一種穩定表達豬瘟病毒e2蛋白的重組細胞系及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及重組哺乳動物表達細胞系，具體設及一種穩定表達豬攝病毒E2蛋白 重組細胞系。本發明還公開了制備所述重組細胞系的方法和該重組細胞系在制備豬攝亞單 位疫苗中的應用。屬于生物醫藥基因工程與免疫學領域。
【背景技術】
[0002] 豬攝（Classicalswinefever,CSFO是由豬攝病毒（Classicalswinefever virus,CSFV)引起的豬的一種急性高度致死性疾病，國際獸疫局（01巧將其定為必須通報 的疫病，我國將其列為一類動物疫病。豬攝每年給我國造成的經濟損失近100億，對我國養 豬業的危害極其嚴重。
[0003] 目前對該病的有效預防和控制的主要措施是進行免疫。中國科學家研究成功的豬 攝弱毒疫苗（C株）對世界范圍內豬攝防控發揮了卓著貢獻。該疫苗目前仍被我國及世界 上多個國家使用。豬攝弱毒疫苗分為乳兔苗，免脾淋苗，原代細胞苗及傳代細胞苗等。乳兔 苗和脾淋苗又稱為組織苗，是采用健康家兔生產制備的。組織苗的生產需要大量動物，且工 藝復雜，成本高；原代細胞苗及傳代細胞苗的生產也受到諸多因素困擾，如細胞培養用血清 中BVDV及抗體會干擾病毒生長，病毒生產滴度低、產量不穩定等。而且母源抗體干擾弱毒 疫苗的免疫效果，運也是導致豬攝疫苗免疫失敗的因素之一。
[0004] CSFV為有囊膜病毒，病毒粒子大小約為40-60nm。病毒基因組為單股正鏈RNA，長 約12. 3化，含一個大的開放性閱讀框（0RF)，編碼一個大的多聚蛋白含3898個氨基酸殘基， 分子量約為438kDa。多聚蛋白在翻譯的同時和翻譯后經病毒和宿主細胞的蛋白酶加工成 12種成熟的病毒蛋白，包括結構蛋白和非結構蛋白，其中結構蛋白有C、E0、E1和E2蛋白。 E2蛋白為CSFV的一種重要的囊膜糖蛋白，又稱為甜55,是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白誘 導產生病毒的中和抗體，是豬攝病毒主要的免疫保護性抗原，也是研究豬攝基因工程疫苗 的重要祀蛋白。
[0005] 鑒于現有豬攝疫苗的種種缺陷與不足，W及隨著現代基因工程技術與細胞生物工 程技術的發展，許多科研人員試圖W現代分子生物學手段研制出可W克服現有疫苗缺陷的 新型豬攝疫苗。運些新型的豬攝疫苗有病毒活載體疫苗、合成膚疫苗、DNA疫苗、大腸桿菌 表和昆蟲桿狀病毒表達的E2蛋白亞單位疫苗。
[0006] 目前得到應用的有歐洲科研人員研制的W昆蟲桿狀病毒表達的E2蛋白亞單位 疫苗，該疫苗免疫不受母源抗體影響，而且可W與病毒感染進行抗體檢測鑒別診斷，如 出ulst,etal.切totechnology, 20 (1-3) : 271-277]用 20μg昆蟲細胞表達的E2 雙相油包 水乳劑免疫豬，能抵抗100LD50CSFVBrescia毒株強毒的攻擊，該疫苗已于上世紀九十年代 在歐洲批準上市，在歐洲國家的豬攝根除計劃中發揮了重要作用。但是，該疫苗是通過昆蟲 桿狀病毒表達系統表達的，相對原核表達系統而言，該表達系統表達蛋白后可W在一定程 度上進行翻譯后加工與修飾，但與病毒天然抗原蛋白結構仍有一定差異，蛋白表達后折疊 與修飾不如哺乳動物細胞表達系統，而且該系統生產制備抗原時，細胞經病毒感染后細胞 會裂解與死亡，對下游純化等生產工藝增加難度。
[0007] 慢病毒化entivirus)載體是WHIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發展起來 的基因治療載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種能夠穩定表達豬攝病毒E2蛋白， 且克服了表達豬攝病毒E2蛋白對細胞毒性作用的重組細胞系。
[0009] 本發明的另一個目的是提供上述重組細胞系在制備預防豬攝病毒疫苗藥物中的 應用。
[0010] 本發明的另一個目的是提供由上述重組細胞系和佐劑制備的豬攝亞單位疫苗。
[0011] 本發明的另一個目的是提供上述豬攝亞單位疫苗的制備方法。
[0012] 本發明的上述目的是通過如下方案予W實現的：
[0013] 一種穩定表達豬攝病毒E2蛋白的重組細胞系，該重組細胞系是由如下方案制備 而得：
[0014]步驟 1:
[0015] 構建慢病毒重組載體，該慢病毒重組載體包括其中插入編碼豬攝病毒E2蛋白的 基因的序列和組氨酸標簽序列，所述編碼豬攝病毒E2蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 1所 示；
[001引 步驟2:
[0017] 將所述慢病毒重組載體與慢病毒包裝輔助質粒共轉染人胚胎腎細胞肥K-293T，進 行病毒包裝和生產，收集病毒液；
[001引 步驟3:
[0019] 用上述病毒液感染人胚胎腎細胞肥K-293T后培養，將培養的細胞進行稀釋克隆， 收集克隆細胞培養上清液與細胞，檢測并比較豬攝病毒E2蛋白表達量，獲得穩定表達豬攝 病毒E2蛋白的重組細胞系。
[0020] 上述編碼豬攝病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0021] 本發明采用SDS-PAGE電泳檢測重組細胞系的蛋白表達水平，結果標明篩選出的 重組細胞系在多次傳代后仍保持很好的蛋白表達水平，證明本發明構建的重組細胞系能穩 定表達目的基因一豬攝病毒E2蛋白。
[0022] 本發明還提供上述重組細胞系在制備預防豬攝病毒疫苗藥物中的應用。
[0023] 本發明還提供一種豬攝亞單位疫苗，該疫苗是由有效劑量的本發明所述重組細胞 系和佐劑組成。
[0024] 本發明還提供一種豬攝亞單位疫苗的制備方法，具體包括如下步驟：
[00幼步驟1:
[0026] 將本發明所述的重組細胞系正常傳代后長至融合度達到90%W上時，換無血清培 養基繼續培養7d;收集培養上清經2000rpm離屯、lOmin，吸取上清液，該上清液即為疫苗抗 原液；
[0027]步驟 2:
[0028] 將步驟1制備的疫苗抗原液與佐劑按1 :1~1 :3重量比進行混合并充分乳化后， 則制備得到所需豬攝亞單位疫苗。
[0029] 上述豬攝亞單位疫苗為雙相油佐劑疫苗，所述佐劑為礦物油佐劑。
[0030] 本發明制備的穩定表達豬攝病毒E2蛋白的重組細胞系，具有容易培養、增殖快 速、可無限擴大、性質穩定和蛋白表達量高的特點，其表達蛋白與佐劑制備成疫苗后免疫豬 能誘導動物機體產生高效價豬攝病毒中和抗體，可抵抗豬攝病毒強毒攻擊。
[0031] 與現有技術相比，本發明具有W下有益效果：
[0032] 1、現有技術中采用質粒轉染細胞后克隆篩選最終獲得的細胞系，其重組基因表達 不穩定，不易獲得高水平細胞株；而本發明采用慢病毒載體攜帶目的基因構建重組質粒后 轉染肥K-293T細胞，產生的高滴度病毒顆粒再感染肥K-293T細胞從而構建得到的重組細 胞系，表達穩定，在多次傳代后仍保持很好的蛋白表達水平；
[0033] 2、本發明所選用的表達系統為肥K-293T細胞，得到的重組細胞系肥K-293T-E2具 有與親本細胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的規模生產；表達蛋白在表達細胞內能得 到接近病毒蛋白的天然構象與修飾加工，抗原性好；重組細胞可W用轉瓶高密度發酵培養， 易于大量生產；
[0034] 3、本發明構建的慢病毒重組載體中，除了包含插入編碼豬攝病毒E2蛋白的基因 的序列外，還含有組氨酸標簽序列，有利于后期純化；
[0035] 4、本發明的重組表達細胞系可W利用無血清培養基或低血清培養基進行培養表 達，可W降低疫苗生產成本；
[0036] 5、將本發明的表達豬攝病毒E2蛋白的重組細胞培養物制備疫苗可W誘導動物機 體產生針對CSFV的高效價抗體，阻止病毒感染動物機體；
[0037] 6、本發明抗原表達量高，利用普通細胞培養瓶皿培養，產量可達200毫克每升；
[0038] 7、利用本發明的重組表達細胞系細胞培養物制備的油佐劑疫苗能誘導動物機體 產生高效價抗體，抗體持續時間長，能對免疫動物提供長久的有效的免疫保護；
[0039] 8、利用本發明重組細胞系表達抗原制備的疫苗免疫動物不產生豬攝病毒E0蛋白 抗體W及非結構蛋白抗體，可W利用檢測豬攝病毒E0蛋白抗體或非結構蛋白抗體來對疫 苗免疫與病毒感染動物進行鑒別；
[0040] 9、本發明所制備的豬攝疫苗不含病毒核酸，不能復制，無致病性，具有極高的生物 安全性，疫苗免疫不受母源抗體或已經存在抗體干擾與影響。
【附圖說明】
[0041] 圖1為慢病毒重組載體PLV-CMV-E2構建示意圖；
[0042] 圖2為慢病毒重組載體PLV-CMV-E2的菌落PCR電泳圖；
[0043] 圖中，Μ為化2000Marker，1-6為分別為1-6號克隆的菌落PCR結果，7為陰性對 照，8為陽性對照；
[0044] 圖3為慢病毒重組載體PLV-CMV-E2的化eI酶切電泳圖；
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