一種人重組Irisin蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域中重組基因的可溶性表達和純化方法，特別設及人 Irisin蛋白的原核表達和純化方法。
【背景技術】
[0002] Irisin是2012年年初由Spiegelman實驗室在《自然》雜志上報道的一種新 的肌肉因子，是蛋白水解酶剪切III型纖連蛋白組件包含蛋白5(fibronectintypeIII domain-containingprotein5，FNDC5)后形成的可分泌多膚片段。人FND巧的N-端有 一個信號序列，中間為III型纖連蛋白結構域（FND)，緊接其后的為疏水氨基酸區和C-末端。 Irisin是FND巧中纖連蛋白結構域的主要部分，是由112個氨基酸殘基組成的N-糖基化蛋 白質激素，其序列在種屬間高度保守，人和小鼠的Irisin氨基酸序列同源性為100%。
[0003] 發現者用希臘神話中信使女神Iris的名字為Irisin命名，暗喻其像Iris-樣， 作為骨骼肌的使者，傳遞骨骼肌的信號，并連接骨骼肌與外周組織的關系。Irisin最重要的 生物學功能是通過內分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪細胞，使后者轉變為具 有分解代謝脂肪特征的棟色脂肪細胞，W產熱的方式消除白色脂肪，從而起到減肥作用。研 究表明，尊尾素水平主要反映了肌肉質量，且在年輕的男性運動員中其量高于老年女性；另 有研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且與新發II型糖尿病的發 病率呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中發揮關鍵作用；此外，有關報道還 指出Irisin與非酒精性脂肪肝、屯、率衰竭等病理現象存在一定的相關性。
[0004] 可W看出Irisin必將是一個很有前景的活性因子，并成為代謝性疾病及其并發 癥防治的新祀點，有非常大的潛在價值。因此，開發Irisin蛋白的可大規模生產并便于純 化的方法，具有非常大的價值。

【發明內容】

[00化]發明目的：本發明的第一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白的DNA序列。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種人Irisin重組蛋白。
[0007] 本發明的又一個目的是提供含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表 達載體、轉基因細胞系統或轉基因重組菌。
[0008] 本發明的又一個目的是提供一種轉基因重組菌。
[0009] 本發明的又一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白的制備方法。
[0010] 本發明的又一個目的是提供一種人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應 用。
[0011] 技術方案：為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供一種人Irisin重組蛋白 的DNA序列，其堿基序列如SEQIDNO:1所示。 陽01引一種人Irisin重組蛋白，其氨基酸序列如沈QIDNO:2所示。
[0013] 含有所述的人Irisin重組蛋白的DNA序列的重組表達載體、轉基因細胞系統或轉 基因重組菌。
[0014] 將所述的DM序列插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達人Irisin重組蛋白的 DNA的重組表達載體。
[0015] 其中，所述大腸桿菌表達載體為祀T-30a(+)。
[0016] 一種轉基因重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選 得到轉基因重組菌。
[0017] 所述的DNA序列、重組表達載體、轉基因細胞系統或轉基因重組菌在生產人 Irisin重組蛋白中的應用。
[0018] 一種人Irisin重組蛋白的制備方法，包括W下步驟：
[0019] 1)從人肌肉組織中提取總RNA并做反轉錄PCR得到其cDNA，WcDNA為模板，PCR 得到人Irisin的基因片段，其堿基序列如SEQIDNO:1所示；
[0020] 2)構建祀T30a-Irisin原核表達載體；
[0021] 3)構建Rosetta-pET-30a-I;risin原核表達菌株；
[0022] 4)人Irisin重組蛋白的誘導表達、純化及鑒定。
[0023] 一種所述的人Irisin重組蛋白在制備代謝性疾病藥物的應用。
[0024] 有益效果：本發明相對于現有技術，具有W下優點：本發明所提供的方法步驟簡 便，生產成本低，生產周期短，通過本發明所提供的方法，可得到純度較高的特異性目的蛋 白。其最主要優勢在于：本發明首次W原核表達體系實現了人Irisin蛋白的可溶性表達， 并且，在用儀柱純化蛋白的過程中通過咪挫梯度洗脫及抑梯度洗脫，確定了目的蛋白的最 佳洗脫條件，可得到高純度的目的蛋白。
【附圖說明】 陽0巧]圖1 :祀T-30a-Irisin載體酶切檢驗瓊脂糖電泳分析圖（M為DL5000DNAMaker;1 為經Ndeiahol雙酶切的祀T-30a-Irisin載體；2為未經酶切的祀T30a-Irisin載體。可 初步判斷祀T-30a-Irisin載體成功構建。）
[0026]圖 2 :Rosetta-pET-30a-Irisin菌株IPTG梯度誘導SDS-PAGE電泳分析圖（M為 PremixedProteinMarker;圖中1所用IPTG誘導劑濃度為OmM;2所用IPTG誘導劑濃度為 0.ImM;3所用IPTG誘導劑濃度為0. 2mM;4所用IPTG誘導劑濃度為0. 4mM;5所用IPTG誘 導劑濃度為0. 6mM;6所用IPTG誘導劑濃度為0. 8mM;7所用IPTG誘導劑濃度為1.OmM;可 看出14KDa左右位置有明顯差異，初步判斷目的蛋白有表達）
[0027] 圖3 :Rosetta-pET-30a-I;risin菌株低溫誘導儀柱純化SDS-PAGE電泳分析圖（M 為PremixedProteinMarker;圖中1為誘導菌體；2為誘導菌體裂解上清；3為過柱液；4 為洗涂液I;5為洗涂液II;6為洗脫液；6泳道為純化目的蛋白，其條帶單一且與預測結果 一致，運表明本發明通過純化得到了較高純度的目的蛋白）
[0028] 圖4:人Irisin蛋白原核表達Westernblot分析圖（圖中為14邸a位置特異 性條帶，其中，1為未經IPTG誘導的Rosetta-pET-30a-Irisin菌體；2為經IPTG誘導的 Rosetta-pET-30a-I;risin菌體；3 為經IPTG誘導的Rosetta-pET-30a-I;risin菌體裂解上 清；4為經儀柱純化的人Irisin原核表達蛋白。結果表明，目的蛋白成功表達。）
[0029] 圖5 :BCA蛋白濃度測定標準曲線。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1 :構建人Irisin蛋白的原核表達質粒和菌株
[0031] 1.從人肌肉組織中的到Irisin的目的基因
[0032] 從人肌肉組織中提取總RNA并做反轉錄PCR得到其cDNA。根據相關文獻報道 及NCBI網上公布Irisin基因序列（NM_153756)設計引物，W上述得到的cDNA為模板，做 PCR得到人Irisin的基因片段。把上述人Irisin基因插入到PMD19-T載體中。命名為 pMD19-T-Irisin，并測序確定正確獲取目的基因。
[0033] 2.構建祀T30a-Irisin原核表達載體
[0034] 跟據人Irisin基因序列設計引物，其中上游帶有Ndel酶切位點，下游帶有化〇1 酶切位點：
[0035]上游引物：5 ' 一TACATATGGACAGTCCCTCAGCCCCA-3 '
[0036]下游引物：5 ' 一CACTCGAGCTCTTTCATGGTTACCTCA-3，
[0037] W步驟1中pMD19-T-Irisin載體為模板，用上述的一對引物進行PCR擴增。 陽03引 PCR體系：