一種Tat PTD-Endostatin-RGD重組蛋白及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種化tPTD-Endostatin-RGD重組蛋白及其制備方法與應用，屬于生 物藥物技術領域。
【背景技術】
[0002] 內皮抑素巧ndostatin，Es)是0'Reilly等人1997年從血管內皮瘤中分離出來 的一種內源性血管生成抑制劑。內皮抑素是膠原蛋白XVIII分子C末端的片段，共有184 個氨基酸殘基，分子量為20kDa。研究證明內皮抑素只能抑制新生血管的生成而不對已存 在的血管發生作用。內皮抑素是目前作用最強、實驗效果最好的腫瘤血管生成抑制劑，近年 來倍受關注，目前在美國已經進行I期和II期臨床試驗，在我國已將血管內皮抑素衍生物 研制成具有國家自主知識產權的一類新藥化dostaH恩度），用W治療非小細胞肺癌。但 是，內皮抑素仍舊存在一些缺點，例如其入胞能力差、穩定性差、半衰期短等，限制了其在臨 床上的應用。
[0003] 申請人在前期的研究中已經成功開發了一種化tPTD-Es重組蛋白，其中，TatPTD 是人類免疫缺陷病毒HIV-I的反式激活因子的轉導域，其氨基酸序列為YGRKKRRQRRR，研究 表明將其與Es通過基因工程的方法重組表達出來的蛋白質可W穿透眼球屏障到達眼底， 增加了Es的入胞能力（專利"一種化tPTD-Endostatin重組蛋白及其制備方法與應用"， 專利申請號20)。但申請人在繼續研究的過程中發現，重組蛋白化tPTD-Es對 眼底視網膜內皮細胞的勒!向性和停留時間仍有待進一步的提局。
[0004] 整合素為細胞黏附因子家族的重要成員之一，主要介導細胞與細胞、細胞與細胞 外基質巧CM)之間的相互粘附，并介導細胞與ECM之間的雙向信號傳導。整合素是由a和 0兩個亞單位形成的異二聚體，表達于血管內皮細胞的有腔面和無腔面，介導內皮細胞的 遷移和毛細血管腔的形成，其中QyP3和aV0 5整合素的作用尤為重要。正常情況下，在靜 息期血管內皮細胞表面a 整合素有低水平表達，在細胞因子和生長因子的刺激下，其 表達上升。研究表明，整合素在新生血管內皮細胞中有高表達，對新生血管的生成起著重要 作用，其中，其中QyPs尤為重要。因此，整合素aV03會成為一些抗血管生成藥物的作用 祀點。含有精氨酸-甘氨酸-天冬酷胺序列的多膚RGD可W特異性識別整合素RGD 存在于多種細胞外基質中，可W與11種整合素特異性結合，能有效促進對細胞的附著。
[0005] 但由于將不同活性的目的蛋白組合在一起進行融合表達尚存在一系列技術上的 難點，例如不同蛋白整合后是否還能具有原有的活性，融合蛋白表達體系的選擇等，因此， 目前還沒有關于將化tPTD、化dostatin和RGDS者進行融合表達的報道。

【發明內容】

[0006] 針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種化tPTD-Endostatin-RGD重組蛋白 及其制備方法與應用。利用化tPTD的穿膜作用、Es的抑制新生血管生成的作用W及RGD =膚能夠與整合素特異性結合的特性，將=者通過基因工程的方法融合表達，獲得了一種 能夠穿過血腦屏障或者眼球屏障的并能在新生血管表面發揮藥效的內皮抑素，達到通過局 部滴眼的給藥方式預防眼底新生血管疾病的目的。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0008] -種化tPTD-Endostatin-RGD重組蛋白，其所具有的氨基酸序列如下：
[0010] 上述化tPTD-Endostatin-RGD重組蛋白是由人類免疫缺陷病毒的反式激活轉導 蛋白Tat的蛋白轉導域、人內皮抑素W及來自纖維細胞附著域的RGD=膚構成。其中，人類 免疫缺陷病毒的反式激活轉導蛋白Tat的蛋白轉導域的氨基酸殘基序列如SEQIDNO. 2所 示，人內皮抑素氨基酸殘基序列如SEQIDNO. 3所示，RGDS膚的氨基酸殘基序列如SEQID NO. 4所示。
[0011] 本發明還提供了能夠分別編碼上述人類免疫缺陷病毒的反式激活轉導蛋白化t 的蛋白轉導域、人內皮抑素W及來自纖維細胞附著域的RGD=膚的核巧酸序列，其分別具 有如SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7所示的序列或編碼相同蛋白質的與其具有 遺傳密碼簡并性的序列。
[0012] 對于編碼上述人類免疫缺陷病毒的反式激活轉導蛋白Tat的蛋白轉導域、人內皮 抑素W及來自纖維細胞附著域的RGD=膚的核巧酸序列，申請人在試驗過程中設計了多組 核巧酸序列，但在PCR擴增過程中，發現并非所有的核巧酸序列都能進行基因的表達，經優 化篩選，得到如SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7所示的核巧酸序列。
[0013] 本發明還提供了化tPTD-Endostatin-RGD重組蛋白的制備方法，步驟如下：
[0014] (1)融合基因的構建：采用常規方法制備含有編碼化tPTD-Endostatin的目的基 因和編碼二膚RGD的目的基因的化t-Endostatin-RGD融合基因，并擴增；
[0015] (2)采用限制性內切酶BamHI、化OI分別酶切質粒祀T28a，并回收酶切產物，采 用Gibsonassembly的方法連接酶切質粒和化1：-6]1(1〇31曰1:;[]1-1?60融合基因；
[001引做將步驟似的連接產物轉化入大腸桿菌D冊a感受態細胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測序分析鑒定重組質粒祀T28a/TatPTD-Endostatin-RGD,并獲得最終重組表達 質粒祀T28a/TatPTD-Endostatin-RGD;
[0017] (4)采用熱激法將表達質粒轉化入大腸桿菌化igami2 (DE3)感受態細胞中，在含 有卡那霉素、鏈霉素和四環素的LB平板上培養16h，篩選轉化子單菌落并抽提質粒進行PCR驗證，獲得陽性轉化子；
[001引 妨將上述陽性轉化子發酵，分離純化得到發酵產物，鑒定發酵產物即為化t PTD-Endostatin-RGD重組蛋白。
[0019] 步驟（2)中，Gibson assembly的方法連接酶切質粒和化1：-6]1(1〇31曰1:;[]1-1?60融合 基因的反應體系中包含有S種酶，分別為巧外切酶，化USion DNA聚合酶和化qDNA連接 酶。
[0020] 所述步驟妨具體如下：
[0021] ①挑選陽性轉化子，過夜培養后，按1:75(體積比）接種于LB培養基中，震蕩培 養至ODe。。為0. 6-0. 8,加入異丙基-0 -D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)，37°C，200r/min，誘導 6h，收菌；
[0022] ②將菌體破壁，采用SDS-PAGE對目的蛋白進行鑒定；
[0023] ③包涵體復性：菌體超聲后離屯、得到包涵體，采用稀釋復性或透析復性或超濾復 性法對包涵體進行復性；
[0024] ④分離純化化tPTD-Endostatin-RGD融合蛋白：將復性成功的蛋白質經親和層 析或者離子交換層析進行純化，除鹽后得到化tPTD-Endostatin-RGD重組蛋白。
[00巧]所述③中，復性方法具體如下：菌體破壁后，12000r/min離屯、30min，棄去上清得 到包涵體；采用含去污劑的尿素或鹽酸脈溶液洗涂多次去除粘附的雜蛋白；采用變性液對 包涵體進行溶解，在室溫攬拌化后，12000r/min離屯、即獲得包涵體溶液；然后將包涵體溶 解的、變形的無生物活性的蛋白質復性，使其能夠折疊成可溶的、有生物活性的構象。
[0026] 所述去污劑溶液為濃度不大于2mol/L的尿素或不大于1. 5mol/L的鹽酸脈，去污 劑溶液中含有hitonX-IOO和Tween20,濃度均為0.5% (v/v)。
[0027] 所述變性液為濃度為5-7mol/L的鹽酸脈或6-8mol/L的尿素，并含有lOmmol/L DTT和Smmol/L邸TA化2。
[0028] 所述變性液對包涵體的溶解在還原條件下進行。
[0029] 所述還原條件是指使用還原劑，所使用的還原劑為二硫蘇糖醇值TT)或0 -琉基 乙醇。
[0030] 所述復性是通過降低變性試劑的濃度（通過復性緩沖液緩慢地連續或逐步稀釋 溶解液來降低變性劑的濃度）至無變性作用或弱變形作用的水平來復性。
[0031] 所述復性時，復性緩沖液中含有至少一種還原和氧化形式的硫醇成分，硫醇成分 為GSH/GSSG。本發明對GSSG/G甜氧化還原比對復性率的影響進行了考察，固定G甜的濃度 為1臟〇1/1，對