專利名稱：：包含微小rna分子的抗癌組合物的制作方法包含微小RNA分子的抗癌組合物
技術領域：
：本發明涉及微小RNA125(mir-125)的新的用途。更具體而言，本發明涉及治療包括癌癥在內的與低氧誘導的血管生成相關的疾病的組合物。還有，本發明涉及抑制血管生成和阻抑癌細胞侵襲和轉移的方法，所述癌細胞的特征在于微小RNA-125表達水平低。
背景技術：
：微小RNA是一類新發現的極小的調節分子，其似乎控制細胞內許多生物過程。它們由動物和植物細胞中基因組編碼并且結合到mRNAs，以調節相應基因的表達(HeandHarmon,2004)。有越來越多的證據表明，微小RNA也與許多疾病的發生和進展有關，包括癌癥、病毒感染、心臟病、神經病等。因此，在臨床應用中已經作出了許多努力來使用微小RNA。例如，基于微小RNA-122刺激肝炎病毒的公開(Science309，15771781；2005),SantarisPharma最近已經開發出鎖定核酸(LNA)，其為肝特異性微小RNA-122的拮抗劑，已知其降低血液膽固醇水平和阻滯丙型肝炎病毒(HCV)(Nature452，896-900；2008)。一般而言，癌細胞比內皮細胞增殖快，血管內皮形成血管內襯(lining)。隨著癌細胞快速地生長，腫瘤組織新形成的血管在其中分布不足，因此不能供給腫瘤組織足夠的血液。這種對癌細胞血液供應不足引起腫瘤組織中營養和氧缺乏和腫瘤組織的酸化。事實上，在正常組織中測得的氧分壓具有從40至60mmHg的中值，但在實體癌中大部分為IOmmHg或更低的中值(BrownJM,CancerRes59，5863-5870，1999)。在癌組織內的這種低含氧量的條件下，已經發現癌細胞產生用于供應它們生存和增殖所必需的營養和氧的蛋白質。在本上下文中，低氧誘導的蛋白質包括血管內皮細胞生長因子(VEGF)、ΕΡ0(促紅細胞生成素)、糖酵解酶等。相應地，VEGF——負責癌細胞血管生成的代表性的激素蛋白——的調節可能導致癌轉移的抑制。特別是對于實體癌，已知化學治療或放射治療沒有效，這是因為腫瘤內部含氧量低。因此，對靶向特異性調節因子的基因治療存在需求。另外，防止癌癥侵襲和轉移到其它組織中以及抑制癌本身的生長在癌癥治療中是重要的。特別是，大部分的腦癌病例由于侵襲而再發，手術對其治療是無效的，以及它們用化學治療或放射治療被有限地治療。因此，抑制侵襲對于腦癌的治療是必需的。如果開發，則能夠在含氧量低的條件下調節癌細胞中血管生成的遺傳因子可以作為治療效果用于各種癌癥的治療中，所述各種癌癥由于預后難以用手術、化學治療和放射治療來治療。導入本發明，本發明人使用微陣技術在含氧量低的條件下在正常細胞和各種癌細胞之間測定微小RNA，對在含氧量低的條件下有活性的抗血管生成因子進行了深入和透徹的研究，結果發現微小RNA-125的表達在含氧量低的癌細胞中被特異性地降低以及通過在低氧狀態下調節VEGF分泌而充當抗血管生成因子。
發明內容技術問題因此，本發明的一個目的是提供包含微小RNA-125核酸分子的抗癌組合物。本發明的另一個目的是提供用于治療與低氧誘導的血管生成相關的疾病的組合物，其包含微小RNA-125核酸。本發明的進一步的目的是提供腦癌和腦腫瘤診斷的標記組合物，其包含測量微小RNA-125表達水平的藥劑。本發明的仍舊進一步的目的是提供抑制低氧誘導的血管生成的方法，其包括使用微小RNA-125核酸分子。本發明的仍舊另一個目的是提供抑制癌細胞侵襲和轉移的方法，其包括使用微小RNA-125核酸分子。還有，本發明的另一個目的是提供治療與低氧誘導的血管生成相關的疾病，特別是癌癥的方法，其包括使用微小RNA-125核酸分子。技術方案根據其一個方面，本發明涉及抗癌組合物，其包含微小RNA-125核酸分子。如本文所用，術語“微小RNA-125核酸分子”含義是組成微小RNA-125的單鏈或雙鏈核酸分子。在整個說明書中，‘微小RNA-125’與‘mir-125’可交替使用。一般來說，微小RNA由染色體上的內含子編碼并且轉錄為初級轉錄物，所述初級轉錄物然后在細胞核中被Drosha加工成較短的結構，已知為前體微小RNA(前miRNA)。在核輸出蛋白的調節下核輸出之后，這些前miRNA在細胞質中通過與Dicer相互作用被進一步加工成成熟的、約22bp長的miRNA，所述Dicer與進行基因沉默功能的RNA干擾沉默復合體(RISC)相關(NatRevMolCellBiol6，376-385；2005)微小RNA-125(mirl25)是多種微小RNA的家族，包括mirl25a、125bl和125b2，它們共享相同的種子序列。mir-125作為其同系物，已知為lin_4，首次在線蟲(C.elegans)中被發現以及Lagos-Quintana在2002年描述了小鼠同系物。針對人mir-125，Lee等在2005年報道了，miR125bl位于染色體llq24.1上功能未知的基因的外顯子區以及miR125b2位于染色體21q21.1上基因的內含子區。Gross等于2007年在染色體19ql3.4上發現了miR125a(參見圖6)。用于本發明的是源自人和非人動物的微小RNA-125同系物，非人動物包括猴子、豬、馬、牛、羊、狗、貓、鼠、兔等等。優選的實例包括人微小RNA-125a、微小RNA-125bl和微小RNA-125b2，但不限于這些。根據本發明的微小RNA-125核酸分子的長度范圍可以從18至IOOnt(核苷酸)以及可以是成熟的微小RNA-125，長度優選從19至25nt以及更優選從21至23nt。可選地，本發明的微小RNA-125核酸分子可以作為前體微小RNA-125分子提供，所述前體微小RNA-125分子的長度從50至IOOnt以及優選從65至95nt。成熟的和前體微小RNA-125分子的核苷酸序列可以通過參考如下公開地獲得美國國立衛生研究院(NIH)的數據庫，GenBankmirl25a(406910)、mirl25bl(406911)、mirl25b2(406912)和參考miRBASE(//microRNA.sanger.ac.uk/)，例如，mirl25a(前體形式的登錄號MI0000469(IDhsa-mir-125a)，以及成熟形式的登錄號MIMAT0000443(ID:hsa-miR-125a_5p，SEQIDNO.1)和MIMAT0004602(ID:hsa-miR-125a_3p，SEQIDNO.2))、mirl25bl(前體形式的登錄號MI0000446(ID:hsa-mir-125b_l)，以及成熟形式的登錄號MIMAT0000423(IDhsa-miR-125b,SEQIDNO.3)和MIMAT0004592(ID:hsa-miR-125b_l，SEQIDNO.4))以及mirl25b2(前體形式的登錄號MI0000470(ID:hsa-mir-125b_2)，以及成熟形式的登錄號MIMAT0000423(ID:hsa_miR-125b，SEQIDNO.3)和MIMAT0004603(ID:hsa-miR-125b_2，SEQIDNO.5))(圖6)。應該知道，本發明的微小RNA-125核酸分子包括組成型核酸分子的功能等同物，即，變體，其顯示與完整微小RNA-125核酸分子相同的功能——盡管它們通過一些核苷酸殘基的缺失、置換或插入而突變。進一步，本發明的微小RNA-125核酸分子可以以單鏈或雙鏈形式存在。成熟的微小RNA分子主要是呈單鏈形式，而前體微小RNA是部分自互補的，以形成雙鏈結構(例如，莖環結構)。在可選的實施方式中，本發明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA(肽核酸)或LNA(鎖定核酸)的形式。本發明的核酸分子可以使用例如化學合成或重組技術的標準分子生物學技術分離或制備，或者可以商業獲得。除微小RNA-125(mir-125)核酸分子之外，本發明的抗癌組合物可以包含能夠提高細胞中微小RNA-125表達的物質，諸如合成的或天然的化合物或蛋白質等。如本文所用，術語“抗癌”擬含義是在癌癥的治療和預防中抑制癌細胞生長、殺死癌細胞、和/或阻抑或壓制癌細胞轉移。本文中，術語“癌癥的預防”擬指通過給予組合物導致阻抑癌發生或延遲癌癥的任意作用。如本文所用，術語“癌癥的治療”擬指通過給予組合物導致癌癥癥狀改善或癌癥狀態的有益改變的任意作用。因為它們在低氧條件中抑制血管生成，所以本發明的微小RNA-125核酸分子具有抗癌活性。在低氧狀態下抑制血管生成是由于血管內皮細胞生長因子(VEGF)分泌的阻抑。如本文所用，術語“含氧量低的條件”或“低氧”擬指細胞或組織氧水平低于生理上可接受的水平，例如，正常細胞或組織活性所必需的最佳氧水平。一般而言，癌細胞以高于鄰近血管內皮細胞的速度增殖，因此遭受營養和氧的缺乏和酸化，這是因為它們血液供應不足。因此，腫瘤組織表達蛋白質，所述蛋白質的功能為它們生存和增殖供應必需的營養和氧。VEGF是這些分泌的蛋白質的代表。由于阻抑低氧誘導的VEGF(血管內皮細胞生長因子)分泌，本發明的微小RNA-125核酸分子可以抑制VEGF介導的血管生成。具體而言，本發明的微小RNA-125核酸分子阻抑由PTEN(第10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物)失活所誘導的VEGF表達，從而導致血管生成的抑制。另外，本發明的微小RNA-125核酸分子通過阻抑癌細胞的侵襲和轉移顯示抗癌活性。如本文所用，術語“癌細胞的轉移”含義是癌細胞從原發腫瘤遷移至遠處的組織或器官。在轉移中，癌細胞滲入鄰近的組織中并且進入到血管中，這通常被稱為侵襲。然后，癌細胞通過血流循環以及駐留在身體其它部位的正常組織中生長。因此，侵襲與癌細胞的轉移和遷移密切相關。本發明的微小RNA-125核酸分子具體阻抑癌細胞的侵襲，從而也防止癌細胞轉移和增殖。本發明所述的抗癌組合物可用于治療任意癌癥——只要其發病與微小RNA-125的異常表達相關——例如，癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。優選地，本發明的抗癌組合物可以治療上應用的癌癥的實例包括腦癌、宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌和成神經細胞瘤。具體而言，本發明的抗癌組合物用于預防和治療微小RNA-125表達水平低的癌癥，以及這些優選治療的具有低微小RNA-125水平的癌癥如下列表1中所列出，以及更優選腦癌，但不限于這些。如本文所用，術語“腦癌”擬含義是在腦中出現的所有癌組織，包括腦腫瘤。表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據其另一個方面，本發明涉及治療與低氧誘導的血管生成相關的疾病的組合物，其包含微小RNA-125核酸分子。由于在含氧量低的條件通過阻抑VEGF分泌而對血管生成具有抑制活性，本發明的微小RNA-125核酸分子可以用作與低氧誘導的血管生成相關的疾病的治療劑。本發明的微小RNA-125核酸分子可以應用的與血管生成相關的疾病的實例包括癌、血管瘤、血管纖維瘤、動脈硬化、血管粘附、硬皮病、新生血管性青光眼、糖尿病視網膜病、新生血管性角膜病、關節炎、牛皮癬、毛細血管擴張、化膿性肉芽腫和阿爾茨海默病，但不限于這些。優選地，將組合物用于具有低微小RNA-125表達水平的病灶組織。在本發明的實踐中，本發明人使用微陣技術分析了在含氧量低的條件下正常細胞和各種癌細胞中微小RNA水平以及考查了降低微小RNA水平對癌細胞中低氧誘導的VEGF表達的影響，結果發現微小RNA-125(mir-125a和mir-125b)在含氧量低的條件下降低VEGF分泌水平(圖1和2)。另外，考查了調節選擇的微小RNA-125的細胞機制。在含氧量低的條件下，微小RNA-125或PTEN而不是HIF-I調節VEGF分泌。還有，當在常氧和低氧中HIF-I抑制或PTEN表達被誘導時，觀察到在低氧中微小RNA-125的表達由PTEN而不是HIF-I進行調節(圖3)。另外，發現在含氧量低的條件下PTEN的調節導致VEGF水平明顯增加，以及當用微小RNA-125處理時，測得低氧中的細胞將增加的VEGF水平降至正常水平(圖3)，這共同表明微小RNA-125可以阻抑PTEN失活所誘導的血管生成。微小RNA-125的抗癌活性在對宮頸癌細胞以及腦癌細胞侵襲的抑制活性方面也得到了證實(圖4和8)。也對微小RNA-125進行抗癌活性體內測定。移植有微小RNA-125表達細胞系的小鼠比未移植的對照小鼠存活得更長并且體重沒有減輕(圖5)。因此，在含氧量低的腦癌細胞中PTEN的失活使微小RNA-125表達水平降低，從而使VEGF表達免受微小RNA-125的阻滯，這導致血管生成增加。因此，微小RNA-125作為遏制腦癌發病中的重要因素發揮作用。其升高的表達水平阻抑癌細胞的低氧誘導的血管生成，從而限制癌癥侵襲和轉移。根據本發明的實施方式，抗癌組合物包含運載微小RNA-125(mir-125)的表達載體。可以使用DEAE-葡聚糖_、核蛋白-或脂質體_介導的DNA轉染將本發明的微小RNA-125核酸分子導入細胞中。就這一點而言，微小RNA-125核酸分子可以錨在運載體(carrier)上，所述運載體允許將核酸分子有效輸送進入細胞中。優選地，運載體是載體一不論病毒或非病毒。用于本發明的病毒載體的實例包括源自慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒和禽痘病毒的載體，優選源自慢病毒，但不限于這些。慢病毒——一種逆轉錄病毒——可以有效地感染分裂細胞和非分裂細胞，這是因為其預整合復合物(病毒“殼”)可以穿過核孔或使目標細胞的完整核膜。在優選的實施方式中，運載微小RNA-125核酸分子的載體進一步錨定在其中的選擇標記物。如本文所用，術語“選擇標記物”擬含義是容易選擇導入微小RNA-125核酸分子的細胞的標記物。對標記物沒有給予具體的限制——只要其能夠使載體的導入容易被檢測或測量。通常，標記物賦予轉化體以選擇性表型，諸如藥物抗性、營養缺陷型、對細胞毒性劑的抗性、或表面蛋白表達。標記物的實例包括綠色熒光蛋白(GFP)、嘌呤霉素、新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、組胺醇脫氫酶基因(hisD)和鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Gpt)，優選GFP和嘌呤霉素。根據本發明的另一個實施方式，抗癌組合物包含細胞，該細胞中導入了微小RNA-125(mir-125)核酸分子。如本文所用，術語“導入”擬含義是將外源DNA通過轉染或轉導輸送進入細胞。轉染可以使用本領域中周知的各種方法實施，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導的轉染、聚凝胺(polybrene)-介導的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染胺試劑轉染和原生質體融合。轉導指外源DNA在感染的基礎上經由病毒或病毒載體轉移到另一個細胞的過程。當移植進入癌組織時，由于微小RNA-125的高表達水平，具有導入其中的微小RNA-125核酸分子的細胞可以阻抑癌癥的侵襲和轉移。因此，包含微小RNA-125核酸分子所導入的細胞的組合物可以用作癌癥的治療劑。在實施方式中，包含本發明所述的微小RNA-125核酸分子的抗癌組合物可以進一步包含藥學上可接受的載體以及用藥學上可接受的載體配制。如本文所用，術語“藥學上可接受的載體(vehicle)”擬指運載體或稀釋劑，其不破壞成分的藥學活性和性質以及不刺激待被處理的對象。為了用于本發明組合物的液體配制物，藥學上可接受的運載體優選適于滅菌和活體。本發明的活性成分可以用選自下列的一種進行配制鹽水、無菌水、林格氏液、緩沖鹽水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麥芽糖溶液、甘油、乙醇及其組合，以及如果需要，結合其它傳統的添加劑，包括抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑等。可選地，本發明的組合物可以用稀釋劑、分散劑、表面活性劑、黏合劑和/或潤滑劑配制成注射劑、丸劑、膠囊、顆粒劑或片劑。本發明所述的包含微小RNA-125核酸分子和藥學上可接受的載體的抗癌組合物可以配制成任意劑型——不論口服或非口服。本發明所述的藥物配制物可以經下列途徑給藥口服、直腸、經鼻、局部(包括推注(bolus)和舌下)、透皮、陰道或腸胃外(包括肌內、皮下、靜脈內)途徑或通過吸入或吹入。用本發明的組合物配制的口服劑型的實例包括片劑、錠劑(troches)、錠劑(lozenges)、水溶性或油性懸浮液、粉末、顆粒、乳狀液、硬或軟膠囊、糖漿或酏劑。對于片劑或膠囊配制物，有用的是添加劑，包括黏合劑，諸如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，諸如玉米淀粉或甘薯淀粉；以及潤滑齊IJ，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酰富馬酸鈉或聚乙二醇。除這些添加劑外，對于膠囊配制物，也可以使用液體運載體，諸如脂肪油。為了用于腸胃外給藥，本發明的組合物可以配制成經由皮下、靜脈內或肌肉途徑的注射劑，栓劑，或經由吸入的噴霧劑，諸如氣霧劑。注射劑可以通過這樣的方式進行制備將本發明的組合物與穩定劑或緩沖劑在水中混合，以得到溶液或懸浮液，所述溶液或懸浮液以單位劑量被包裝，諸如安瓿或小瓶。對于栓劑，本發明的組合物可以用傳統的基質諸如可可脂或甘油酯，或灌腸劑進行配制。呈水分散濃縮物或濕粉末形式的本發明的組合物可以用拋射劑進行配制，以制備氣霧噴霧劑。根據其另一個方面，本發明涉及治療癌癥的方法，所述癌癥的特征在于低微小RNA-125表達水平，所述方法包括給予包含微小RNA-125核酸分子的抗癌組合物。如本文所用，術語“給藥、給予或施用”擬含義是使用任意適合的方法將本發明的藥物組合物導入到對象，例如，使用病毒或非病毒技術輸送微小RNA-125核酸分子或移植表達微小RNA-125的細胞。只要其確保使本發明的組合物到達感興趣的組織，可以采用任意途徑給藥。例如，本發明的組合物可以口服、經直腸、局部、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、透皮、鼻內、胸內、眼內或皮內給藥。優選地，本發明的抗癌組合物可以局部給藥于癌癥組織中。本發明的治療方法包括以藥學有效量給于本發明的抗癌組合物。適合的總日劑量可以由主治醫師在合理的醫學判斷范圍內確定，這對本領域技術人員而言是明顯的。任意具體患者的具體治療有效劑量水平可以根據許多因素而變化，包括期望的反應的種類和程度、具體的組合物，包括根據擬用途任意其它藥劑的使用、患者的年齡、體重、總體健康狀態、性別和飲食、給藥時間、給藥途徑，以及組合物的排泄速率；治療持續時間；與具體組合物聯合或同時使用的其它藥物；以及醫學領域中周知的類似因素。相應地，適于本發明目的的抗癌組合物的有效量優選充分考慮上述因素進行確定。在一些情況下，本發明的抗癌組合物也可以結合周知的抗癌劑給藥，以提供增加的抗癌效果。進一步，本發明所述的治療方法可以應用于遭受癌癥的任意動物，所述癌癥的特征在于微小RNA-125表達水平低。動物的實例包括牛、豬、羊、馬、狗和貓以及人和靈長類動物。根據其另一個方面，本發明涉及使用微小RNA-125核酸分子阻抑癌細胞侵襲和轉移的方法。根據其另一個方面，本發明涉及抑制低氧誘導的血管生成的方法。當在癌細胞中表達時，本發明的微小RNA-125核酸分子可以阻抑VEGF(血管內皮細胞生長因子)的分泌，以抑制其中的血管生成，從而導致抑制癌細胞侵襲和轉移。具體而言，本發明的微小RNA-125核酸分子有效抑制由PTEN(第10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物)失活所誘導的血管生成，而不抑制由HIF-I在低氧誘導的血管生成，這表明PTEN調節細胞中微小RNA-125的表達。因此，當在低氧中PTEN的表達增加時，微小RNA-125的表達也增加，阻抑血管生成，從而預防癌細胞的侵襲和轉移。為了用本發明的微小RNA-125核酸分子治療癌細胞，可以使用病毒或非病毒輸送系統。病毒輸送系統的實例包括源自慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒和禽痘病毒的載體，但不限于這些。用于非病毒輸送系統的是脂質介導的轉染、脂質體、免疫脂質體、脂轉染劑、陰離子表面兩親物，以及其組合。根據其另一個方面，本發明涉及用于診斷腦癌和腦腫瘤的標記組合物，其包含用于測量微小RNA-125表達水平的藥劑和包含微小RNA-125的診斷試劑盒。如本文所用，術語“用于測量微小RNA-125表達水平的藥劑”擬指與微小RNA-125反應以測定微小RNA-125表達水平的分子。作為測量微小RNA-125表達水平的藥劑，引物或探針特異性微小RNA-125是有用的。微小RNA-125的表達水平可以使用引物進行PCR或探針雜交測定。基于標記組合物的診斷試劑盒可以包含已知在檢測中有用的各種工具和試齊U，諸如適合的運載體、可檢測的產生信號的標記、增溶劑、清潔劑、緩沖劑、穩定劑等。根據其另一個方面，本發明涉及使用本發明的微小RNA-125核酸分子篩選治療腦癌或腦腫瘤化合物的方法。其包括用調節微小RNA-125(mir-125)的候選物處理腦癌或腫瘤細胞；以及在含氧量低的條件下測量微小RNA-125表達水平。在用治療候選物處理腦癌或腫瘤細胞后，測量細胞中微小RNA-125表達水平，以便選擇誘導微小RNA-125表達水平增加的化合物，用于治療微小RNA-125介導的癌癥。有利效果由于顯示出通過阻抑癌細胞中低氧誘導的VEGF分泌抑制血管生成的能力，包含本發明所述的微小RNA-125核酸分子的抗癌組合物有效地抑制癌細胞的侵襲和轉移以及用作各種癌癥的基因治療。圖1顯示在低氧和常氧中微小RNA表達圖譜的微陣測定。A)為說明選擇對低氧特異性的微小RNA的示意性圖。從腦癌細胞的星形膠質細胞分離微小RNA，所述腦癌細胞已經在正常的和含氧量低的狀態下進行了培養，接著比較微小RNA。B)為顯示在各種腦癌細胞系中微小RNA的表達圖譜的微陣測定結果。圖2是顯示在常氧和含氧量低的條件下在各種微小RNA存在的情況下VEGF分泌水平的圖。圖3提供說明細胞中miRNA125的控制機制的各種結果。A)為對于HIF-I在siRNA存在的情況下VEGF的分泌水平，B)為對于HIF-I在siRNA存在的情況下miRNA125的表達水平，C)為顯示在siHIF和mir-125a存在的情況下HIF-I蛋白表達圖譜的蛋白質印跡，D)為在PTEN失活后低氧中VEGF的表達圖譜，E)為在單獨用PTEN和結合微小RNA-125拮抗劑處理的PTEN失活的細胞中VEGF的分泌水平。圖4以圖表和照片顯示mirl25對腦癌細胞侵襲的抑制活性。圖5顯示在植入有表達mirl25的細胞的小鼠中mirl25的抗癌效果的實驗數據。A)為小鼠模型，B)為說明將腦癌細胞注入腦中的過程的示意圖，C)為當用表達mirl25的細胞處理時腦癌誘導的小鼠的存活，D)為當用表達mirl25的細胞處理時腦癌誘導的小鼠的體重。圖6顯示前體mirl25和成熟mirl25基因組上的核苷酸序列和位置。miR-125在人基因組上的核苷酸序列和位置指NCBI基因ID號mirl25a(406910)、mirl25bl(406911)和mirl25b2(406912)，以及miRBASE(http//microRNA.sanger.ac.uk/)登錄號mirl25a(MI0000469)、mirl25bl(MI0000446)和mirl25b2(MI0000470)。圖7是顯示用于表達微小RNA-125的慢病毒的結構的示意圖。圖8以照片和柱狀圖顯示mirl25對宮頸癌細胞系HeLa的侵襲的抑制活性。具體實施方式本發明的更好的理解可以通過下列實施例獲得，所述實施例被提出，以說明而不被解釋為限制本發明。實施例1細胞培養在具有5%C02/21%O2大氣的培養箱中，在添加有10%FBS(胎牛血清)的DMEM/高葡萄糖(4500mg/L)培養基(Hyclone)中，培養正常的初級星形膠質細胞和各種腦腫瘤細胞(LN-18(CRL-2610)、U_87MG(HTB-14)、LN_229(CRL-2611)、U251、U373和LN428)。為了在含氧量低的條件下溫育，將氧濃度降至1%。源自宮頸癌細胞的HeLa細胞系也以相同的方式培養。實施例2瞬時轉染使用CellLineNucleofector試劑盒T溶液(Amaxa)通過電穿孔將miRNA(微小RNA)、siRNA和運輸感興趣的基因的載體轉染入細胞中。為了該目的，首先，使用血細胞計數器對細胞進行計數并且將其以1.5XIO6個細胞/管的群落等份分入1.5mLE管中，接著以IOOOrpm離心3min，收獲細胞。用DPBS將它們洗滌1次并且與100μ1的T溶液以及2μgDNA或IOOnMsiRNA或微小RNA混合，然后使用Amaxa電穿孔儀進行電穿孔。電穿孔后立即將細胞與Iml添加有10%FBS的DMEM混合，轉移入IOOmm培養皿中并且添加IOml培養基。然后，在下一個實驗前，將所述培養基在細胞培養箱中溫育48hrs。實施例3通過微陣測定比較微小RNA表達方式進行微陣測定，以比較在含氧量低或含氧量正常的條件下各種細胞系中微小RNA表達方式(圖1)。在常氧或低氧(1%O2)中溫育24hrs后，用Triozol(Invitrogen)使正常星形膠質腦細胞和各種腦腫瘤細胞進行RNA分離。由E-biogenInc.使用AgilentMicroarray(Agilenttechnology,USA)在各自的條件下對所分離的RNA進行miRNA表達水平分析。實施例4各種微小RNA調節低氧誘導的VEGF分泌從Ambion，U.S.A訂購miRNA，所述miRNA被發現在低氧和常氧之間表達水平改變，如實施例3的微陣所測定。通過電穿孔(電穿孔儀，Amaxa)將它們轉染入腦癌細胞系U373中，溫育48hrs，以及然后在常氧和低氧下再溫育24hrs。獲得培養基上清液并且使用ELISA測定VEGF分泌水平。對于VEGFELISA測定，使用人VEGFQuantiGloELISAKit(R&DSystems)。詳細地，以150μ1的量向試劑盒的每個孔加入AssayDiluent，以及50μ1標準溶液和50μ1培養基樣品，以測定其VEGF水平，并且在室溫下振蕩溫育2hrs。從每個孔抽吸所述液體，然后將每個孔洗滌四次。向每個孔加入200μ1偶聯物(conjugator)，并且室溫下振蕩溫育3hrs。再次抽吸液體，然后洗滌四次。在不存在光的情況下用100μ1WorkingGloReagent將每個孔溫育20min。為此，將其用箔包裹并在黑暗的房間內溫育。在反應完成后，使用發光計測定VEGF水平。在考查各種微小RNA在常氧和低氧中對VEGF分泌的影響后，發現mir_125a和mir-125b均抑制低氧誘導的VEGF分泌(圖2)。實施例5慢病毒的產生和表達微小RNA的細胞系的構建構建這樣的載體，所述載體運輸微小RNA125a和125b并且允許產生具有圖7結構的慢病毒。結合ViraPowerPackagingMix(9μg,Invitrogen)使用所形成的載體(3μg)，以產生病毒，ViraPowerPackagingMix包含pLP/VSVG、pLPl和pLP2，每個均編碼病毒結構蛋白。為了用作產生病毒的宿主，在根據制造商的方案制備的適合的培養基中培養293FT細胞。根據制造商的方案用Fugenee(Roche)進行轉染。將轉染的293FT細胞進一步培養48hrs以及從培養基上清液收集子代病毒。利用錨在載體的GFP通過FACS測定病毒效價。為此，將收集的病毒從KT1連續稀釋到10_9，以每孔Iml的量加入到之前等份分入6孔板的U373細胞。在加入后48小時，用胰蛋白酶-EDTA分離細胞并且用DPBS洗滌。在它們中，使用FACS對表達GFP的細胞進行計數并且將其用于以其百分比測定病毒效價。用有效價的病毒以IOTU(轉導單位)/細胞的MOI感染U373細胞，以構建分別轉錄miR-125a和miR_125b的U373細胞系。實施例6考查微小RNA-125的調控機制為了確定細胞中控制微小RNA-125的機制，考查了轉錄因子HIF-I(低氧誘導因子1)和腫瘤抑制基因PTEN——兩者已知均在VEGF表達中起重要作用——與微小RNA-125的關系。為了用作微小RNA拮抗劑來研究miRNA功能，核苷酸被設計成特異性地結合到細胞中的miRNA。對于本實驗，微小RNA拮抗劑購自Dharmacon。實施例5所述的慢病毒載體用作miRNA125表達載體。miRNA和siRNA均以IOOnM的濃度使用，以分別感染入細胞中。為了考查HIF-I抑制、PTEN表達和微小RNA-125表達對血管生成的控制，通過電穿孔用siHIF-1、siHIF-2、PTEN和mir_125a分別轉染U373細胞并且培養48hrs。將轉染的細胞在常氧和低氧中再溫育24hrs之后，使用ELISA試劑盒(R&DSystem)測定細胞培養基上清液的VEGF分泌水平(圖3A)。從圖3A的數據明顯看出，當siHIF-1在低氧中抑制HIF-I時或當PTEN或微小RNA-125被表達時，VEGF分泌被阻抑。明顯地，微小RNA-125或PTEN表達導致VEGF分泌的抑制程度比HIF-I活性抑制高。考查了在常氧和低氧中HIF-I抑制或PTEN表達對微小RNA-125表達的影響。為了該目的，通過電穿孔用siHIF、PTEN和mir-125a分別轉染U373細胞并且培養48hrs。在常氧和低氧中再溫育24hrs后，用Trizol(Invitrogen，USA)使細胞經受RNA分離。將所獲得的RNA通過實時PCR擴增，以測定在每個條件下mir-125a表達水平(圖3B)。如在圖3B的圖表中所理解，PTEN表達而不是HIF-I抑制增加了低氧中微小RNA-125表達水平，這表明微小RNA-125表達可以由PTEN表達控制。另外，通過蛋白質印跡測定考查了SiHIF和mir-125a對HIF-I翻譯的影響。在用siHIF和mir-125a分別電穿孔后，將U373細胞在常氧中溫育48hrs，然后再在常氧和低氧中溫育24hrs。從細胞中分離蛋白質并使用蛋白質印跡法測定HIF-Ia表達水平。如在圖3c的表達圖譜中所見，siHIF-la極大地誘導了HIF-Ia表達。在低氧中，也考查了VEGF表達圖譜——當調節PTEN時以及當過量表達微小RNA-125同時調節PTEN時。更詳細地，用表達siPTEN的慢病毒感染以使其中的PTEN失活后，再用mir-125a或mir-125b慢病毒感染LN229細胞，以構建穩定的細胞系，所述細胞系分別表達mir-125a和mir_125b。使用ELISA試劑盒，在細胞中測量VEGF表達水平，在所述細胞中，PTEN被調節成失活以及mir-125a或mir-125b被過量表達同時PTEN失活(圖3D)。如圖3D中所見，在含氧量低的條件下，PTEN調節引起VEGF表達水平增加，以致在培養基中檢測到VEGF分泌水平增加。還有，觀察到在細胞——其中PTEN調節增加了VEGF表達——中微小RNA-125的過量表達降低了升高的VEGF表達水平，這表明微小RNA-125可以調節PTEN失活所引起的血管生成。另外，考查了PTEN抑制VEGF分泌是否由微小RNA-125在低氧中調節。為此，當將PTEN加入到它們中時從PTEN調節的細胞測量VEGF分泌。另一方面，當結合微小RNA-125antagomirs(通過化學方法合成的寡核苷酸)、抗125a或抗125b用PTEN處理細胞時，比較分泌的VEGF濃度(圖3E)。例如，通過電穿孔用PTEN轉染U373細胞系——其中PTEN通過突變而失活——之后，測量VEGF分泌到培養基中的濃度。還有，在結合mir-125a和mir-125b的拮抗劑將PTEN導入細胞系之后使用ELISA試劑盒測量VETO表達水平。如圖3E中所見，發現將PTEN導入具有失活的PTEN的細胞中在低氧中誘導VEGF表達的阻抑。還有，當用PTEN并結合微小RNA-125antogomir處理細胞時，VEGF表達被抑制的程度比單獨用PTEN處理細胞時低。相應地，圖3E的數據顯示PTEN抑制低氧誘導的血管生成通過微小RNA-125進行調節。上述獲得的結果共同表明，在具有失活的PTEN的腦癌細胞中，微小RNA-125表達水平被減少從而增加VEGF表達，導致低氧誘導的血管生成，以及微小RNA-125在腦癌中起重要作用。實施例微小RNA-125對癌細胞侵襲的影響為了考查微小RNA-125對腦癌細胞侵襲的影響，mir_125a、mirl25b和陰性對照miRNA(Dharmacon)被導入各自的U373細胞(圖4)。詳細地，在實驗前一天對細胞進行計數以及將mir-125a、mirl25b和陰性對照miRNA分別電穿孔入1.5XIO6個細胞，細胞然后溫育48hrs。將Matrigel(生長因子降低的BDMatrigel基質)放入24-孔transwell的上室中以用于侵襲測定。將細胞懸浮在不含血清的DMEM培養基中以及將細胞懸浮液以1.5XIO6個細胞/孔的濃度放置在transwell上室中的matrigel上。將包含1%BSA的DMEM培養基填充在transwell的下室中，接著將transwell在37°C下在CO2培養箱中溫育24hrs。隨后，將細胞固定并且用Diff-Quick試劑盒(Sysmex)對細胞質和核染色。用棉簽將transwell上部未被侵襲的細胞擦除以及對滲入到transwell中的侵襲細胞進行計數。圖4的數據顯示與陰性對照相比，mirl25a和mirl25b分別降低侵襲約60%和約40%。實施例8微小RNA-125的抗癌活性為了考查miR-125b和HIFla是否可以調節癌癥，構建了產生miR_125b和HIFla的細胞系并且將其移植入小鼠中，接著測量小鼠的存活和體重(圖5)。更詳細地，用攜帶miR_125b、HIFla或空白載體的慢病毒感染U373-MG細胞，以構建產生miR-125b或HIFla的穩定細胞系。將導螺(塑料導螺)固定在15只6周齡雌性裸鼠(Balb-C/nu-nu，Halan)中每只的顱骨前鹵左側Imm和下方2mm位置處。將假件(dummy)(塑料的)插入每個導螺中。約10天后，用顯微注射插管(Hamilton)替代假件，通過該插管將每個構建的細胞系的5XIO5個細胞注射入尾狀核4mm深。從假件重新插入導螺后第10天起，監測小鼠體重、行為和健康狀態的變化約120天。如圖5中所見，對照小鼠遭遇體重減輕并且在約40天內死亡而移植有表達mir-125b細胞系的小鼠生存了約120天并且體重相對恒定，這表明mir-125b在動物組織中顯示出足以抑制癌生長的抗癌活性。實施例9微小RNA-125對宮頸癌細胞侵襲的影響為了考查mir-125對除腦癌細胞之外的癌細胞的影響，用宮頸癌細胞系HeLa進行與實施例7中相同的侵襲測定(圖8)。詳細地，在實驗前一天對細胞進行計數以及將mir-125a或陰性對照miRNA(Dharmacon)電穿孔入1.5XIO6個HeLa細胞，細胞然后溫育48hrs。將Matrigel(生長因子降低的BDMatrigel基質)放入24-孔transwell的上室中以用于侵襲測定。將細胞懸浮在不含血清的DMEM培養基中以及將細胞懸浮液以1.5X106個細胞/孔的濃度放置在transwell上室中的matrigel上。將包含1%BSA的DMEM培養基填充在transwell的下室中，接著將transwell在37°C下在CO2培養箱中溫育24hrs。隨后，將細胞固定并且用Diff-Quick試劑盒(Sysmex)對細胞質和核染色。用棉簽將transwell上部未侵襲的細胞擦除，以及對滲入到transwell中的侵襲的細胞進行計數。圖8的數據顯示，與陰性對照相比mirl25a顯著降低侵襲，表明微小RNA-125通過阻抑兩類細胞的侵襲對宮頸癌以及腦癌具有抑制活性。工業應用由于發現抑制低氧誘導的癌細胞的血管生成和阻抑癌細胞生長、侵襲和轉移，如上文所述，包含本發明所述的微小RNA-125的抗癌組合物可以用于對各種癌癥有效的基因治療，特別是，難以用手術、化學療法或放射療法進行治療的癌癥。權利要求抗癌組合物，其包含微小RNA-125核酸分子。2.根據權利要求1所述的抗癌組合物，其中所述微小RNA-125是人微小RNA_125a、微小RNA-125bl或微小RNA_125b2。3.根據權利要求1所述的抗癌組合物，其中所述癌癥的微小RNA-125表達水平低。4.根據權利要求1所述的抗癌組合物，其對癌細胞的侵襲和轉移具有抑制活性。5.根據權利要求1所述的抗癌組合物，其對低氧誘導的血管生成具有抑制活性。6.根據權利要求1所述的抗癌組合物，其中所述癌癥選自腦癌、宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌和成神經細胞瘤。7.根據權利要求1所述的抗癌組合物，其中所述微小RNA-125核酸分子存在于表達載體中。8.根據權利要求7所述的抗癌組合物，其中所述載體是源自慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒和禽痘病毒的病毒載體。9.根據權利要求1所述的抗癌組合物，其中所述微小RNA-125核酸分子被導入細胞中。10.根據權利要求1所述的抗癌組合物，進一步包含藥學上可接受的載體。11.用于治療與低氧誘導的血管生成相關的疾病的組合物，其包含微小RNA-125核酸分子。12.根據權利要求11所述的組合物，其中所述與低氧誘導的血管生成相關的疾病選自癌癥、血管瘤、血管纖維瘤、動脈硬化、血管粘附、硬皮病、新生血管性青光眼、糖尿病視網膜病、新生血管性角膜病、關節炎、牛皮癬、毛細血管擴張、化膿性肉芽腫和阿爾茨海默病。13.用于診斷腦癌和腦腫瘤的標記組合物，其包含用于測量微小RNA-125表達水平的藥劑。14.阻抑癌細胞侵襲和轉移的方法，其包含使用微小RNA-125(mir-125)核酸分子。15.抑制低氧誘導的血管生成的方法，其包含使用微小RNA-125(mir-125)。16.根據權利要求15所述的方法，其中所述血管生成通過用所述微小RNA-125阻抑VEGF(血管內皮細胞生長因子)分泌來抑制。17.根據權利要求15或16所述的方法，其中所述血管生成通過包括PTEN(第10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物)失活的途徑進行調節。18.治療癌癥的方法，包括給予權利要求1所述的組合物，所述癌癥具有低的微小RNA-125(mir-125)表達水平。19.根據權利要求18所述的方法，其中所述癌癥選自腦癌、宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌和成神經細胞瘤。20.治療與低氧誘導的血管生成相關的疾病的方法，包括給予權利要求1所述的組合物。全文摘要公開了用于治療包括癌癥在內的與低氧誘導的血管生成相關的疾病的抗癌組合物。其包含微小RNA-125核酸分子。還有，提供了抑制血管生成、抑制癌細胞侵襲和轉移以及治療癌癥的方法。文檔編號A61K31/7105GK101827601SQ200880019112公開日2010年9月8日申請日期2008年7月25日優先權日2008年7月18日發明者劉憲,樸恩慶,樸種培,李東熙,李承勛,梁喜錫,郭喜鎮,金惠鎮,金泰勛申請人:國立癌中心