煙草ATP synthase內參基因的克隆方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及煙草基因表達過程中所需的一種內參 基因ATPsynthase。
【背景技術】
[0002] 煙草(NicotianatabacumL.)為前科煙草屬，含有尼古丁(Nicotine)的葉用一年 生作物。人類使用煙草大約有1500年的歷史，作為煙草工業的重要原料，將葉片采收后經過 調制、分級、加工處理，制成卷煙、雪茄煙、斗煙、嚼煙及鼻煙等，供人嗜用。煙草是經典的基 因工程研究模式作物之一，然而，在分析煙草基因表達過程中可供選擇的內參基因并不多 見。目前，文獻中報道較多的有GAPDH、EF-la，而在其他植物中廣泛使用的內參基因，在煙草 中并未得到明確的克隆和驗證。同時，由于內參基因的選擇存在不通用性，即不同物種間的 內參基因存在差異性。這就要求在煙草中使用其他植物中的內參基因，要根據實驗要求開 展必要的穩定性評價與鑒定。隨著基因芯片技術越來越成熟，大量的基因芯片數據為新內 參基因的挖掘提供了良好的數據基礎和平臺，為內參基因的選擇提供了更為廣闊的空間。 與傳統同源性比對方法所獲的內參基因相比較，通過基因芯片表達技術篩選到的內參具有 高量表達和穩定表達的特性。
[0003] 實時焚光定量PCR(real-timequantitativereversetranscriptionPCR， qRT-PCR)是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應循環后產物總 量的方法。利用qRT-PCR分析基因表達水平是現在分子生物學中重要的研究手段，qRT-PCR 具有定量準確、靈敏度高和高通量等特點。在qRT-PCR中，對目標基因相對表達量的分析是 通過內參基因的均一化來確定。因此，內參基因的選擇是qRT-PCR的關鍵步驟。一個理想的 內參基因應該是在不同發育階段和不同組織器官中穩定表達，且表達量不受其他外界因 素、實驗處理條件的影響。迄今為止，尚未發現特別理想的內參基因。因此，研究者必須結合 各自的實驗條件和樣品類型來選擇合適的內參基因。
[0004] ATPsynthase是植物細胞能量合成中關鍵的一個酶，在植物細胞生物學代謝過程 中扮演一個基本的重要角色，ATPsynthase基因在植物不同組織器官以及不同生長階段的 高量、穩定表達對植物的生命活動有著重要的意義。ATPsynthase基因在動物中作為內參 基因的研究較多，而在植物中鮮有相關報道。

【發明內容】

[0005]本發明提供煙草ATPsynthase基因序列，可作為煙草內參基因的應用。并同時提 供克隆煙草ATPsynthase基因的特異性引物，建立基于SYBRGreen熒光染料技術的qRT-PCR方法，從而作為煙草ATPsynthase的內參基因，為利用實時熒光定量PCR對煙草基因表 達分析的研究提供有用的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案： 一種煙草ATPsynthase基因序列的克隆方法，通過對煙草不同生長發育時期的99個不 同組織樣本的芯片表達數據分析，篩選出在所有樣品中穩定表達的變異系數(coefficient ofvariation，CV)較小的組成型ATPsynthase基因序列，以引物對ATPsynthase-F/ATP synthase-R進行PCR擴增、獲得陽性克隆，后經質粒測序驗證；其中引物序列如SEQID N0.1/SEQIDN0.2K*。
[0007] 所獲得的目的片段如SEQIDNO.3,大小為681bp。
[0008] 所述PCR擴增的反應程序如下：94°C預變性4min，94°C變性30s，58°C退火30s， 72°C延伸2min，共25個循環，再72°C終延伸10min，4°C保存。
[0009] 本發明還提供一種qRT-PCR擴增ATPsynthase基因部分序列的方法，以ATP synthase的基因序列為基礎，按照qRT-PCR引物設計的原則設計出一對熒光定量特異引物。 以煙草不同生長發育時期、不同組織器官以及不同激素處理條件下的20個樣本的cDNA為模 板，利用半定量PCR評估ATPsynthase基因表達水平的穩定性和可靠性之后，進一步進行實 時熒光定量PCR擴增，熒光染料為SYBRGreen，其中qRT-PCR的定量引物，其序列如SEQID N0.4/SEQIDN0.5K*。
[0010] 所述的qRT-PCR擴增反應程序如下：在95°C預變性10min，先運行40個循環再95°C 變性15s，60°C退火30s，然后為檢測PCR擴增基因的特異性，在PCR反應之后運用溶解曲 線，擴增溫度以〇.5°C的增幅從65°C緩慢遞增到95°C，每個增幅的時間為5s。
[0011] 本發明的有益效果在于： 1. 本發明首次克隆到煙草ATPsynthase基因，其穩定性和特異性經由半定量PCR和實 時熒光定量PCR檢測和驗證； 2.ATPsynthase基因不僅在煙草不同組織器官、不同生長發育階段的組織中穩定表 達，而且能夠在各種激素處理條件下亦穩定表達。ATPsynthase基因穩定表達的特性，為 煙草不同發育階段、不同組織器官、不同激素處理相關基因表達的定量研究提供了新的高 可信度的內參基因； 3. 經實驗驗證，本發明所設計的用于熒光定量PCR檢測的引物亦可用于半定量PCR快速 檢測，且擴增特異性和穩定性良好。
【附圖說明】
[0012]圖1:本發明中煙草ATPsynthase基因擴增的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 其中：]\C%BM2000Marker，l為煙草ATPsynthase基因； 圖2:本發明的ATPsynthase基因在煙草不同生長發育階段、不同組織器官中PCR擴增 的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖3:本發明的ATPsynthase基因在煙草不同激素處理條件PCR擴增的1%瓊脂糖凝膠電 泳圖； 圖4:本發明中ATPsynthase基因實時熒光定量PCR擴增曲線圖； 圖5:本發明中ATPsynthase基因實時熒光定量PCR擴增的溶解曲線圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，這些實施例僅用于說明本發明而不用 于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件。
[0014]實施例1.煙草ATP synthase基因的克隆 1.1煙草總RNA提取： 取約100mg煙草新鮮組織，在液氮中迅速研磨成粉末，加入相應量BB6(每lmLBB6，加10μ L0-疏基乙醇，現用現配），禍旋劇烈振蕩混勾；室溫孵育3min后，12000g離心2-5min，小心 吸取離心管中的上清至RNase-free的離心管中；向上清中加入0.5倍體積無水乙醇，并禍旋 徹底混勻，分散沉淀，再將得到的溶液和沉淀一起加入離心柱中，以12000g離心30s，棄掉流 出液后，加500ULCB6，室溫12000g離心30s，棄掉流出液；向離心柱中央加入80yL的DNasel 工作液，室溫放置15min，重復該步驟一次，以除去基因組DNA;加500燦WB6，12000g離心 30s，棄掉流出液;再12000g離心2min，徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜置數分鐘，徹底晾干 離心柱后，加50yLRNase-freeH2O在離心柱的中央，室溫靜置lmin，12000g離心2min，洗脫 RNA。將luL原始樣品稀釋10倍或100倍后，取5nL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整 性檢測。并取lyLRNA用微量紫外分光光度計(NanoDrop2000)測定RNA樣品的純度和濃度值。 將合格樣品置于_8〇°C保存待用。
[0015] 1.2PCR擴增引物序列 ATP synthase的上游引物如SEQ ID NO. 1所示；ATP synthase的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
[0016]根據基因芯片表達分析所得到的在不同生長發育時期組織樣本中穩定表達、且變 異系數較小的ATPsynthase基因，用Primer5.0軟件設計該擴增引物，最后由北京六合華 大基因科技股份有限公司合成。
[0017] 1.3 反轉錄(RT) 以煙草總RNA為模板，在25uL的反轉錄體系設置和反應過程中依次加入以下試劑:2.0ygRNA，1.5yL01igo(dT)Primer(20ymol/L)，再加RNase-freeH2O至 14yL;70°C溫浴6min 后，迅速將離心管放入冰浴中，再依次加入5.0仙的M-MLV5XBuffer，1.0yL的M-MLV逆轉 錄酶，l.OyL的RNaseinhibitor和4.0yLdNTPMixture，混勾后，42°C溫育75min，加水稀 釋5倍后，-20°C保存。
[0018] 1.4聚合酶鏈式反應(PCR) 以步驟1.3得到的cDNA為模板，以步驟1.2中獲得的序列為引物進行PCR擴增。PCR采用 以下25μ1反應體系：50ng