一種長循環和靶向協同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制作方法
【專利摘要】一種長循環和靶向協同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體，由粒徑為30-200nm且均勻分布的復合膠束組成，所述復合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物組成，包括一種親水端帶有靶向基團修飾的pH響應性的雙親性嵌段共聚物和一種為親水端為PEG的雙親性嵌段共聚物，該復合膠束在pH7.4下為核-殼結構，核層由雙親性嵌段共聚物的疏水端組成，殼層為PEG和靶向基團修飾的pH響應性的親水端混合組成。本發明的優點：該藥物載體表面結構可通過改變不同嵌段共聚物比例靈活調控，靶向基團針對腫瘤細胞具有特異性靶向作用，藥物載體具有響應性釋放能力，生物相容性較好，并具有生物可降解性；制備工藝簡單、易于操作。
【專利說明】一種長循環和祀向協同的多功能抗腫瘤祀向納米藥物載體

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥和納米醫學【技術領域】，特別是一種長循環和靶向協同的多功 能抗腫瘤祀向納米藥物載體。

【背景技術】
[0002] 癌癥是一種影響人類健康的惡性疾病，近三十年來，世界癌癥發病率以每年3-5% 的速度增加，嚴重危害著人們的身心健康。目前腫瘤的治療策略是以化療、手術切除、放療 和生物治療等手段的綜合治療。其中藥物化療是治療腫瘤的主要手段之一，所用的抗腫瘤 化療藥物仍以小分子細胞毒性藥物為主，給藥后這些藥物在體內分布廣泛。同時，絕大多數 抗腫瘤藥物是疏水的，靜脈給藥后能夠到達的腫瘤組織的很少，很多在肝、脾等健康器官和 組織中分布，導致在治療腫瘤的同時對機體正常組織也產生嚴重的毒副作用。如何提高化 療藥物對腫瘤組織的選擇性，減少其在正常組織的分布，降低其毒副作用，提高藥物生物利 用度是提高抗腫瘤化療藥物療效的關鍵。
[0003] 納米藥物載體在輸送藥物過程中面臨諸多的障礙，靶向腫瘤的藥物輸送是一個體 內5步串聯的過程：1)在血液循環系統中保留較長時間（血液屏障），以實現2)腫瘤組織 中的高效富集（EPR效應），3)在腫瘤組織滲透到各個部分以到達所有腫瘤細胞，4)能夠快 速進入腫瘤細胞，并5)在胞內將藥物快速釋放。然而，對于多功能的納米藥物載體，每一新 的功能勢必增加了體系的復雜性并帶來新的問題，并且不同特定功能之間往往會產生一定 的矛盾。例如，一些藥物載體表面修飾親水性較好的聚合物以避免網狀內皮系統的快速清 除，獲得較好的長循環性能并提高腫瘤部位的富集量。但是，研究表明，這些載體不易被腫 瘤細胞內吞，降低腫瘤治療效果。與此同時，一些具有良好應用前景的靶向藥物載體具有良 好的腫瘤細胞內吞能力，然而長循環及腫瘤部位的高效富集難以實現，此外，對于一些表面 修飾了靶向基團如c(RGDfK)的納米粒子，c(RGDfK)直接暴露在納米粒子表面，易于血液中 的調理素相互作用，使得納米粒子在調理素作用下，促使其被網狀內皮系統快速清除，并可 能會引起免疫反應，大大降低了抗腫瘤療效。
[0004] 目前解決長循環和細胞內吞的研究主要集中表面聚乙二醇（PEG)可脫離的納米 載體。這種納米藥物載體在血液循環過程中，在PEG的屏蔽作用下，載體材料可以在一定程 度上避免體內網狀內皮系統的快速清除，提高了血液循環時間。同時，在EPR效應發揮作用 后，載體材料進入腫瘤組織，在腫瘤組織微環境如弱酸性、過度表達的酶類等響應性刺激 下，PEG響應性脫除，從而發生電荷轉變或暴露出的靶向于腫瘤細胞的靶向基團，提高細胞 內吞能力。盡管如此，目前大部分的PEG脫殼研究仍然處于細胞水平，體內的驗證還沒有實 現。同時，脫殼過程及脫殼機理較為復雜，適用范圍較窄。因此，為解決長循環和細胞內吞 的矛盾，需要發展新型具有協同作用的納米藥物載體系統，提高抗腫瘤治療效果。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是針對現有技術中存在不足，提供一種長循環和靶向協同的多功能 抗腫瘤靶向納米藥物載體，該藥物載體保留了表面PEG修飾及表面結構所帶來的長循環性 能，同時可有效提1?腫瘤細胞攝取能力，有效提1?抗腫瘤治療效果。
[0006] 本發明的技術方案：
[0007] -種長循環和祀向協同的多功能抗腫瘤祀向納米藥物載體，由粒徑為30_200nm 且均勻分布的復合膠束組成，所述復合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物通過在水溶液中自 組裝形成，其中一種雙親性嵌段共聚物為聚乙二醇-b_聚環己內酯（PEG-b-PCL)，其親水 端為聚乙二醇（PEG)、疏水端為聚環己內酯（PCL)，另一種雙親性嵌段共聚物為聚環己內 酯-b-聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ (PCL-b-PAE-c (RGDfK)]，式中 c (RGDfK)為短鏈環肽[其氨基 酸序列為cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其親水端為帶有祀向基團修飾且具有pH響應 的端基為c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦為聚環己內酯（PCL)，上述兩 種雙親性嵌段共聚物的疏水端的分子量為2-10kDa(千道爾頓）且相差< 5kDa ;所述復合 膠束在PH7. 4水溶液中為核-殼結構，其中核為疏水端聚環己內酯（PCL)，殼層為聚乙二醇 (PEG)和PAE-c(RGDfK)的復合殼層。
[0008] -種所述長循環和靶向協同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制備方法，包括 如下步驟：
[0009] 1)聚乙二醇-b-聚環己內酯（PEG2k-b-PCL)的合成
[0010] 以端羥基聚乙二醇（CH3〇-PEG45-〇H)為引發劑，以辛酸亞錫[Sn(0ct) 2]為催化劑， 以ε -己內酯（ε -CL)為單體，開環聚合制備，具體方法是：將干燥處理過的端羥基聚乙二 醇和減蒸處理過的ε -CL溶于重蒸過的無水甲苯中，加入Sn (Oct)2，依次進行液氮冷凍、抽 真空、通氮氣、解凍，重復三次，ll〇°C油浴中反應12h，反應后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷 溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽濾洗滌后，將固體產物置于真空烘箱中干燥，即可得到 白色固體聚乙二醇-b_聚環己內酯（PEG 2k-b-PCL);
[0011] 2)聚環己內酯-b-聚 β 氨酯-C (RGDfK) [PCL-b-PAE-c (RGDfK)]的合成
[0012] 利用開環聚合和邁克爾加成反應通過連續反應制備，具體方法是：將叔丁氧羰 基氨基乙醇（B0C-NH-C 2H40H)和減蒸過的ε -己內酯（ε -CL)混合，加入重蒸過的甲苯溶 解，加入辛酸亞錫[Sn (Oct) 2]，依次進行液氮冷凍、抽真空、通氮氣、解凍，重復三次，然后在 110°C油浴中反應12h，反應后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉 淀，抽濾洗滌后，將固體產物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-0H ;
[0013] 將上述PCL-0H、三乙胺（TEA)和重蒸后的二氯甲烷混合均勻得到混合液a，然后 將丙烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均勻得到混合液b，將混合液b在氬氣氛圍 下逐滴緩慢滴入到混合液a中，滴加完畢后封閉反應體系，緩慢升至室溫，在氬氣氛圍下反 應12h后，萃取反應液，用飽和碳酸鈉溶液、0. lmol/L的鹽酸溶液和純水分別洗滌至少三 次，取有機相，用無水硫酸鎂干燥8-10h，抽濾，旋蒸濃縮后在冰乙醚中沉淀，靜置8-10h后 抽濾，用無水乙醚洗滌后，將固體置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳雙鍵功能化的 PCL-A ；
[0014] 將上述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)和4, f -三亞甲基-二哌啶 (TDP)混合后，加入氯仿溶解，55°C油浴中反應，72h后，在反應液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰 亞胺（NAS)，繼續反應12h，封端并終止反應，即可得到黃色固體PCL-b-PAE-NAS ;
[0015] 將上述PCL-b-PAE-NAS和短鏈環肽[c (RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合 溶劑，然后加入三乙胺（TEA)，30°C下攪拌反應8-10h，反應液旋蒸除去氯仿，在超純水中透 析，透析袋截留分子量為12_14k Da，每天換水四次，透析三天后，冷凍干燥，即可制得聚環 己內酯-b_ 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [PCL-b-PAE-c (RGDfK)];
[0016] 3)室溫下分別將步驟1)和2)中所得到的兩種嵌段共聚物PCL-b-PAE-c (RGDfK) 和PEG-b-PCL分別溶解在有機溶劑氯仿中，得到兩種聚合物溶液，這兩種溶液的濃度均為 2mg/mL ;另外將阿霉素鹽酸鹽加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素鹽酸鹽中的鹽酸，制 得濃度為2mg/mL的阿霉素溶液；
[0017] 4)將步驟3)中制備得到的兩種聚合物溶液和阿霉素溶液按照體積比為1 :1 :1均 勻混合，得到混合溶液；
[0018] 5)將上述混合溶液在超聲攪拌下逐滴加入到pH為4. 0、濃度為l(T4m〇l/L的鹽酸 中，滴加完全后，在35°C下劇烈攪拌揮發至有機溶劑基本揮發完全，然后在室溫下旋蒸至完 全除去未揮發干凈的有機溶劑，加入濃度為0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至7. 4,在超 純水中透析，所用透析袋截留分子量為12-14kDa，透析兩天后，經超濾離心濃縮，即可制得 所需濃度的負載阿霉素的納米藥物載體（載藥膠束RMSM-D0X)。
[0019] 所述步驟1)中端羥基聚乙二醇、ε -己內酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷和冰乙醚 的用量比為 2. 0g :5. 0g :20mL :50 μ L :20mL :200mL。
[0020] 所述步驟2)中B0C-NH-C2H40H、ε -己內酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷和冰乙醚的 用量比為0. lg :3. 5g :10mL :50μ L :5mL :50mL ;所述混合液a中PCL-0H、三乙胺與二氯甲烷 的用量比為2. 5g :0. 25g :5mL ;混合液b中丙烯酰氯與二氯甲烷的用量比為0. 18g :10mL ; 混合液a與混合液b的質量比7:10 ;所述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)、 4，f -三亞甲基-二哌啶（TDP)、氯仿和4，f -三亞甲基-二哌啶（TDP)的用量比為 0. 5g :0. 68g :0. 69g :10mL :0. 305g ;所述DMF與氯仿混合溶劑中DMF-氯仿的體積比3:2 ; PCL-b-PAE-NAS、c (RGDfK)、DMF-氯仿混和溶劑和 TEA 的用量比為 80mg :16mg :5mL :200 μ L。
[0021] 本發明的合成路線如下所示：
[0022]

【權利要求】
1. 一種長循環和靶向協同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體，其特征在于：由粒徑為 30-200 nm且均勻分布的復合膠束組成，所述復合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物通過在水 溶液中自組裝形成，其中一種雙親性嵌段共聚物為聚乙二醇聚環己內酯（PEG4-PCL)， 其親水端為聚乙二醇（PEG)、疏水端為聚環己內酯（PCL)，另一種雙親性嵌段共聚物為聚環 己內酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [(PCL-6-PAE-c (RGDfK)]，式中 c (RGDfK)為短鏈環肽[其 氨基酸序列為cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其親水端為帶有祀向基團修飾且具有pH 響應的端基為c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦為聚環己內酯（PCL)，上述 兩種雙親性嵌段共聚物的疏水端的分子量為2-10 kDa (千道爾頓)且相差< 5 kDa ;所述復 合膠束在pH 7. 4水溶液中為核-殼結構，其中核為疏水端聚環己內酯（PCL)，殼層為聚乙二 醇（PEG)和PAE-c (RGDfK)的復合殼層。
2. -種如權利要求1所述長循環和靶向協同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制 備方法，其特征在于包括如下步驟： 1) 聚乙二醇聚環己內酯（PEG2k4-PCL)的合成 以端羥基聚乙二醇（CH3〇-PEG45-〇H)為引發劑，以辛酸亞錫[Sn(0ct) 2]為催化劑，以 f -己內酯U -CL)為單體，開環聚合制備，具體方法是：將干燥處理過的端羥基聚乙二醇 和減蒸處理過的f -CL溶于重蒸過的無水甲苯中，加入Sn (Oct) 2，依次進行液氮冷凍、抽真 空、通氮氣、解凍，重復三次，110 ° C油浴中反應12 h，反應后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲 烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽濾洗滌后，將固體產物置于真空烘箱中干燥，即可得 到白色固體聚乙二醇聚環己內酯（PEG 2k4-PCL); 2) 聚環己內酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ PCL-6-PAE-c (RGDfK)]的合成 利用開環聚合和邁克爾加成反應通過連續反應制備，具體方法是：將叔丁氧羰基氨基 乙醇（B0C-NH-C2H40H)和減蒸過的f -己內酯U -CL)混合，加入重蒸過的甲苯溶解，加入 辛酸亞錫[Sn(0ct)2]，依次進行液氮冷凍、抽真空、通氮氣、解凍，重復三次，然后在110 ° C 油浴中反應12 h，反應后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽 濾洗滌后，將固體產物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-0H ; 將上述PCL-0H、三乙胺（TEA)和重蒸后的二氯甲烷混合均勻得到混合液a，然后將丙 烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均勻得到混合液b，將混合液b在氬氣氛圍下逐滴 緩慢滴入到混合液a中，滴加完畢后封閉反應體系，緩慢升至室溫，在氬氣氛圍下反應12 h 后，萃取反應液，用飽和碳酸鈉溶液、〇. 1 mol/L的鹽酸溶液和純水分別洗漆至少三次，取有 機相，用無水硫酸鎂干燥8-10 h，抽濾，旋蒸濃縮后在冰乙醚中沉淀，靜置8-10 h后抽濾，用 無水乙醚洗滌后，將固體置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳雙鍵功能化的PCL-A ; 將上述PCL-A、己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)和4，f -三亞甲基-二哌啶（TDP) 混合后，加入氯仿溶解，55 ° C油浴中反應，72 h后，在反應液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰亞 胺（NAS)，繼續反應12 h，封端并終止反應，即可得到黃色固體PCL4-PAE-NAS ; 將上述PCL4-PAE-NAS和短鏈環肽[c (RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合溶劑， 然后加入三乙胺（TEA)，30 ° C下攪拌反應8-10h，反應液旋蒸除去氯仿，在超純水中透析， 透析袋截留分子量為12_14k Da，每天換水四次，透析三天后，冷凍干燥，即可制得聚環己內 酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ PCL-6-PAE-c (RGDfK)]; 3) 室溫下分別將步驟1)和2)中所得到的兩種嵌段共聚物PCLi-PAE-c (RGDfK)和 PEG4-PCL分別溶解在有機溶劑氯仿中，得到兩種聚合物溶液，這兩種溶液的濃度均為2 mg/mL ;另外將阿霉素鹽酸鹽加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素鹽酸鹽中的鹽酸，制 得濃度為2 mg/mL的阿霉素溶液； 4) 將步驟3)中制備得到的兩種聚合物溶液和阿霉素溶液按照體積比為1 :1 :1均勻混 合，得到混合溶液； 5) 將上述混合溶液在超聲攪拌下逐滴加入到pH為4. 0、濃度為ΚΓ4 mol/L的鹽酸中， 滴加完全后，在35 ° C下劇烈攪拌揮發至有機溶劑基本揮發完全，然后在室溫下旋蒸至完 全除去未揮發干凈的有機溶劑，加入濃度為0. 1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至7. 4,在超 純水中透析，所用透析袋截留分子量為12-14 kDa，透析兩天后，經超濾離心濃縮，即可制得 所需濃度的負載阿霉素的納米藥物載體(載藥膠束RMSM-D0X)。
3. 根據權利要求2所述長循環和靶向協同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制備 方法，其特征在于：所述步驟1)中端羥基聚乙二醇、f -己內酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷 和冰乙醚的用量比為 2.0 g:5.0 g :20 mL:50 yL:20 mL:200 mL。
4. 根據權利要求2所述長循環和靶向協同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制備 方法，其特征在于：所述步驟2)中B0C-NH-C 2H40H、f -己內酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷和 冰乙醚的用量比為0. 1 g :3. 5 g :10 mL :50 μ L :5 mL :50 mL ;所述混合液a中PCL-0H、三 乙胺與二氯甲烷的用量比為2.5 g :0.25 g:5 mL;混合液b中丙烯酰氯與二氯甲烷的用量 比為0. 18 g : 10 mL ;混合液a與混合液b的質量比7:10 ;所述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二 丙烯酸酯（HDD)、4,4，-三亞甲基-二哌啶（TDP)、氯仿和4,4'-三亞甲基-二哌啶（TDP) 的用量比為0.5 g :0.68 g :0.69 g:10 mL :0.305 g;所述DMF與氯仿混合溶劑中DMF-氯仿 的體積比3:2 ; PCL4-PAE-NAS、c(RGDfK)、DMF-氯仿混和溶劑和TEA的用量比為80 mg : 16 mg :5 mL :200 μ L〇
【文檔編號】C08G63/664GK104055751SQ201410241636
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月3日 優先權日:2014年6月3日
【發明者】史林啟, 高紅軍, 程堂劍, 馬如江, 安英麗 申請人:南開大學