛋白抗體含量之一方 法實施例。本發明一種檢測ABC運輸蛋白抗體含量的較佳實施方法至少包括：
[0057] 步驟S1 ;涂覆多膚分子至一容器中；
[0058] 步驟S2 ;去除該容器中之一第一息浮液；
[0059] 步驟S3 ;置入一樣品之一適當濃度樣本至該容器中；
[0060] 步驟S4 ;去除該容器中的一第二息浮液；
[006U 步驟S5 ;置入一第二抗體；
[006引步驟S6 ;去除該容器中的一第立息浮液；W及
[0063] 步驟S7 ;檢測該容器中之該第二抗體之含量。
[0064] 于本較佳實施例中，步驟S1中之該容器，系96孔盤。步驟S1系在96孔盤的一第 一孔及一第二孔中，加入100 y L之ABC運輸蛋白線性多膚分子，并在96孔盤的一第H孔及 一第四孔中，加入100 y L之植物性蛋白多膚分子，4C涂覆8小時（或過夜）。
[006引其中，該ABC運輸蛋白線性多膚分子及該植物性蛋白多膚分子已先W磯酸鹽緩沖 液（Phosphate Buffered Saline,簡稱 PBS;抑 7. 4)稀釋至 5 ?20 yg/mL。且該 ABC 運輸 蛋白線性多膚分子系 SEQ ID N0;1、SEQ ID N0;2、SEQ ID N0;3、SEQ ID N0;4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID N0;6、W及SEQ ID N0;7 W等比例混合所得。
[0066] W涂覆ABC運輸蛋白線性多膚分子之該第一孔為實驗組，涂覆植物性多膚分子之 該第H孔為對照組，涂覆ABC運輸蛋白線性多膚分子之該第二孔為第一空白對照組，涂覆 植物性多膚分子之該第四孔為第二空白對照組。
[0067] 再則，步驟S2系去除該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第一息浮液。較佳者， 去除第一息浮液后，再W磯酸鹽緩沖液（pH 7.4)清洗H次。
[006引此外，步驟S3中之該樣品系分離自人體之一血漿（亦可置換為一血液、一血清，但 不W此為限）。該適當濃度樣本系該血漿（或該血液、該血清，但不W此為限）經磯酸鹽緩 沖液（pH 7. 4)稀釋100?200倍后所制成。步驟S3中，系于該第一孔及該第H孔中加入 100 y L該適當濃度樣本，該第二孔及該第四孔中則加入100 y L磯酸鹽緩沖液（pH 7. 4)，并 于適當溫度下作用一段時間。較佳者，于室溫作用2小時。
[0069] 步驟S4系去除該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第二息浮液。較佳者，去除 第二息浮液后，再W磯酸鹽緩沖液（pH 7.4)清洗H次。
[0070] 步驟S5中的該第二抗體系可與人類ABC運輸蛋白抗體專一性結合之抗體，例如兔 抗人免疫球蛋白 G 抗體(Anti-Human IgG (Fc speci円c) antibody produced in rabbit)或 山羊抗人免疫球蛋白 G抗體(Anti-Human IgG (Fc speci円c) antibody produced in goat)。 步驟S5中，系加入例如200 y L適當濃度之該第二抗體（例如W磯酸鹽緩沖液（pH 7. 4)稀 釋10000倍），并于適當溫度下作用一段時間。較佳者，于室溫作用2小時。
[0071] 步驟S6系去除該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第H息浮液。較佳者，去除 第H息浮液后，再W磯酸鹽緩沖液（pH 7.4)清洗H次至五次。
[0072] 步驟S7之檢測原理，系利用該第二抗體攜帶的一酵素，將一化合物轉換為一 呈色化合物，則該第二抗體之含量與該酵素的量及呈色深淺呈正比，可藉由檢測顏色深 淺而回推該第二抗體之含量。較佳者，該第二抗體攜帶的該酵素，可將四甲基聯苯胺 (Tetramethy化enzidine，簡稱TMB)轉換為藍色產物。或是，步驟S7之檢測原理，系利用該 第二抗體攜帶的一英光物質進行檢測，藉由檢測英光強度而回推該第二抗體的含量。
[0073] 于本較佳實施例中，步驟S7之具體步驟系于該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中 加入lOOuL TMB，反應20分鐘，再加入50yL 2M H2SO4終止反應。W 450nm為檢測波長， 630皿為參考波長，測定吸光值（0D值），并計算特異性結合指數（specific binding index, 簡稱SBI):
[0074] SBI =(實驗組之吸光值一第一空白對照組之吸光值）/(對照組之吸光值一第二 空白對照組之吸光值）
[00巧]W SBI作為篩選樣品（例如分離自人體之一血液、一血漿、或一血清之至少一者， 但不W此為限）之參考數值，凡是比值大于1. 5者，可作為治療癌癥的癌癥醫藥組合物，用 于引導自然殺手細胞之「抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用（即ADCC作用）」。所述癌 癥醫藥組合物中，SBI值大于1. 5的血液，稱為癌癥醫藥血液；SBI值大于1. 5的血漿，稱為 癌癥醫藥血漿；SBI值大于1. 5的血清，稱為癌癥醫藥血清。
[0076] 實驗四；測試癌癥醫藥組合物之效果
[0077] (一）篩選具有化學治療藥物抗藥性的癌細胞株
[007引 在24孔盤（24well)中種入MCF-7乳癌細胞株，細胞濃度為SXloVmL。加入lOOnM 雙輕意釀（即Mitoxantrone，為一種化學治療藥物；可購自美國Sigma-Al化ich公司，產品 名稱為Mitoxantrone dihy化ochloride)繼代培養一個月，存活之細胞即為具有雙輕意釀 抗藥性之MCF-7乳癌細胞。
[0079] (二）癌癥醫藥組合物對癌細胞抗藥性之影響
[0080] 在96孔盤巧Swell)中種入具有雙輕意釀抗藥性之MCF-7乳癌細胞，使每孔中含 有5000個細胞。對照組中添加lOOnM雙輕意釀培養。實驗組中添加lOOnM雙輕意釀W及 5%癌癥醫藥血漿（將5 y L癌癥醫藥血漿加入95 y L細胞液中），共同培養。于培養24、48、 72小時后，W MTT生物活性分析法（MTT assay)檢測并計算細胞存活率。
[0081] 其中，用于篩選該癌癥醫藥血漿之ABC運輸蛋白線性多膚分子包含本案7種ABC 運輸蛋白線性多膚分子。亦即，將氨基酸序列為SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及 SEQ ID N0;7 之走種 ABC 運輸蛋白線性 多膚分子，W等比例混合，得到ABC運輸蛋白線性多膚分子混合物。再利用ABC運輸蛋白線 性多膚分子混合物篩選出SBI值大于1. 5的血漿，獲得該癌癥醫藥血漿。
[0082] 請參閱圖2,為癌癥醫藥血漿對癌細胞抗藥性之影響之直方圖。圖2中，左側組 別是添加雙輕意釀之對照組，右側組別則是添加雙輕意釀及癌癥醫藥血漿共同培養之實驗 組。對照組細胞經培養1天、2天、3后，細胞數量分別達到6. 4X 103個細胞/孔、9. 4X 1〇3 個細胞/孔、12. 9 X 103個細胞/孔。實驗組細胞經培養1天、2天、3天后，細胞數量分別達 到4. 0X 1〇3個細胞/孔、4. 8X 1〇3個細胞/孔、6. 2X 1〇3個細胞/孔，與培養同樣時間長度 的對照組之間均具有顯著差異（P<〇. 001)。
[0083] 圖2顯示癌癥醫藥血漿能抑制具有雙輕意釀抗藥性之MCF-7乳癌細胞生長，且抑 制效果隨作用時間長度而增加。其中，W癌癥醫藥血漿作用1天后之抑制比例達37. 5%，作 用2天后之抑制比例達48. 9%，作用3天后之抑制比例達51.9%。
[0084] 據此，W本發明7種ABC運輸蛋白線性多膚分子所篩選出的癌癥醫藥血漿，具有高 濃度ABC運輸蛋白抗體，能夠與抗藥性癌細胞表面的ABC運輸蛋白結合，進而阻斷抗藥性癌 細胞將化學治療藥物轉移到胞外的路徑，使化學治療藥物能繼續發揮抑制癌細胞生長的效 果。因此，利用本發明7種ABC運輸蛋白線性多膚分子所篩選出的癌癥醫藥組合物，有助于 解決抗藥性癌細胞的抗藥性問題，而能與化學治療藥物發生協同作用，顯著抑制抗藥性癌 細胞之數量。
[0085] (H)癌癥醫藥組合物對自然殺手細胞毒殺癌細胞之影響
[008引在96孔盤巧Swell)中種入具有雙輕意釀抗藥性之MCF-7乳癌細胞，使每孔中含 有5000個細胞。對照組中，每孔添加2X104個自然殺手細胞共同培養。實驗組中，每孔添 加2 X 104個自然殺手細胞W及5 %癌癥醫藥血漿（將5 y L癌癥醫藥血漿加入95 y L混合 細胞液中），共同培養。于培養24、48、72小時后，WMIT生物活性分析法（MTT assay)檢測 并計算MCF-7乳癌細胞之存活率。
[0087] 其中，用于篩選該癌癥醫藥血漿之ABC運輸蛋白線性多膚分子包含本案7種ABC 運輸蛋白線性多膚分子。亦即，將氨基酸序列為SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及 SEQ ID N0;7 之走種 ABC 運輸蛋白線性 多膚分子，W等比例混合，得到ABC運輸蛋白線性多膚分子混合物。再利用ABC運輸蛋白線 性多膚分子混合物篩選出SBI值大于1. 5的血漿，獲得該癌癥醫藥血漿。
[0088] 請參閱圖3,為癌癥醫藥血漿對自然殺手細胞毒殺癌細胞之影響之直方圖。圖3 中，左側組別是添加自然殺手細胞之對照組，右側組別則是添加自然殺手細胞及癌癥醫藥 血漿共同培養之實驗組。對照組細胞經培養1天、2天、3天后，細胞數量分別達到4. 5X 1〇3 個細胞/孔、5. 9X 103個細胞/孔、8. 5X 103個細胞/孔。實驗組細胞經培養1天、2天、3 后，細胞數量則分別達到3. 1 X 1〇3個細胞/孔、3. 5 X 1〇3個細胞/孔、5. 0 X 1〇3個細胞/孔， 與培養同樣時間長度的對照組之間均具有顯著差異（P<〇. 001)。
[0089] 圖3顯示癌癥醫藥血漿能顯著提升自然殺手細胞毒殺癌細胞的效果，且效果隨著 作用時間長度而增加。其中，W癌癥醫藥血漿作用1天之毒殺效果提升31. 1 %，作用2天之 毒殺效果提升40. 7%，作用3天后之毒殺效果提升41. 2%。
[0090] 據此，W本發明7種ABC運輸蛋白線性多膚分子所篩選出的癌癥醫藥血漿，具有 高濃度ABC運輸蛋白抗體，能夠引發自然殺手細胞之抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用 (antibody-dependent cell-mediated巧totoxicity),使自然殺手細胞毒殺癌細胞之整 體效果提升，大幅降低抗藥性癌細胞之數量。
[0091] 依本發明人多年的經驗及發明研究結果，于動物體內施用本發明之醫藥組合物 時，建議每次化學療程輸入150?300mL該醫藥組合物一次。
[009引實驗五：純化ABC運輸蛋白抗體
[0093] 請參閱圖4,其系一方塊流程圖，表示出利用本申請多膚分子純化ABC運輸蛋白抗 體之一方法實施例。
[0094] 步驟S11 ;制備帶有一多膚分子之一磁珠，形成一磁珠多膚分子；
[0095] 步驟S12 ;混合該磁珠多膚分子與一樣品，而得一混合液；
[0096] 步驟S13 ;將該混合液通過受有一磁力之一管柱（column);
[0097] 步驟S14 ;將一緩沖液注入該管柱中，W分離一磁珠多膚分子暨抗體復合物中的 該磁珠多膚分子及一 ABC運輸蛋白抗體。
[0098] 其中，步驟 S11 中之該多膚分子系 SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及 SEQ ID N0;7 中之至少一者。步驟 Sll 可委巧 磁珠廠商代為執行，例如委巧臺灣圓點奈米技術股份有限公司（地址：桃園縣桃園市龍壽 街 81 巷 12 弄 2 號；電話；03-3607555 ;網址；ht1:p://www. tanbead. com/)代為執行。
[0099] 步驟S12中，該混合液中帶有一磁珠多膚分子暨抗體復合物。
[0100] 執行步驟S13之過程中，該混合液中的該磁珠多膚分子暨抗體復合物會受磁力影 響而吸附在該管柱上。
[0101] 步驟S14中，該緩沖液應選用能打斷該磁珠多膚分子與該ABC運輸蛋白抗體之連 結關系者。若步驟S11是委巧磁珠廠商進行，則該廠商會一并提供合適的緩沖液。
[0102] W此方式純化之ABC運輸蛋白抗體，可引發自然殺手細胞之抗體依賴性細胞介導 的細胞毒殺作用，且可進一步用于制備癌癥藥物或制備癌癥醫藥組合物。
[0103] 綜合W上所述，本申請提供7種ABC運輸蛋白線性多膚分子，能篩選出癌癥醫藥血 液、癌癥醫藥血漿、癌癥醫藥血清、或純化出ABC運輸蛋白抗體等各種癌癥醫藥組合物。所 述癌癥醫藥組合物能使自然殺手細胞毒殺癌細胞之整體效果提升，也能解決抗藥性癌細胞 的抗藥性問題，進而使化學治療藥物發揮毒殺抗藥性癌細胞之效果。
[0104] 本申請提供之一種用于篩選抗癌癥醫藥組合物之多膚分子即SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、沈Q ID NO ;3、沈Q ID NO ;4、沈Q ID NO ;5、沈Q ID NO ;6、W及 SEQ ID NO ;7 中 之至少一者，亦或是，一種由20?50個氨基酸組成之多膚分子，其序列包含SEQ ID NO ;1、 沈Q ID N0;2、SEQ ID N0;3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及沈Q ID N0;7 中之至少一者。
[0105] 應能理解的是，一種衍生多膚分子，系將界定于SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID N0;3、沈Q ID N0;4、沈Q ID N0;5、沈Q ID N0;6、W及沈Q ID N0;7 中之序列進行一或 多個氨基酸之取代、刪除或添加后所衍生，且能與至少一種H磯酸腺巧結合盒運輸蛋白之 抗體結合者，亦應包含于本申請之申請專利范圍內。
[0106] W上所述僅為本發明之較佳實施例，并非用W限定本發明之申請專利范圍，因此 凡其它未脫離本發明所掲示之精神下所完成之各種更動或潤飾等，均應包含于本申請之申 請專利范圍內。
【權利要求】
1. 一種多肽分子，其氨基酸序列包含SEQ ID NO :1序列、SEQ ID NO :2序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、SEQ ID NO :5 序列、SEQ ID NO :6 序列、以及 SEQ ID NO :7 序列中之至少一者或其組合。
2. 如權利要求1所述之多肽分子，該多肽分子可與至少一種三磷酸腺苷結合盒運輸蛋 白之抗體結合。
3. -種多肽分子之用途，用于篩選出一癌癥醫藥組合物，其中該多肽分子之氨基酸序 列包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、SEQ ID NO :5序列、SEQ ID NO :6序列、以及SEQ ID NO :7序列中之至少一者或其組合。
4. 如權利要求3所述之多肽分子之用途，用于從分離自人體之一血液、一血漿、或一血 清中篩選出該癌癥醫藥組合物。
5. 如權利要求3所述之多肽分子之用途，該癌癥醫藥組合物中包含至少一種三磷酸腺 苷結合盒運輸蛋白之抗體。
6. 如權利要求5所述之多肽分子之用途，該癌癥醫藥組合物可提升自然殺手細胞毒殺 癌細胞之效果。
7. 如權利要求5所述之多肽分子之用途，該癌癥醫藥組合物能與化學治療藥物發生協 同作用，抑制抗藥性癌細胞之數量。
8. -種分離或純化之抗體或人工生產之抗體，可與如下所述之多肽分子結合： 包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、 SEQ ID N0:5序列、SEQ ID N0:6序列、以及SEQ ID N0:7序列中之至少一者或其組合之多 肽分子。
9. 如權利要求8所述之分離或純化之抗體或人工產生之抗體，可提升自然殺手細胞毒 殺癌細胞之效果。
10. 如權利要求8所述之分離或純化之抗體或人工產生之抗體，可與化學治療藥物發 生協同作用，抑制抗藥性癌細胞之數量。
11. 一種檢測套組，用以檢測樣品中之三磷酸腺苷結合盒運輸蛋白之抗體含量，該檢測 套組中包含一多肽分子，且該多肽分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO :1序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、SEQ ID NO :5 序列、SEQ ID NO :6 序列、以及 SEQ ID NO :7序列中之至少一者或其組合。
12. -種檢測方法，系以一多肽分子作為一探針，檢測一樣品中之三磷酸腺苷結合盒運 輸蛋白之抗體含量，其中該多肽分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO :1序列、SEQ ID NO :2序 列、SEQ ID N0:3 序列、SEQ ID N0:4 序列、SEQ ID N0:5 序列、SEQ ID N0:6 序列、以及 SEQ ID NO :7序列中之至少一者或其組合。
13. 如權利要求12所述之檢測方法，系利用酵素免疫吸附法、西方墨點法、生物芯片 法、磁珠分離暨定量方式、以及其他探針檢測方式之至少一者，檢測該樣本中之三磷酸腺苷 結合盒運輸蛋白之抗體含量。
14. 如權利要求12所述之檢測方法，其至少包括下列步驟： (a) 涂覆該多肽分子至一容器中； (b) 去除該容器中的第一懸浮液； (c) 置入該樣品之一適當濃度樣本至該容器中； (d) 去除該容器中的第二懸浮液； (e) 置入一第二抗體； (f) 去除該容器中的第三懸浮液；以及 (g) 檢測該容器中之該第二抗體之含量。
15. 如權利要求14所述之檢測方法，其中該容器系96孔盤。
16. 如權利要求12所述之檢測方法，其中該樣品系分離自人體之一血液、一血漿或一 血清中之至少一者。
【文檔編號】C07K14/00GK104513297SQ201410417537
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】李光輝 申請人:李光輝