荔枝細胞壁酸性轉化酶基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物技術領域，更具體地，涉及荔枝細胞壁酸性轉化酶基因及其 應用。
【背景技術】
[0002] 蒸枝（LitchichinensisSonn.)是我國重要的南方熱帶亞熱帶果樹，種植資源十 分豐富，具有很高的食用價值和營養價值，可食部分為假種皮，可食率因為品種的不同而有 著很大的差別。果實中核（即種子）大是影響荔枝果實品質的突出問題之一，荔枝的種胚 敗育即"焦核"是荔枝果實發育過程中常見的一種遺傳現象，焦核果可食率高，口感也比大 核果好，焦核率是評估荔枝品質的一個非常重要的指標。
[0003]目前栽培的優質荔枝品種如廣東的糯米糍、桂味，福建的蘭竹、綠荷包，廣西的靈 山香荔等，均以焦核為特征。然而，迄今為止學界對荔枝種胚敗育的機制研究尚停留在組織 結構觀察和生理生化變化的層面上，種胚敗育的內在分子機制還沒有完全清楚。
[0004] 胚胎發育的任一方面，如花粉、胚囊、胚和胚乳等發育過程受阻都可能引起種子敗 育。在荔枝種子的發育過程中，糖分不能在胚乳中正常代謝和積累與其敗育有著重要的聯 系，現有研究中細胞壁酸性轉化酶活性與玉米、蠶豆、大麥、大米以及番茄等植物種類種子 發育呈正相關，缺少細胞壁酸性轉化酶的表達降低了玉米和大米種子的貯藏物質儲存過 程，番茄細胞壁酸性轉化酶抑制物基因沉默后（即增加CWAI活性），番茄種子的尺寸變大。 Wang和Ruan通過對棉花GhCWINl在種子發育早期的時空表達模式研究，發現GhCWINl基因 在胚乳的早期發育階段（游離核時期）起重要作用。這些研究都說明了細胞壁酸性轉化酶 在種子發育過程中有著的重要的作用。申請人通過前期研究發現荔枝的種胚發育與荔枝中 的酸性轉化酶相關，但現有技術中還沒有克隆出荔枝相關酸性轉化酶基因，荔枝種胚研究 機制無法在分子機制層面展開。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供荔枝細胞壁酸 性轉化酶基因。
[0006] 本發明的第二個目的是提供上述酸性轉化酶基因的應用。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：
[0008]荔枝細胞壁酸性轉化酶基因LcCWAIl，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5， 其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~5所示。
[0009] 所述荔枝細胞壁酸性轉化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4， LcCWAI5所編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:6~10所示。
[0010] 本發明還提供用于擴增所述荔枝細胞壁酸性轉化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2， LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5 的引物，其引物序列如SEQIDNO:11 ~20 所示。
[0011] 本發明還提供含有權利要求1所述荔枝細胞壁酸性轉化酶基因LcCWAI1，LcCWAI 2,LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5 的表達載體。
[0012] 申請人通過基因沉默表達的方法，對荔枝細胞壁酸性轉化酶基因LcCWAI1， LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的功能進行了驗證，發現沉默表達荔枝細胞壁酸 性轉化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4,LcCWAI5能夠引起荔枝種胚敗 育，從而提尚森枝焦核率。
[0013] 因此，本發明還保護所述基因或所述表達載體在提高荔枝焦核率方面的應用。
[0014] 本發明還保護所述基因或所述表達載體在制備提高荔枝焦核率的制劑方面的應 用。
[0015] 優選地，所述應用是構建LcCWAI1，LcCWAI2,LcCWAI3,LcCWAI4 或LcCWAI5 的 沉默表達載體，轉化農桿菌獲得農桿菌工程菌，以所述農桿菌工程菌作為浸染液浸染荔枝 植株。
[0016] 更優選地，所述農桿菌工程菌的0D6。。為0· 7~1. 4。
[0017] 更優選地，所述荔枝植株為盛花期的植株或花后3周前內結有幼果的植株。
[0018] 優選地，所述荔枝品種為黑葉、白荔、早紅、馬貴荔等大核品種。
[0019] 優選地，所述浸染荔枝植株的方式為噴灑、浸沒、注射。
[0020] 更優選地，對于不同的荔枝品種，所述浸染液的浸染方式有所不同，例如，可以在 荔枝盛花期浸染花穗，也可以通過注射的方式將浸染液注射入荔枝果柄或種柄。
[0021] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0022] 本發明首次克隆出5荔枝細胞壁酸性轉化酶基因，分別命名為LcCWAI1、LcCWAI 2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,長度分別為 1713bp、1722bp、1734(1758)bp、1677bp和 1740bp，編碼的氨基酸數目分別為570、573、577 (585)、558、579個；通過基因沉默技術證 明，沉默所述酸性轉化酶基因能夠提高荔枝焦核率，在生產上有著廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0023]圖1為部分荔枝組織RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道1~4為荔枝葉片 樣品，泳道5~8為蒸枝種皮樣品，泳道9~12為蒸枝種柄樣品，泳道13~14為蒸枝花的 樣品，泳道15~16為荔枝種仁樣品。
[0024] 圖2荔枝和其他植株種類CWAI基因進化樹分析。
[0025]圖3為荔枝LcCWAIs擴增結果；其中，S代表擴增序列（sequence)，Μ代表DNA長 度標記（Marker)。
[0026] 圖4為荔枝LcCWAIs在不同品種間的單核苷酸突變，其中，HY:黑葉；NMC:懦米糍； FZX:妃子笑。
[0027] 圖5為LcCWAIs氨基酸序列與其他物種的同源性比較。
[0028] 圖6為LcCWAIs蛋白的3D結構模型㈧和功能位點預測（B);圖6A和圖6B按順 序從左到右依次是LcCWAI1、LcCWAI2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5 編碼的蛋白。
[0029] 圖7為LcCWAIs不同組織的表達；數據點上的線段為標準誤（η= 3)。
[0030] 圖8為TRVl(a)和TRV2(b)結構示意圖；其中，RdRP為RNA依賴的RNA聚合酶；16K 為富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp為運動蛋白；Cp為衣殼蛋白；MCS為多克隆位點。
[0031] 圖9為不同濃度菌液種柄和果柄注射對"黑葉"和"白荔"種胚發育的影響，其中， ODOO. 7 是 0D6QQ= 0. 7,其它類似。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語 與本領域技術人員熟悉的意義相同。
[0033] 實施例1酸性轉化酶基因篩選和克隆
[0034] 一、荔枝樣品RNA的提取以及質量檢測
[0035] 采用華越洋超快型RNA提取試劑盒（具體方法參照說明書）對"妃子笑"、"黑葉" 和"糯米糍"蒸枝的葉片、花、果皮、果蒂、種皮、種仁等組織的RNA進行提取，RNA的濃度用紫 外核酸蛋白檢測儀，取1μ1測定260nm與280nm的比值，若介于1. 80~2. 00之間則可以 進行下一步實驗。如果RNA濃度較高，可以稀釋一定倍數后檢測。
[0036] 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1，可以看出RNA呈現出清晰的28S和18S兩條帶， 并且28S的亮度是18S的兩倍左右，沒有拖尾現象，無DNA污染。表明提取的RNA質量比較 高，無明顯降解，滿足后續實驗的需要。
[0037] 二、細胞壁酸性轉化酶基因的篩選和聚類分析
[0038] 根據荔枝基因組測序結果，調出注釋為Cellwallinvertase的相關基因（一共 14個），經NCBI比對（與其他物種中相關酸性轉化酶基因比對）和生物信息學分析軟件分 析，利用MEGA5進行聚類分析后刪除同源性較差的個別成員，用生物信息學在線分析網站 Smart工具（//smart.embl-heidelberg.de/)刪除掉一些不具備完整功能或者基因 組注釋錯誤的成員，最后篩選出5個結構完整，與細胞壁酸性轉化酶的氨基酸保守功能域 一致的基因LcCWAIs(表1，轉化酶基因Genbank分類號見表2)，分別為LcCWAI1、LcCWAI 2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,對荔枝和5個其他品種已報道的CWAI、SAI和細胞質中 性/堿性轉化酶（NI)基因用MEGA5進行聚類分析（圖2)，可以看出基因LcCWAIs大致聚 成三類，NI基因聚成一類，液泡酸性轉化酶聚成一類，CWAI的5