本發明涉及(ji)(ji)生物制(zhi)(zhi)品技(ji)術領(ling)域，尤其(qi)是涉及(ji)(ji)新月(yue)藻(zao)活性蛋白的制(zhi)(zhi)備方法。

背景技術：

微藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)作為優良的(de)(de)(de)天然餌(er)料(liao)被廣泛應用于(yu)水產養(yang)殖，是多種(zhong)軟體(ti)(ti)動(dong)(dong)物(wu)、甲殼類(lei)幼體(ti)(ti)和(he)(he)(he)浮游動(dong)(dong)物(wu)（如(ru)輪蟲）的(de)(de)(de)主要食源。微藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)的(de)(de)(de)餌(er)料(liao)價值與(yu)(yu)許多因素有(you)(you)關，包(bao)括細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)大小、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)壁的(de)(de)(de)可(ke)消化(hua)程度(du)和(he)(he)(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)容物(wu)的(de)(de)(de)生化(hua)組成，尤(you)以(yi)后者最為重要。很早就有(you)(you)人(ren)注(zhu)意到(dao)環境因子的(de)(de)(de)改(gai)變(bian)對微藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)生長(chang)及生化(hua)成分的(de)(de)(de)影響，后續研究相(xiang)繼闡述(shu)了各種(zhong)微藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)在(zai)不同的(de)(de)(de)培(pei)養(yang)基配方、不同的(de)(de)(de)培(pei)養(yang)方式以(yi)及不同的(de)(de)(de)溫度(du)、光(guang)強(qiang)、通(tong)氣(qi)量、鹽度(du)、qd、光(guang)周期和(he)(he)(he)光(guang)質下細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)生化(hua)成分的(de)(de)(de)變(bian)化(hua)。新月藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)(closlerium)屬于(yu)綠藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)門，接合藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)月、鼓(gu)燕科(ke)。已記錄的(de)(de)(de)超(chao)過300種(zhong)，生活(huo)在(zai)各種(zhong)談水水體(ti)(ti)中(zhong)。新月藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)為單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)體(ti)(ti)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)為新月形，中(zhong)央有(you)(you)一(yi)(yi)核(he)，核(he)兩邊(bian)各有(you)(you)一(yi)(yi)個葉(xie)綠體(ti)(ti)。葉(xie)綠體(ti)(ti)的(de)(de)(de)表(biao)面(mian)有(you)(you)縱的(de)(de)(de)條(tiao)狀突起，橫切面(mian)呈芒狀；葉(xie)綠體(ti)(ti)中(zhong)有(you)(you)1列造粉核(he)。細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)兩端各有(you)(you)一(yi)(yi)個液泡(pao)，其中(zhong)有(you)(you)轉動(dong)(dong)的(de)(de)(de)石(shi)膏結晶(jing)。與(yu)(yu)新月藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)同類(lei)的(de)(de)(de)還有(you)(you)鼓(gu)藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)，但細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)形狀不一(yi)(yi)樣。鼓(gu)藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)也(ye)是單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)體(ti)(ti)，由2個“半(ban)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)”和(he)(he)(he)中(zhong)間窄(zhai)的(de)(de)(de)藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)腰組成。生殖方式與(yu)(yu)新月藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)類(lei)相(xiang)同。它們都屬于(yu)綠藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)。大多數可(ke)作食用或飼料(liao)。綠藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)向大自然釋放出大量的(de)(de)(de)氧氣(qi)并含有(you)(you)大量的(de)(de)(de)蛋白質，綠藻(zao)(zao)(zao)(zao)(zao)對水體(ti)(ti)自凈和(he)(he)(he)工業上都有(you)(you)相(xiang)當大的(de)(de)(de)作用。

現有(you)技術如(ru)授權公告號為cn102020705b的(de)中國(guo)發(fa)明專利，公開了一種(zhong)螺(luo)旋藻分離蛋白(bai)的(de)制(zhi)備方法，包括(kuo)以下步驟：(1)螺(luo)旋藻細胞破(po)碎脫色脫腥脫脂物料的(de)制(zhi)備；(2)稀鹽溶(rong)(rong)液提取蛋白(bai)與離心(xin)處理；(3)ph梯度分段調酸沉淀蛋白(bai)與調節(jie)中性(xing)；(4)超高(gao)溫瞬(shun)時滅(mie)菌(jun)和噴霧干燥。應用(yong)該(gai)(gai)方法生產出的(de)螺(luo)旋藻分離蛋白(bai)具有(you)色澤淺、腥味淡(dan)、蛋白(bai)質(zhi)(zhi)含量高(gao)、溶(rong)(rong)解性(xing)好和易消化的(de)優點，可(ke)作為一種(zhong)優質(zhi)(zhi)全(quan)價蛋白(bai)質(zhi)(zhi)營養補充劑或添加劑應用(yong)，但是該(gai)(gai)制(zhi)備方法采用(yong)超微粉碎處理進(jin)行細胞破(po)碎，破(po)碎不徹底。

技術實現要素：

本(ben)發明的(de)目的(de)在于提供一種活(huo)性蛋(dan)白純度(du)高、得率高，工藝簡(jian)單有效，生產(chan)成本(ben)低，產(chan)量大(da)(da)，適(shi)合大(da)(da)規模制(zhi)備的(de)新月藻活(huo)性蛋(dan)白的(de)制(zhi)備方(fang)法。

本發明針對上(shang)述技術(shu)中提到的(de)問題(ti)，采取的(de)技術(shu)方案(an)為：新月藻活性蛋白的(de)制備方法，包括粗細胞破碎(sui)、鹽析、雙水(shui)相萃取、超(chao)濾，具體包括以下步驟(zou)：

細(xi)(xi)胞(bao)破碎(sui)：配置(zhi)含水率(lv)為96-98%的(de)(de)(de)藻液(ye)(ye)，加(jia)入功能蛋白肽，選用濃度(du)(du)為0.5-1%的(de)(de)(de)pbs緩(huan)沖液(ye)(ye)作(zuo)為提(ti)取溶(rong)劑，在(zai)(zai)均(jun)(jun)(jun)質壓(ya)力為23-26mpa條(tiao)件下(xia)均(jun)(jun)(jun)質2-3次，保證每次從(cong)均(jun)(jun)(jun)質機流出的(de)(de)(de)蛋白混合液(ye)(ye)的(de)(de)(de)溫度(du)(du)≤40℃，然后(hou)經3-5℃、7000-9000rpm的(de)(de)(de)低溫離(li)心(xin)機離(li)心(xin)18-22min，上清液(ye)(ye)即為蛋白粗(cu)提(ti)液(ye)(ye)，該步驟中pbs緩(huan)沖溶(rong)液(ye)(ye)對藍(lan)藻細(xi)(xi)胞(bao)壁(bi)的(de)(de)(de)作(zuo)用，削(xue)弱(ruo)了細(xi)(xi)胞(bao)壁(bi)的(de)(de)(de)強度(du)(du)，從(cong)而使細(xi)(xi)胞(bao)壁(bi)在(zai)(zai)勻漿(jiang)下(xia)更容易破碎(sui)，另外，pbs緩(huan)沖液(ye)(ye)體系(xi)是弱(ruo)酸性體系(xi)，接近(jin)生理環境，更利(li)于藻蛋白活性的(de)(de)(de)保持。高(gao)(gao)壓(ya)均(jun)(jun)(jun)質機中的(de)(de)(de)新(xin)月藻，通過可調(diao)高(gao)(gao)壓(ya)均(jun)(jun)(jun)質閥，在(zai)(zai)驟然失(shi)壓(ya)狀(zhuang)態(tai)下(xia)，產生高(gao)(gao)速剪切(qie)(qie)沖擊現象，強烈的(de)(de)(de)剪切(qie)(qie)作(zuo)用使互不相(xiang)溶(rong)的(de)(de)(de)液(ye)(ye)－液(ye)(ye)或(huo)液(ye)(ye)－固等材料形成極細(xi)(xi)的(de)(de)(de)均(jun)(jun)(jun)勻的(de)(de)(de)乳(ru)化(hua)物態(tai)的(de)(de)(de)分(fen)散物，高(gao)(gao)壓(ya)勻漿(jiang)破碎(sui)新(xin)月藻細(xi)(xi)胞(bao)釋放藻蛋白，能夠批量(liang)化(hua)破碎(sui)藻細(xi)(xi)胞(bao)，利(li)用工業化(hua)生產；

鹽(yan)析(xi)(xi)：向蛋白粗提(ti)液中加入(nh4)2so4至25-35%飽和度(du)，3-5℃下(xia)靜(jing)止11-13h，然(ran)后在3-5℃、4000-6000rpm下(xia)離心20-25min，即得鹽(yan)析(xi)(xi)沉(chen)淀物，該(gai)步驟中加入大量(liang)的硫酸銨，使蛋白質(zhi)得溶解(jie)度(du)降低(di)而沉(chen)淀析(xi)(xi)出(chu)，該(gai)方法優(you)點(dian)在于硫酸銨濃度(du)變化具有連續性，鹽(yan)析(xi)(xi)效果(guo)好，節約(yue)能耗；

雙(shuang)水(shui)相萃(cui)取(qu)：將聚(ju)乙二(er)(er)醇(chun)和無機鹽(yan)配成ph為(wei)(wei)(wei)5.8-6.5，聚(ju)乙二(er)(er)醇(chun)濃(nong)度為(wei)(wei)(wei)15-17%，無機鹽(yan)濃(nong)度為(wei)(wei)(wei)11-13%的雙(shuang)水(shui)相體系，加入鹽(yan)析沉(chen)淀(dian)物，磁力攪拌，然(ran)后(hou)轉移至分(fen)液漏斗中(zhong)分(fen)層(ceng)，上相即為(wei)(wei)(wei)蛋(dan)(dan)白(bai)溶液，雙(shuang)水(shui)相萃(cui)取(qu)技術是一種新型(xing)的萃(cui)取(qu)分(fen)配技術，其反應條件溫(wen)和，容易工藝放大，分(fen)相時間短，效(xiao)果(guo)好，其中(zhong)聚(ju)乙二(er)(er)醇(chun)相為(wei)(wei)(wei)上相，無機鹽(yan)相為(wei)(wei)(wei)下相，藻蛋(dan)(dan)白(bai)主(zhu)要分(fen)布在聚(ju)乙二(er)(er)醇(chun)相中(zhong)；

超濾：將(jiang)蛋(dan)白(bai)(bai)溶液置于截留分子量為20-40kda超濾離心(xin)管中，離心(xin)，冷(leng)凍干燥，即為新月(yue)藻活(huo)(huo)性(xing)(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)，該步驟可(ke)以在不破壞活(huo)(huo)性(xing)(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)前提下，能(neng)有(you)效去除蛋(dan)白(bai)(bai)溶液中的(de)(de)聚乙(yi)二醇(chun)，提高(gao)了(le)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)濃度(du)并且保證蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)純度(du)不會減(jian)小(xiao)甚至有(you)所(suo)增加，該蛋(dan)白(bai)(bai)具有(you)抗(kang)炎活(huo)(huo)性(xing)(xing)、抗(kang)癌活(huo)(huo)性(xing)(xing)及提高(gao)免疫性(xing)(xing)，能(neng)夠清除活(huo)(huo)性(xing)(xing)氧，能(neng)通過驅除自(zi)由基從而(er)表現出(chu)抗(kang)炎活(huo)(huo)性(xing)(xing)，蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)促(cu)紅細胞生成素(su)活(huo)(huo)性(xing)(xing)較高(gao)，有(you)刺激骨髓(sui)造血的(de)(de)功效，可(ke)用于動物的(de)(de)飼料(liao)或養魚餌料(liao)。

優選的(de)(de)，細胞(bao)破(po)碎步驟(zou)中功能蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)肽的(de)(de)加入量為(wei)藻粉重量的(de)(de)0.008-0.01%，氨基酸序列為(wei)hshsvcvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，該(gai)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)肽上(shang)的(de)(de)正(zheng)電(dian)荷(he)與細菌(jun)質膜(mo)磷(lin)脂(zhi)分子上(shang)的(de)(de)負電(dian)荷(he)通過靜電(dian)作(zuo)用(yong)相(xiang)互吸引(yin)而靠近，破(po)壞脂(zhi)質雙(shuang)分子層(ceng)原有(you)的(de)(de)有(you)序結構，在細胞(bao)膜(mo)上(shang)形成(cheng)離子通道(dao)，改變新(xin)月藻細胞(bao)的(de)(de)滲(shen)透壓，致使細胞(bao)內的(de)(de)物質泄漏，提高粗蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)提取的(de)(de)工作(zuo)效率。

優(you)選的(de)，雙水相萃取步驟中(zhong)無(wu)機鹽(yan)為磷酸鉀(jia)(jia)鹽(yan)、磷酸鈉(na)鹽(yan)、硫酸鈉(na)、硫酸鉀(jia)(jia)、酒石酸鉀(jia)(jia)鈉(na)中(zhong)的(de)一種(zhong)或幾(ji)種(zhong)混合。

與現有技術相比，本發明的優點(dian)在于：

1.本發明(ming)提供的(de)(de)新(xin)月藻(zao)活性蛋(dan)白(bai)的(de)(de)提取方法(fa)，提取出的(de)(de)活性蛋(dan)白(bai)純(chun)度高(gao)、得率高(gao)，工藝簡(jian)單有(you)效(xiao)，生產(chan)成本低，產(chan)量大，適合大規模(mo)制備新(xin)月藻(zao)活性蛋(dan)白(bai)。

2.采(cai)用(yong)高壓均質(zhi)機進行(xing)細(xi)胞破碎(sui)，在驟然失壓狀(zhuang)態(tai)下，產生高速剪切沖擊(ji)現象，強烈的(de)(de)剪切作用(yong)使互不(bu)相溶(rong)的(de)(de)液(ye)－液(ye)或液(ye)－固(gu)等材(cai)料形成極細(xi)的(de)(de)均勻的(de)(de)乳(ru)化物態(tai)的(de)(de)分散(san)物，高壓勻漿破碎(sui)新月藻細(xi)胞釋放藻蛋白，能(neng)夠批量化破碎(sui)藻細(xi)胞，適用(yong)于工業化生產。

3.雙(shuang)水相萃(cui)取(qu)技術是一(yi)種(zhong)新型(xing)的萃(cui)取(qu)分配技術，其反應條件溫(wen)和，容(rong)易工藝放大，分相時間短，效果好(hao)，其中(zhong)聚(ju)乙二醇相為上相，無機鹽相為下相，藻蛋白主要分布在聚(ju)乙二醇相中(zhong)。

4.該蛋白(bai)具有抗(kang)炎(yan)活(huo)性(xing)(xing)、抗(kang)癌活(huo)性(xing)(xing)及(ji)提高免疫性(xing)(xing)，能(neng)夠清除活(huo)性(xing)(xing)氧，能(neng)通過(guo)驅除自(zi)由基從而(er)表現出抗(kang)炎(yan)活(huo)性(xing)(xing)，蛋白(bai)的促紅細(xi)胞生成(cheng)素(su)活(huo)性(xing)(xing)較(jiao)高，有刺激骨髓造血的功效，可用于動物(wu)的飼料(liao)或養魚餌料(liao)。

具體實施方式

下面通過(guo)實施例(li)對本(ben)發(fa)明方案作進一步說明：

實施例1：

新月藻活性蛋白(bai)的制備方法，包(bao)括(kuo)粗細胞破(po)碎、鹽析(xi)、雙水(shui)相萃(cui)取、超濾(lv)，具體包(bao)括(kuo)以下步(bu)驟(zou)：

1）細(xi)胞(bao)(bao)破碎：配置含水率為(wei)(wei)98%的(de)藻液(ye)，加入功能(neng)蛋白肽(tai)，選用(yong)(yong)濃度為(wei)(wei)0.7%的(de)pbs緩沖液(ye)作(zuo)為(wei)(wei)提取溶劑，在(zai)均(jun)質(zhi)壓(ya)力為(wei)(wei)25mpa條件下(xia)均(jun)質(zhi)3次，保(bao)證(zheng)每次從(cong)均(jun)質(zhi)機流出的(de)蛋白混(hun)合液(ye)的(de)溫度≤40℃，然后經4℃、8000rpm的(de)低溫離心機離心20min，上清液(ye)即為(wei)(wei)蛋白粗提液(ye)，該(gai)步(bu)驟(zou)中pbs緩沖溶液(ye)對藍(lan)藻細(xi)胞(bao)(bao)壁(bi)(bi)的(de)作(zuo)用(yong)(yong)，削弱了細(xi)胞(bao)(bao)壁(bi)(bi)的(de)強(qiang)度，從(cong)而(er)使細(xi)胞(bao)(bao)壁(bi)(bi)在(zai)勻漿下(xia)更(geng)容易(yi)破碎，另(ling)外，pbs緩沖液(ye)體系是弱酸(suan)性體系，接(jie)近生理環境，更(geng)利于(yu)藻蛋白活性的(de)保(bao)持。高壓(ya)均(jun)質(zhi)機中的(de)新(xin)月藻，通過可調高壓(ya)均(jun)質(zhi)閥，在(zai)驟(zou)然失壓(ya)狀態(tai)下(xia)，產生高速剪切沖擊現(xian)象(xiang)，強(qiang)烈的(de)剪切作(zuo)用(yong)(yong)使互不(bu)相(xiang)溶的(de)液(ye)－液(ye)或液(ye)－固等(deng)材料形成極細(xi)的(de)均(jun)勻的(de)乳化(hua)物(wu)態(tai)的(de)分散(san)物(wu)，高壓(ya)勻漿破碎新(xin)月藻細(xi)胞(bao)(bao)釋放(fang)藻蛋白，能(neng)夠批量化(hua)破碎藻細(xi)胞(bao)(bao)，利用(yong)(yong)工業化(hua)生產；

2）鹽析：向蛋白(bai)粗提液中(zhong)(zhong)加入(nh4)2so4至32%飽(bao)和度，4℃下靜止12h，然后在(zai)4℃、5000rpm下離心2min，即得鹽析沉淀物，該(gai)步(bu)驟(zou)中(zhong)(zhong)加入大量的硫(liu)酸銨(an)，使蛋白(bai)質得溶解度降低而(er)沉淀析出(chu)，該(gai)方法(fa)優點在(zai)于硫(liu)酸銨(an)濃度變化具有連續性，鹽析效果好，節約能耗；

3）雙(shuang)水(shui)相(xiang)萃(cui)取(qu)：將聚乙二醇(chun)(chun)和無機(ji)鹽(yan)配成ph為(wei)6，聚乙二醇(chun)(chun)濃(nong)度(du)為(wei)16%，無機(ji)鹽(yan)濃(nong)度(du)為(wei)12%的雙(shuang)水(shui)相(xiang)體系(xi)，加入(ru)鹽(yan)析沉(chen)淀物，磁(ci)力攪拌(ban)，然后轉移至(zhi)分(fen)液(ye)漏斗中分(fen)層(ceng)，上相(xiang)即(ji)為(wei)蛋(dan)(dan)白溶(rong)液(ye)，雙(shuang)水(shui)相(xiang)萃(cui)取(qu)技術是(shi)一種(zhong)新(xin)型(xing)的萃(cui)取(qu)分(fen)配技術，其(qi)反應條件溫和，容易工藝放大，分(fen)相(xiang)時間短，效果好，其(qi)中聚乙二醇(chun)(chun)相(xiang)為(wei)上相(xiang)，無機(ji)鹽(yan)相(xiang)為(wei)下相(xiang)，藻蛋(dan)(dan)白主要(yao)分(fen)布在聚乙二醇(chun)(chun)相(xiang)中；

4）超濾(lv)：將蛋(dan)白(bai)(bai)溶(rong)液(ye)置于(yu)截留分(fen)子量為(wei)30kda超濾(lv)離心管中(zhong)，離心，冷凍(dong)干燥，即(ji)為(wei)新月藻活(huo)性(xing)(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)，該(gai)步(bu)驟可(ke)以(yi)在不(bu)(bu)破壞(huai)活(huo)性(xing)(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)前提下，能(neng)有(you)效去(qu)除蛋(dan)白(bai)(bai)溶(rong)液(ye)中(zhong)的(de)(de)聚乙二(er)醇，提高(gao)(gao)了蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)濃度(du)并且保證蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)純(chun)度(du)不(bu)(bu)會減小甚至有(you)所增加，該(gai)蛋(dan)白(bai)(bai)具有(you)抗炎(yan)活(huo)性(xing)(xing)、抗癌活(huo)性(xing)(xing)及提高(gao)(gao)免(mian)疫(yi)性(xing)(xing)，能(neng)夠清除活(huo)性(xing)(xing)氧(yang)，能(neng)通過驅除自由(you)基從而表現(xian)出抗炎(yan)活(huo)性(xing)(xing)，蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)促紅細胞生成(cheng)素活(huo)性(xing)(xing)較高(gao)(gao)，有(you)刺激骨髓造血(xue)的(de)(de)功(gong)效，可(ke)用于(yu)動物(wu)的(de)(de)飼料(liao)(liao)或養魚餌料(liao)(liao)。

上述(shu)細胞破(po)碎(sui)步(bu)驟中功能(neng)蛋白(bai)肽(tai)的(de)(de)(de)加入量為藻粉重量的(de)(de)(de)0.01%，氨(an)基酸序列為hshsvcvshrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，該蛋白(bai)肽(tai)上的(de)(de)(de)正電荷與細菌質膜磷脂(zhi)分(fen)子(zi)上的(de)(de)(de)負(fu)電荷通過靜(jing)電作用相互吸引而靠近(jin)，破(po)壞脂(zhi)質雙(shuang)分(fen)子(zi)層原有的(de)(de)(de)有序結構，在細胞膜上形成離(li)子(zi)通道，改變新月藻細胞的(de)(de)(de)滲(shen)透壓，致使細胞內的(de)(de)(de)物質泄漏，提高(gao)粗蛋白(bai)提取的(de)(de)(de)工作效率。

上述雙水相萃取步(bu)驟中無機鹽為磷(lin)酸(suan)鉀(jia)鹽、磷(lin)酸(suan)鈉鹽、硫酸(suan)鈉、硫酸(suan)鉀(jia)、酒石酸(suan)鉀(jia)鈉中的一種或幾種混合。

實施例2：

新月藻活(huo)性蛋白的(de)制備方法，具體包括以(yi)下步驟：

1）配置(zhi)含水率為(wei)(wei)976-98%的(de)(de)(de)(de)藻(zao)液(ye)(ye)，加入重量為(wei)(wei)藻(zao)粉重量的(de)(de)(de)(de)0.01%的(de)(de)(de)(de)功能蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)肽，選用濃度(du)為(wei)(wei)0.8%的(de)(de)(de)(de)pbs緩沖液(ye)(ye)作為(wei)(wei)提(ti)取溶(rong)劑，在(zai)(zai)均質(zhi)壓(ya)力為(wei)(wei)26mpa條件下均質(zhi)2次，保證每次從均質(zhi)機流出的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)混合液(ye)(ye)的(de)(de)(de)(de)溫度(du)≤40℃，然后(hou)經5℃、9000rpm的(de)(de)(de)(de)低溫離心機離心18min，上(shang)清液(ye)(ye)即為(wei)(wei)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)粗(cu)提(ti)液(ye)(ye)，該步驟中pbs緩沖溶(rong)液(ye)(ye)對藍藻(zao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)壁的(de)(de)(de)(de)作用，削弱(ruo)了細(xi)(xi)(xi)胞(bao)壁的(de)(de)(de)(de)強度(du)，從而(er)使細(xi)(xi)(xi)胞(bao)壁在(zai)(zai)勻(yun)漿(jiang)下更容易破碎(sui)，另外，pbs緩沖液(ye)(ye)體(ti)系是弱(ruo)酸性(xing)體(ti)系，接近生(sheng)理(li)環境(jing)，更利于藻(zao)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)活性(xing)的(de)(de)(de)(de)保持。高壓(ya)均質(zhi)機中的(de)(de)(de)(de)新(xin)月(yue)藻(zao)，通過可調高壓(ya)均質(zhi)閥(fa)，在(zai)(zai)驟然失壓(ya)狀(zhuang)態下，產(chan)生(sheng)高速剪(jian)切沖擊現象，強烈的(de)(de)(de)(de)剪(jian)切作用使互不(bu)相溶(rong)的(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)－液(ye)(ye)或液(ye)(ye)－固等材料形成極(ji)細(xi)(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)均勻(yun)的(de)(de)(de)(de)乳化物態的(de)(de)(de)(de)分散(san)物，高壓(ya)勻(yun)漿(jiang)破碎(sui)新(xin)月(yue)藻(zao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)釋放藻(zao)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)，能夠批量化破碎(sui)藻(zao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，利用工(gong)業(ye)化生(sheng)產(chan)；

2）向蛋(dan)白(bai)粗提液中加(jia)入(nh4)2so4至(zhi)35%飽和度(du)，5℃下(xia)靜(jing)止(zhi)11h，然后離心，即得鹽析沉(chen)(chen)淀物，該步驟(zou)中加(jia)入大量的硫(liu)酸(suan)(suan)銨(an)，使蛋(dan)白(bai)質得溶解度(du)降(jiang)低而沉(chen)(chen)淀析出，該方(fang)法優(you)點(dian)在于硫(liu)酸(suan)(suan)銨(an)濃度(du)變化具(ju)有(you)連續性，鹽析效果好，節約能耗(hao)；

3）雙水相(xiang)(xiang)(xiang)萃(cui)取(qu)：將(jiang)聚乙(yi)二(er)醇(chun)(chun)(chun)和磷酸(suan)鉀鹽配成ph為(wei)6.5，聚乙(yi)二(er)醇(chun)(chun)(chun)濃度(du)為(wei)15%，無磷酸(suan)鉀濃度(du)為(wei)13%的(de)雙水相(xiang)(xiang)(xiang)體(ti)系，加入鹽析(xi)沉(chen)淀物(wu)，磁力(li)攪拌，然后轉(zhuan)移至分(fen)液漏(lou)斗中分(fen)層，上(shang)相(xiang)(xiang)(xiang)即為(wei)蛋(dan)白溶液，雙水相(xiang)(xiang)(xiang)萃(cui)取(qu)技術是一種新型的(de)萃(cui)取(qu)分(fen)配技術，其反應條件溫和，容(rong)易工藝放(fang)大，分(fen)相(xiang)(xiang)(xiang)時間短，效果好，其中聚乙(yi)二(er)醇(chun)(chun)(chun)相(xiang)(xiang)(xiang)為(wei)上(shang)相(xiang)(xiang)(xiang)，無機(ji)鹽相(xiang)(xiang)(xiang)為(wei)下相(xiang)(xiang)(xiang)，藻蛋(dan)白主要分(fen)布(bu)在聚乙(yi)二(er)醇(chun)(chun)(chun)相(xiang)(xiang)(xiang)中；

4）將蛋(dan)(dan)白(bai)溶(rong)液(ye)置(zhi)于(yu)截留分子(zi)量為40kda超濾(lv)離心(xin)管中，離心(xin)，冷凍干燥，即為新月藻活(huo)(huo)性(xing)(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)，該步驟可(ke)以在不破壞(huai)活(huo)(huo)性(xing)(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)的前(qian)提下，能有(you)效去除蛋(dan)(dan)白(bai)溶(rong)液(ye)中的聚乙二(er)醇，提高了蛋(dan)(dan)白(bai)的濃度(du)(du)并(bing)且保(bao)證(zheng)蛋(dan)(dan)白(bai)的純度(du)(du)不會減小甚(shen)至有(you)所增加，該蛋(dan)(dan)白(bai)具(ju)有(you)抗(kang)炎活(huo)(huo)性(xing)(xing)、抗(kang)癌(ai)活(huo)(huo)性(xing)(xing)及提高免疫(yi)性(xing)(xing)，能夠清除活(huo)(huo)性(xing)(xing)氧，能通過(guo)驅(qu)除自由(you)基從而表現出(chu)抗(kang)炎活(huo)(huo)性(xing)(xing)，蛋(dan)(dan)白(bai)的促紅細胞(bao)生成素(su)活(huo)(huo)性(xing)(xing)較高，有(you)刺激骨髓造血(xue)的功效，可(ke)用(yong)于(yu)動物的飼料(liao)或養魚餌料(liao)。

實施例3：

新月(yue)藻(zao)(zao)活性(xing)蛋(dan)(dan)白的(de)制(zhi)備(bei)方法，具體步驟(zou)為(wei)(wei)：配(pei)置含水(shui)(shui)率為(wei)(wei)96-98%的(de)藻(zao)(zao)液，加(jia)(jia)入(ru)功(gong)能蛋(dan)(dan)白肽，選用濃度(du)為(wei)(wei)1%的(de)pbs緩沖液作為(wei)(wei)提取溶劑(ji)，在均質壓力為(wei)(wei)24mpa條件下均質3次，然后(hou)經(jing)低溫離(li)(li)(li)心(xin)(xin)機(ji)離(li)(li)(li)心(xin)(xin)；向上(shang)清液中(zhong)加(jia)(jia)入(ru)(nh4)2so4至30%飽和度(du)，靜(jing)止(zhi)，離(li)(li)(li)心(xin)(xin)，即得鹽(yan)析沉(chen)淀物(wu)；將聚(ju)(ju)乙(yi)二(er)醇和酒(jiu)石酸鉀(jia)(jia)鈉(na)配(pei)成ph為(wei)(wei)6.5、聚(ju)(ju)乙(yi)二(er)醇濃度(du)為(wei)(wei)17%、酒(jiu)石酸鉀(jia)(jia)鈉(na)濃度(du)為(wei)(wei)11%的(de)雙(shuang)水(shui)(shui)相(xiang)體系(xi)，加(jia)(jia)入(ru)鹽(yan)析沉(chen)淀物(wu)，磁力攪拌，然后(hou)轉移(yi)至分(fen)液漏斗中(zhong)分(fen)層，上(shang)相(xiang)即為(wei)(wei)蛋(dan)(dan)白溶液；將蛋(dan)(dan)白溶液置于截留(liu)分(fen)子(zi)量為(wei)(wei)20-40kda超(chao)濾離(li)(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)，離(li)(li)(li)心(xin)(xin)，冷凍干(gan)燥(zao)，即為(wei)(wei)新月(yue)藻(zao)(zao)活性(xing)蛋(dan)(dan)白。

本(ben)發(fa)明的操(cao)作(zuo)步(bu)驟中的常規操(cao)作(zuo)為本(ben)領(ling)域技術人員所熟知，在(zai)此不進行贅述。

以上所(suo)述的實(shi)施例對本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的技術方案進(jin)行了詳細說明(ming)(ming)(ming)，應理解(jie)的是(shi)以上所(suo)述僅為本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的具體實(shi)施例，并不(bu)用于限(xian)制本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)，凡在本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的原則范圍(wei)內所(suo)做的任何(he)修(xiu)改(gai)、補(bu)充(chong)或類似方式(shi)替代(dai)等，均應包含在本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的保護(hu)范圍(wei)之內。

sequencelisting

<110>舟山富(fu)晟食品科(ke)技有限公司

<120>新月藻(zao)活性(xing)蛋白的(de)制備方法

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>36

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

hisserhisservalcysvalserhisargglyargcystyrcysarg

151015

cysleuargcysargvalleuhisproglylysleucysvalcysval

202530

asncysserarg

35