一種靶向vegfr2的抗體融合蛋白的制備及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種可與腫瘤血管內皮生長因子受體 (VEGFR/KDR)及NK細胞的活化型受體（NKG2D)特異結合的高親和力全人源的融合蛋白，能 抑制血管內皮生長因子（KDR)受體的活化，可抑制尚表達血管內皮生長因子受體人血管內 皮細胞HUVEC的生長，并且可增強NK細胞對人乳腺癌細胞的抗體依賴性的細胞介導的細胞 毒作用（ADCC)，是一種具有靶向VEGFR及NKG2D的抗腫瘤及血管生成活性的高特異性基因 工程融合蛋白。
【背景技術】
[0002] 如何在殺死腫瘤細胞的同時不傷害病人是我們一直面臨的難題。目前抗腫瘤藥物 設計的關鍵是不僅要殺死腫瘤細胞，而且要恢復機體的免疫監視作用，讓免疫系統來殺死 腫瘤細胞。腫瘤和免疫系統之間的相互作用可以分為：早期免疫介導的腫瘤"清除"、"平衡" 和腫瘤的"逃逸"三個階段。免疫系統免疫監護作用的一個重要的機制就是腫瘤細胞表面 MHC-I 相關抗原分子A和B(MHC class I-related chain molecules A and B，MICA/B)的表 達，MICA/B是表達于自然殺傷細胞（Natural killer cells，NK細胞）的活化型受體NKG2D 的配體。NK細胞借MICA/B與NKG2D的相互作用而與腫瘤細胞靠近、結合，從而通過釋放細 胞因子等誘導腫瘤細胞的溶解，進而殺傷腫瘤細胞。但研宄發現血清可溶性MICA (sMIC)水 平的顯著升高，導致NK細胞功能缺陷，并進一步指出可溶性MICA由腫瘤細胞表面MIC-A的 脫落產生，腫瘤細胞逃脫免疫即發生免疫逃逸。據此，有研宄者設計可溶性肽和抗MICA的 抗體阻止MICA的脫落，可能發展成為一種新的抗腫瘤治療方法。
[0003] 激活和重建機體腫瘤免疫作用的一種常規的藥物是抗體，比如通過阻斷CTLA4的 抗體已經被批準上市。抗腫瘤抗體除了人們熟知的中和或抑制某種因子誘導的細胞增殖 從而抑制腫瘤生長以外，它的免疫效應功能的主要機制是抗體通過其Fc段與NK或巨噬 細胞表面的Fc受體（Fc gamma receptor，FcyR)，FcyRIIIa結合，免疫細胞接近結合有 抗體的腫瘤細胞，激活免疫細胞以抗體依賴細胞介導的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)〇
[0004] 抗血管內皮生長因子受體抗體（VEGFR2 antibody)
[0005] 人 VEGFR2 稱為 KDR (kinase inserted domain containing receptor)，是血管內 皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)發揮刺激內皮細胞的增殖、迀 移，促進新生血管形成的主要受體。腫瘤新生血管的形成是腫瘤向惡性腫瘤轉變必不可少 的條件。此外，VEGFR-2還在乳腺癌、結腸癌、非小細胞肺癌、白血病等多種腫瘤細胞中高表 達。因此，VEGF或VEGFR2的抑制劑既可以通過抑制新生血管生成，以"饑餓療法"阻斷腫瘤 的營養攝取，又可以抑制腫瘤細胞的增殖或者促進凋亡。
[0006] 目前臨床上使用的VEGF抗體-貝伐單抗（bevacizumab)是的一株抑制VEGF通路 的單抗。FDA于2014年4月批準靶向VEGFR2的抗體Ramucirumab(IMC-1121B)上市，用于 治療化療失敗的胃癌、胃食管連接處腺癌。相對于臨床伴有高血壓和出血等副反應的貝伐 單抗，抗VEGFR2抗體有較好的安全性。
[0007] 腫瘤細胞表面MHC-I相關抗原分子A (MICA)
[0008] 主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC)在免疫應 答過程中參與抗原識別，與免疫系統密切相關。其中包括了對免疫起重要作用的MIC(MHC class c ainrelated Gene)家族。MIC家族又稱PerBll，位于MHCI類區域，具有高度多態 性，存在多種等位基因。它包括MICA、MICB、MICC、MICD、MICE、MICF和MICG7個成員，其中 只有MICA、MICB具有編碼、表達、轉錄蛋白的功能，其余均為假基因。其中MICA位于HLA-B 位點上游約46kb，全長1722bp編碼1382bp的轉錄子。
[0009] 人體中MICA集中表達在腸道上皮中，其他組織如腦、心臟、肺等中都無表達，但 MICA能表達在大多數上皮性腫瘤細胞（乳腺癌、肺癌、腎癌及卵巢癌等）中，被認為是一種 腫瘤相關性抗原。因此，MIC-A呈陽性表達的腫瘤細胞在機體的免疫機制中難以逃逸，MICA 的脫落則使上述腫瘤細胞雖然呈MICA陽性表達，但依然能逃脫免疫監視。且在上述大多 MICA呈陽性的上皮性腫瘤細胞（乳腺癌、肺癌、結腸癌等）中均存在血管內皮生長因子受 體 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)高表達，故 VEGFR-2 抗 體可作為有效的載體連接MIC-A蛋白，激活NKG2D途徑，從而恢復NK細胞免疫監視作用。

【發明內容】

[0010] 發明目的
[0011] 本發明提供一種具有潛在醫學和藥學價值的一種靶向VEGFR2的抗體融合蛋白。 本發明融合蛋白的特征為特異性結合人KDR的胞外3區及NKG2D，在體外能夠抑制人乳腺癌 細胞MDA-MB-231和人血管內皮細胞HUVEC的生長，且能夠增強NK細胞對腫瘤細胞的ADCC 效應，其誘導產生的ADCC效應優于VEGFR2抗體誘導產生的效應。
[0012] 技術方案
[0013] 一種靶向VEGFR2的抗體融合蛋白，該融合蛋白以全人源的抗VEGFR2的全長抗體 和NKG2D的配體MICA為基礎，通過基因重組構建成融合蛋白，利用柔性肽將兩段蛋白連接 起來。
[0014] 其中一條鏈由VEGFR2全長抗體重鏈和MICA蛋白組成，其氨基酸序列表為SEQ NO. 1 ;另一條鏈為VEGFR2全長抗體輕鏈，其氨基酸序列表為SEQNO. 2。
[0015] 一種表達純化法，其用于分離純化上述的融合蛋白。
[0016] -種分離的核酸，其特征在于：該核酸編碼權利要求1的靶向VEGFR2的抗體融合 蛋白。
[0017] 一組表達載體，含有權利要求4所述的核酸。
[0018] -種重組宿主細胞，含有權利要求5所述的表達載體。
[0019] 上述任一項的蛋白或蛋白片段的應用，其特征在于選擇性地與VEGFR2/NKG2D結 合或抑制VEGFR2/NKG2D與VEGFR2配體/NKG2D配體的結合阻斷其信號的轉導。
[0020] 上述任一項的蛋白或蛋白片段的偶聯物。
[0021] 靶向VEGFR2的抗體融合蛋白在治療腫瘤中的應用。
[0022] 發明進一步說明：
[0023] 本發明中靶向VEGFR2的抗體融合蛋白由兩條鏈組成，其中一條鏈由全長抗體和 MICA蛋白通過柔性肽（GGGGS)連接，另一條是全長抗體的輕鏈。
[0024] 含有本發明VEGFR2抗體/MICA融合蛋白基因的表達載體和宿主細胞株均屬于本 發明的保護范圍。
[0025] 本發明的另一個目的是提供一種可以表達和純化上述融合蛋白的方法。
[0026] 本發明利用PCR技術將篩選獲得的MICA蛋白與本實驗室專利單鏈抗體（專利號： ZL200910264180. 3)構建的VEGFR2全長抗體進行克隆重組，構建VEGFR2全長抗體/MICA融 合蛋白重組載體，電轉入CHO細胞中，將融合蛋白基因整合到染色體上，利用新霉素G418進 行篩選高表達融合抗體的穩定細胞株；對穩定細胞株擴大培養，低溫離心取上清，將上清過 Protein A柱進行分離純化；Western Blot鑒定分離純化得到的抗體；SPR實驗分析抗體與 抗原的親和能力；MTT檢測融合蛋白對人血管內皮細胞HUVEC和人乳腺癌細胞MDA-MB-231 的生長抑制作用；ADCC實驗證實融合蛋白能夠增強NK細胞對腫瘤細胞的ADCC效應，其誘 導產生的ADCC效應優于VEGFR2抗體誘導產生的效應。
【附圖說明】
[0027] 圖1是融合蛋白基因重組分析圖，重組基因包括重鏈基因大小約為2303bp、輕鏈 基因大小約為762bp。
[0028] 圖2是融合蛋白的結構示意圖，該蛋白由兩條鏈組成，其中VEGFR2抗體的Fc區和 MICA蛋白通過柔性肽（GGGGS)連接，而重鏈與輕鏈及重鏈是在表達細胞中自行通過二硫鍵 結合組裝在一起。
[0029] 圖3是SDS-PAGE蛋白質電泳圖和Western Blot鑒定融合蛋白圖。圖3A描述發 酵表達的融合蛋白通過鎳柱進行分離純化的結果，圖3BC描述Western Blot鑒定分離到的 融合蛋白結果。圖3B是孵育anti-H+L，圖3C是孵育anti-MICA。泳道1為VEGFR2的全長 抗體mAb04,泳道2為NKG2D的配體MICA，泳道3為分離得到的融合蛋白mAb04-MICA。
[0030] 圖4是抗原抗體親和力擬和曲線圖，展示融合蛋白mAb04-MICA與抗原VEGFR2(圖 4A:ka(l/Ms) :6.18E+05，kd(l/s) :8.00E-04，KD(M) :1.29E-09)或配體NKG2D(圖4B:ka(l/ Ms) :2.65E+08，kd(l/s) :188.2，KD(M) :7.10E-07)的結合測試實驗（Biacore)。
[0031] 圖5是流式檢測圖，描述融合蛋白mAb04-MICA與HUVEC細胞表面VEGFR2或U937 細胞表面NKG2D的結合（以正常無表達VEGFR2及NKG2D的HEK293細胞作為陰性對照）。 圖5A，HUVEC細胞；圖5B，U937細胞；圖5C，HEK293細胞。
[0032] 圖6是曲線圖，描述融合蛋白mAb04-MICA對HUVEC細胞（圖6A，以VEGFR2的全長 抗體mAb04為陽性對照，以NKG2D的配體MICA作為陰性對照）的生長抑制作用或對人乳腺 癌細胞MDA-MB-231的生長抑制作用（圖6B，以VEGFR2的全長抗體mAb04為陽性對照，以 NKG2D的配體MICA作為陰性對照）
[0033] 圖7是流式檢測圖，描述融合蛋白mAb04-MICA對MDA-MB-231細胞的凋亡作用。
[0034] 圖8是ADCC實驗結果柱形圖，描述融合蛋白mAb04-MICA激活NK細胞殺傷人乳腺 癌細胞MDA-MB-231的ADCC效應（以VEGFR2的全長抗體mAb04及NKG2D的配體MICA作為 陰性對照）。
【具體實