本發明涉及生物技術領域，具體來(lai)說是無血清無蛋白細胞培養基(ji)。

背景技術：

動(dong)物細(xi)胞已被廣(guang)泛用(yong)于重(zhong)組(zu)(zu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)藥物和疫苗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)，培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)是(shi)動(dong)物細(xi)胞大規模(mo)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關鍵技術。用(yong)傳(chuan)(chuan)統(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)細(xi)胞，需(xu)要在傳(chuan)(chuan)統(tong)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)加入5-10％的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)(xue)(xue)清(qing)。血(xue)(xue)(xue)清(qing)價格(ge)昂貴，容(rong)易被病(bing)毒(du)和支原(yuan)體(ti)感染(ran)，每批次間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)量不穩定(ding)，血(xue)(xue)(xue)清(qing)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)含有大量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)，給重(zhong)組(zu)(zu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)細(xi)胞產(chan)(chan)品的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分離純化帶來很大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)困難(nan)(nan)。為了克服以上難(nan)(nan)題，科(ke)學家們(men)對血(xue)(xue)(xue)清(qing)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)各成(cheng)分在細(xi)胞培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究發(fa)現，血(xue)(xue)(xue)清(qing)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)胰島(dao)素(su)(su)，轉鐵(tie)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)和其他(ta)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長因子(zi)是(shi)促進細(xi)胞生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要成(cheng)分，研(yan)(yan)發(fa)出用(yong)胰島(dao)素(su)(su)、轉鐵(tie)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)和其他(ta)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長因子(zi)替代血(xue)(xue)(xue)清(qing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)無(wu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)。由于這些生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長因子(zi)主要是(shi)從血(xue)(xue)(xue)清(qing)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)提取或者是(shi)用(yong)基(ji)(ji)因重(zhong)組(zu)(zu)技術生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，價格(ge)昂貴，每批次間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)量也不穩定(ding)，大大地(di)限制了此類無(wu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大規模(mo)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)應(ying)用(yong)。無(wu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)無(wu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)可以避(bi)免(mian)使用(yong)動(dong)物源的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)分，降低生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)成(cheng)本，簡化下游分離純化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)步驟，避(bi)免(mian)外(wai)源傳(chuan)(chuan)染(ran)性海綿狀腦病(bing)，外(wai)源病(bing)毒(du)和外(wai)源支原(yuan)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)污染(ran)，實現大規模(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)應(ying)用(yong)。目前我國也研(yan)(yan)發(fa)出一(yi)些無(wu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)無(wu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)，但這些培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)只(zhi)能支持(chi)低細(xi)胞密度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長，重(zhong)組(zu)(zu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)也比(bi)較低，研(yan)(yan)發(fa)支持(chi)高細(xi)胞密度(du)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長和高重(zhong)組(zu)(zu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)表達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)無(wu)血(xue)(xue)(xue)清(qing)無(wu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)是(shi)目前培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)研(yan)(yan)究領域中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項重(zhong)要課題。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種支持細(xi)胞高細(xi)胞密度生(sheng)(sheng)長的無(wu)(wu)血(xue)清無(wu)(wu)蛋白(bai)成分(fen)界(jie)定(ding)的培養(yang)基；一種支持細(xi)胞高細(xi)胞密度生(sheng)(sheng)長和高重組蛋白(bai)表達的無(wu)(wu)血(xue)清無(wu)(wu)蛋白(bai)培養(yang)基。

為實現上述目的，本發明采用(yong)的技(ji)術方(fang)案是：無血清無蛋白細胞(bao)培養(yang)基，包括氨基酸，維生素(su)，無機鹽和微量元素(su)，碳水化(hua)(hua)合物(wu)(wu)和其它化(hua)(hua)學(xue)物(wu)(wu)的成分，還包括聚胺或者其衍生物(wu)(wu)。

進一步的，所述氨基酸的成(cheng)分及其(qi)在每升培養基中的含量如下：

進一步的，所(suo)述維生素的成分(fen)及其在每升培養基中的含量如下：

進一步的，所(suo)述無機鹽和微量元素(su)的成分及其在每升培(pei)養基中(zhong)的含量如下：

進一(yi)步(bu)的，所述碳水化合物和其(qi)它化學物的成分及其(qi)在每升培(pei)養基(ji)中的含量如下：

進一(yi)步的，所述微量元(yuan)素中(zhong)還含有以下3種(zhong)鋅鹽中(zhong)的任何一(yi)種(zhong)或幾種(zhong)：I.鹽酸(suan)(suan)鋅(ZnCl2)，II.硫酸(suan)(suan)鋅(ZnSO4-7H2O)，III.硝酸(suan)(suan)鋅[Zn(NO3)2-6H2O]，其(qi)在(zai)每升培(pei)養(yang)基中(zhong)的含量分別如下:

ZnCl2 1–100μM

ZnSO4-7H2O 1–100μM

Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM

進一步的，所述微(wei)量元(yuan)素(su)中還含有以下3種螯合鐵(tie)(tie)中的任何一種或幾(ji)種：I.檸(ning)(ning)檬酸鐵(tie)(tie)銨(Ferric ammonium citrate or Ammonium iron(III)citrate)，II.檸(ning)(ning)檬酸鐵(tie)(tie)(Ferric citrate or iron(III)citrate)，III.乙二(er)胺四乙酸鐵(tie)(tie)鈉鹽(yan)(Ethylenediaminetetraacetic acid Iron(III)sodium salt)，其在每(mei)升(sheng)培養(yang)基中的含量分別如下：

檸檬酸鐵(tie)銨 1–500mg/L

檸檬酸鐵(tie) 1–500μM

乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 1–500μM

進一步(bu)的(de)，所(suo)述聚胺(an)或(huo)者其衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)包括以下5種(zhong)聚胺(an)或(huo)者其衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)中的(de)一種(zhong)或(huo)幾種(zhong)：I.L-鳥氨酸(L-Ornithine)或(huo)者其衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)，II.腐胺(an)(Putrescine)或(huo)者其衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)，III.亞精胺(an)(Spermidine)或(huo)者其衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)， IV.精胺(an)(Spermine)或(huo)者其衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)，V.尸(shi)胺(an)(Cadaverine)或(huo)者其衍(yan)生(sheng)(sheng)物(wu)，其在每升培養基(ji)中的(de)含量(liang)分別如下：

進一步的(de)，所(suo)述無血清無蛋白(bai)細胞培養基(ji)中還含有另外(wai)2種聚胺(an)或者(zhe)其(qi)衍(yan)生(sheng)物，胍基(ji)丁胺(an)(Agmatine)或者(zhe)其(qi)衍(yan)生(sheng)物和L-瓜氨酸(L-Citrulline)或者(zhe)其(qi)衍(yan)生(sheng)物，其(qi)在(zai)每(mei)升培養基(ji)中的(de)含量分別如下：

胍基丁胺或(huo)者(zhe)其衍生物 1–1000μM

L-瓜氨酸或者其(qi)衍生物(wu) 1–1000μM

進(jin)一步的(de)，所述(shu)無血清無蛋白細(xi)胞培養基中還含有(you)水(shui)解物(wu)(wu)(wu)，所述(shu)水(shui)解物(wu)(wu)(wu)是酵(jiao)母抽提(ti)物(wu)(wu)(wu)，或(huo)者酵(jiao)母抽提(ti)物(wu)(wu)(wu)和大(da)豆(dou)水(shui)解物(wu)(wu)(wu)的(de)混(hun)合(he)物(wu)(wu)(wu)，或(huo)者酵(jiao)母抽提(ti)物(wu)(wu)(wu)和棉(mian)子水(shui)解物(wu)(wu)(wu)的(de)混(hun)合(he)物(wu)(wu)(wu)。

進一步的(de)，所述酵母(mu)抽提(ti)物(wu)在(zai)(zai)每升培(pei)(pei)(pei)養基中(zhong)(zhong)的(de)含量為(wei)1–8g，所述酵母(mu)抽提(ti)物(wu)和(he)大(da)豆水解物(wu)的(de)混(hun)合物(wu)中(zhong)(zhong)酵母(mu)抽提(ti)物(wu)和(he)大(da)豆水解物(wu)在(zai)(zai)每升培(pei)(pei)(pei)養基中(zhong)(zhong)的(de)含量各為(wei)1–8g，所述酵母(mu)抽提(ti)物(wu)和(he)棉子水解物(wu)的(de)混(hun)合物(wu)中(zhong)(zhong)酵母(mu)抽提(ti)物(wu)和(he)棉子水解物(wu)在(zai)(zai)每升培(pei)(pei)(pei)養基中(zhong)(zhong)的(de)含量各為(wei)1–8g。

本發明(ming)的(de)(de)有(you)益技術(shu)效(xiao)果是：本發明(ming)無血(xue)清無蛋(dan)白(bai)細(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)基(ji)中不含(han)有(you)蛋(dan)白(bai)質，所有(you)成(cheng)分都是來自無動(dong)物源的(de)(de)。本發明(ming)無血(xue)清無蛋(dan)白(bai)細(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)基(ji)使用后活細(xi)胞(bao)(bao)密度，細(xi)胞(bao)(bao)成(cheng)活率和重(zhong)組(zu)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)表達明(ming)顯(xian)效(xiao)果優異，遠超其(qi)它細(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)基(ji)。適(shi)用于(yu)用于(yu)重(zhong)組(zu)蛋(dan)白(bai)和疫苗(miao)生產(chan)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)，尤其(qi)是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero細(xi)胞(bao)(bao)，可以很好的(de)(de)應用于(yu)重(zhong)組(zu)蛋(dan)白(bai)和疫苗(miao)的(de)(de)生產(chan)，降(jiang)低生產(chan)成(cheng)本，減少污(wu)染風(feng)險。

附圖說明

為了更清(qing)楚地(di)說明(ming)本(ben)發(fa)明(ming)實施(shi)例(li)或(huo)現有(you)(you)技術(shu)中的技術(shu)方案，下面(mian)將對實施(shi)例(li)或(huo)現有(you)(you)技術(shu)描述中所需要使用的附圖作簡單地(di)介紹，顯而(er)易見地(di)，下面(mian)描述中的附圖僅(jin)僅(jin)是本(ben)發(fa)明(ming)的一(yi)些實施(shi)例(li)。

圖(tu)1為本(ben)發明中(zhong)(zhong)重組蛋白(bai)在(zai)不(bu)同(tong)無(wu)血清(qing)無(wu)蛋白(bai)細胞培養基中(zhong)(zhong)的(de)表達(da)對比圖(tu)。

通過該附圖(tu)(tu)可(ke)見(jian)：重組蛋(dan)白(bai)在含有水(shui)解物的(de)(de)無(wu)血(xue)清(qing)無(wu)蛋(dan)白(bai)細胞培養(yang)基中的(de)(de)表達(da)明顯高于在無(wu)血(xue)清(qing)無(wu)蛋(dan)白(bai)成分界定的(de)(de)細胞培養(yang)基中的(de)(de)表達(da)，該附圖(tu)(tu)對應(ying)實施例中表9。

具體實施方式

下(xia)面將對本發明(ming)(ming)實(shi)施例(li)(li)中(zhong)的(de)技(ji)術方案進行清(qing)楚、完(wan)整(zheng)地描(miao)述(shu)，顯(xian)然，所(suo)描(miao)述(shu)的(de)實(shi)施例(li)(li)僅僅是本發明(ming)(ming)一部分實(shi)施例(li)(li)，而不是全部的(de)實(shi)施例(li)(li)。基于本發明(ming)(ming)中(zhong)的(de)實(shi)施例(li)(li)，本領域普通技(ji)術人員在沒有做(zuo)出創造性勞動前(qian)提下(xia)所(suo)獲得的(de)所(suo)有其他實(shi)施例(li)(li)，都(dou)屬于本發明(ming)(ming)保護的(de)范圍。

實施例1：

無血(xue)清(qing)無蛋白成(cheng)分界定的(de)細胞培(pei)養(yang)基，包括氨基酸(suan)、維生(sheng)素(su)、無機(ji)鹽和(he)微量元素(su)、碳水(shui)化(hua)合物(wu)和(he)其(qi)(qi)他化(hua)學物(wu)、聚胺或(huo)者其(qi)(qi)衍生(sheng)物(wu)，其(qi)(qi)具體成(cheng)分含量構成(cheng)為：

氨基酸的成(cheng)分及(ji)其(qi)在每升培養(yang)基中的含量如(ru)下：

維生素的成分及其在每(mei)升(sheng)培養基中的含量如下：

無(wu)機鹽和微(wei)量元素的成分及其在每升培養基中的含量如下(xia)：

其它微量(liang)元(yuan)素及其在每升培(pei)養基中的含量(liang)如下(xia)：

ZnCl2 1–100μM

或(huo)者ZnSO4-7H2O 1–100μM

或者Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM

其(qi)它微(wei)量(liang)元素及其(qi)在每升培養(yang)基中(zhong)的含量(liang)如(ru)下：

檸檬酸鐵銨(an) 1–500mg

或者檸檬酸鐵 1–500μM

或者乙(yi)二胺四乙(yi)酸(suan)鐵鈉(na)鹽(yan) 1–500μM

碳水(shui)化(hua)合物和(he)其它化(hua)學物的(de)成分及(ji)其在每升培養基中的(de)含量如(ru)下：

聚胺或者其(qi)衍生物的成分(fen)及其(qi)在(zai)每(mei)升培養基中的含(han)量(liang)如(ru)下：

實施例2：

無(wu)(wu)血清無(wu)(wu)蛋白成分(fen)界定的細胞培養(yang)基，包(bao)括氨基酸、維(wei)生(sheng)素(su)、無(wu)(wu)機鹽和(he)微量元素(su)、碳水(shui)化合物(wu)和(he)其他化學(xue)物(wu)、聚胺或(huo)者其衍生(sheng)物(wu)，其具體成分(fen)含(han)量構(gou)成為：

氨(an)基酸的成分及其含量：

維生(sheng)素的(de)成分及其含量(liang)：

無機鹽的成分及其含量：

微量元素的成分及其含量：

CuSO4-7H2O 124.84mg/L

MnCl2-4H2O 98.955mg/L

Na2SeO3 17.294mg/L

其(qi)它微量元素的(de)成分及(ji)其(qi)含量：

ZnCl2 68.15mg/L

或者(zhe)ZnSO4-7H2O 143.78mg/L

或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L

其它微量(liang)元素(su)的成(cheng)分及(ji)其含量(liang)：

檸檬酸鐵銨 2g/L

或者檸檬酸鐵(tie) 489.88mg/L

或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽(yan) 734.1mg/L

碳(tan)水化合物和其(qi)(qi)它化學(xue)物的成分及其(qi)(qi)含量：

其它化學物(wu)的(de)成分及(ji)其含量：

次黃嘌呤 1.361g/L

胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L

其它化學(xue)物的成分及其含量：

氯化膽堿 3g/L

肌醇 1g/L

氯化(hua)乙醇胺 200mg/L

聚胺或者其衍生物的成分(fen)及其含(han)量：

L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L

本實施(shi)例無血清(qing)無蛋白成分界定的細胞培養基的制備方法：

步驟(zou)1：將無血清無蛋(dan)白成分(fen)界定的細胞培(pei)養(yang)基的成分(fen)按照不同(tong)的組分(fen)配制成不同(tong)的濃縮液：

10倍的氨基酸濃縮液(ye)：

200倍(bei)的維生素濃縮液(ye)：

1倍的無機鹽：

1000倍的微(wei)量元(yuan)素濃縮液：

CuSO4-7H2O 124.84mg/L

MnCl2-4H2O 98.955mg/L

Na2SeO3 17.294mg/L

100倍的其它(ta)微(wei)量元(yuan)素濃(nong)縮液：

ZnCl2 68.15mg/L

或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L

或者(zhe)Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L100倍的其(qi)它微(wei)量元素濃縮液：

檸檬酸鐵銨(an) 2g/L

或者(zhe)檸檬酸鐵(tie) 489.88mg/L

或者乙二胺(an)四(si)乙酸(suan)鐵鈉鹽 734.1mg/L

1倍的碳(tan)水化合物和其它化學物：

100倍的其它化學物(wu)濃縮液：

次黃嘌呤(ling) 1.361g/L

胸腺嘧(mi)啶脫氧核苷 387.568mg/L

100倍的(de)其它化學(xue)物濃縮液:

氯化膽堿 3g/L

肌(ji)醇 1g/L

氯化乙(yi)醇胺 200mg/L

100倍的聚(ju)胺或(huo)者其衍(yan)生(sheng)物濃縮液(ye)：

L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L

步驟2：配(pei)制1倍的(de)1L液體(ti)培養基：將以上(shang)成(cheng)分按1倍的(de)用量(liang)加入(ru)(ru)到含有(you)500ml去離子(zi)水(shui)的(de)1L燒杯中并混勻(yun)，再(zai)加入(ru)(ru)去離子(zi)水(shui)定容至(zhi)1L；

步驟(zou)3：調節PH值和滲透(tou)壓：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至(zhi)7.30，用NaCl調節滲透(tou)壓至(zhi)295mOsm/L；

步(bu)驟4：用0.22μM的(de)過濾膜除菌。

CHO細(xi)(xi)胞(bao)在本實(shi)施例不同配方(fang)(fang)的(de)無血清(qing)無蛋白(bai)成分(fen)界定的(de)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基中的(de)批次懸浮培(pei)(pei)養(yang)(yang)及(ji)其實(shi)驗數據見(jian)表1和(he)表2。培(pei)(pei)養(yang)(yang)條件(jian)和(he)實(shi)驗方(fang)(fang)法(fa)：在125ml的(de)振蕩培(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶中分(fen)別加入(ru)(ru)30ml不同配方(fang)(fang)的(de)無血清(qing)無蛋白(bai)成分(fen)界定的(de)細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)養(yang)(yang) 基，放入(ru)(ru)37℃含有(you)5％二氧(yang)化碳的(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)箱中，以(yi)每(mei)分(fen)鐘(zhong)120轉(zhuan)搖床培(pei)(pei)養(yang)(yang)6天，每(mei)天取樣用Trypan blue血球(qiu)計數法(fa)記錄(lu)活細(xi)(xi)胞(bao)密度(倍10E6cells/ml)和(he)細(xi)(xi)胞(bao)存活率(％)。

表1

表2

實施例3：

無血清無蛋白成(cheng)分界定的(de)細胞培養基，包(bao)括(kuo)氨基酸、維生素、無機鹽和(he)微(wei)量(liang)(liang)元素、碳水化合(he)物(wu)和(he)其(qi)(qi)他(ta)化學物(wu)、聚胺或者其(qi)(qi)衍生物(wu)，其(qi)(qi)具(ju)體成(cheng)分含量(liang)(liang)構成(cheng)為：

氨(an)基(ji)酸的(de)成分(fen)及其含量：

維(wei)生(sheng)素的成(cheng)分及其含量：

無機鹽的(de)成分及其含量：

微量元素的成(cheng)分及其含量：

CuSO4-7H2O 124.84mg/L

MnCl2-4H2O 98.955mg/L

Na2SeO3 17.294mg/L

其它(ta)微量(liang)元素的(de)成(cheng)分及其含量(liang)：

ZnCl2 68.15mg/L

其它微量(liang)元素的(de)成分及(ji)其含量(liang)：

檸檬酸(suan)鐵銨(an) 2g/L

或者(zhe)檸檬酸鐵 489.88mg/L

或者乙(yi)二胺四乙(yi)酸(suan)鐵鈉鹽 734.1mg/L

碳水(shui)化合物(wu)和其它化學物(wu)的成分及其含量：

其它(ta)化(hua)學物的成分(fen)及其含量(liang)：

次黃嘌呤 1.361g/L

胸(xiong)腺嘧(mi)啶脫氧核苷 387.568mg/L

其它化學物(wu)的成(cheng)分(fen)及其含量：

氯(lv)化膽堿(jian) 3g/L

肌醇(chun) 1g/L

氯(lv)化乙醇胺(an) 200mg/L

聚(ju)胺或者其衍生(sheng)物的成分及其含量：

本(ben)實施(shi)例無血清無蛋白(bai)成分(fen)界定(ding)的細胞培養基(ji)的制備方(fang)法：

步驟1：培養基配制：將無血清無蛋白成(cheng)分界定(ding)的細胞培養基的成(cheng)分按照不同的組分配制成(cheng)不同的濃縮液。

10倍的氨基酸濃縮液(ye)：

200倍的維生素(su)濃縮液：

1倍的無機鹽：

1000倍(bei)的微量(liang)元素濃縮(suo)液：

CuSO4-7H2O 124.84mg/L

MnCl2-4H2O 98.955mg/L

Na2SeO3 17.294mg/L

100倍的(de)其它微量(liang)元素濃縮液：

ZnCl2 68.15mg/L

100倍的其它微量元素濃縮液：

檸檬酸鐵銨 2g/L

或者 檸(ning)檬酸鐵 489.88mg/L

或者 乙(yi)二胺四乙(yi)酸鐵鈉鹽 734.1mg/L

1倍的碳水化(hua)合物和其它化(hua)學(xue)物：

100倍(bei)的其它化學物濃縮液：

次(ci)黃嘌(piao)呤 1.361g/L

胸腺(xian)嘧啶脫氧核(he)苷 387.568mg/L

100倍的其它化(hua)學物濃縮液:

氯(lv)化膽堿 3g/L

肌(ji)醇 1g/L

氯(lv)化乙醇胺 200mg/L

100倍的(de)聚(ju)胺(an)或者其衍(yan)生物濃縮液(ye)：

步驟(zou)2：配(pei)制1倍(bei)的(de)1L液體培養基：將以上(shang)成分按1倍(bei)的(de)用量加入到含有500ml去(qu)離(li)子水(shui)的(de)1L燒杯中并(bing)混(hun)勻，再加入去(qu)離(li)子水(shui)定(ding)容至1L；

步驟(zou)3:調(diao)節PH值和滲透(tou)壓：用5N NaOH或者5N HCl調(diao)節pH至7.30，用NaCl調(diao)節滲透(tou)壓至295mOsm/L；

步驟4：用(yong)0.22μM的(de)過(guo)濾膜除菌。

CHO細(xi)胞(bao)(bao)在本(ben)實(shi)(shi)施(shi)例(li)不(bu)同配方的(de)無血清(qing)無蛋(dan)白(bai)成(cheng)分(fen)(fen)界定的(de)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)中的(de)批次(ci)懸浮培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)及(ji)其實(shi)(shi)驗(yan)數據見表(biao)3和(he)(he)表(biao)4。培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)條件和(he)(he)實(shi)(shi)驗(yan)方法：在125ml的(de)振(zhen)蕩培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶(ping)中分(fen)(fen)別加入(ru)30ml不(bu)同配方的(de)無血清(qing)無蛋(dan)白(bai)成(cheng)分(fen)(fen)界定的(de)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基(ji)，放(fang)入(ru)37℃含有(you)5％二(er)氧化碳(tan)的(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)箱中，以每(mei)(mei)分(fen)(fen)鐘120轉搖(yao)床培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)6天，每(mei)(mei)天取樣用(yong)Trypan blue血球計數法記錄活(huo)細(xi)胞(bao)(bao)密度(du)(倍10E6cells/ml)和(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)存活(huo)率(％)。

表3

表4

實施例4：

無血(xue)清無蛋白細胞培(pei)養基(ji)，成(cheng)分包括氨基(ji)酸(suan)，維生素，無機(ji)鹽(yan)和微量元(yuan)素，碳水化合物和其(qi)(qi)它化學物，聚胺(an)或者其(qi)(qi)衍生物，水解物。其(qi)(qi)具體成(cheng)分含量構成(cheng)為：

氨基酸(suan)的(de)成分及其在(zai)每升(sheng)培養基中的(de)含(han)量如(ru)下：

維生素的成分及(ji)其在每升(sheng)培養基中的含量如下：

無機鹽和微量元素的成分及其在每升培養基中的含量如下：

其(qi)它微量元(yuan)素及其(qi)在每升(sheng)培養基中的(de)含量如下：

ZnCl2 1–100μM

或者ZnSO4-7H2O 1–100μM

或者(zhe)Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM

其它(ta)微量元素(su)及其在每(mei)升(sheng)培(pei)養基中(zhong)的含量如(ru)下：

檸檬(meng)酸鐵銨 1–500mg

或者檸檬酸鐵 1–500μM

或者乙二胺四乙酸(suan)鐵鈉鹽 1–500μM

碳水化(hua)合物和其(qi)(qi)它化(hua)學物的(de)成分及其(qi)(qi)在每升(sheng)培養(yang)基中的(de)含量(liang)如下：

聚胺或者其衍生物的(de)成分及其在每升(sheng)培養(yang)基中的(de)含量(liang)如下：

水(shui)解(jie)物的成(cheng)分及(ji)其在每(mei)升(sheng)培養基中的含量如下(xia)：

酵母(mu)抽提物 1–8g/L

或者 酵母抽提物(wu)1-8g/L和大豆水(shui)解物(wu)1-8g/L的混(hun)合物(wu)

或者 酵母抽提物1-8g/L和棉子水解物1-8g/L的混合物

實施例5：

無(wu)血清無(wu)蛋白細胞(bao)培養基，成分包括氨基酸，維生(sheng)素(su)，無(wu)機(ji)鹽和微量(liang)元(yuan)素(su)，碳水(shui)化(hua)合物(wu)和其它化(hua)學物(wu)，聚胺(an)或(huo)者其衍生(sheng)物(wu)，水(shui)解物(wu)。其具體成分含(han)量(liang)構成為：

氨基酸的成(cheng)分(fen)及其含量：

維生素(su)的成(cheng)分及其含量：

無機鹽的成(cheng)分及其含(han)量(liang)：

微(wei)量元素(su)的(de)成分及其(qi)含量：

其它微量(liang)元素的成(cheng)分及其含量(liang)：

檸檬酸鐵銨 2g/L

或者檸檬酸(suan)鐵 489.88mg/L

或(huo)者乙二胺四(si)乙酸鐵(tie)鈉(na)鹽 734.1mg/L

碳水(shui)化合物(wu)和(he)其(qi)它化學物(wu)的成分及其(qi)含量：

聚胺或者(zhe)其衍生物的成(cheng)分及其含量(liang)：

L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L

水(shui)解物的成分及其含(han)量(liang)：

酵母抽提物2g/L

或(huo)者 酵母抽提物2g/L和(he)大豆(dou)水解物2g/L的混合物

或者 酵母提(ti)物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物

本實(shi)施例無(wu)血清(qing)無(wu)蛋白細(xi)胞(bao)培養基的制備方法(fa)：

步(bu)驟1：培養(yang)基配制：將無(wu)血清無(wu)蛋白細胞培養(yang)基的成(cheng)分按照(zhao)不同(tong)的組分配制成(cheng)不同(tong)的濃縮液(ye)：

10倍(bei)的氨基酸(suan)濃(nong)縮液：

200倍的維(wei)生素濃縮液：

1倍的無機鹽：

1000倍的微(wei)量元素濃(nong)縮(suo)液：

CuSO4-7H2O 124.84mg/L

MnCl2-4H2O 98.955mg/L

Na2SeO3 17.294mg/L

100倍的其它微(wei)量元素濃縮(suo)液：

ZnCl2 68.15mg/L

100倍的(de)其它微量(liang)元素濃縮液(ye)：

檸(ning)檬酸鐵銨(an) 2g/L

或(huo)者(zhe)檸檬酸鐵 489.88mg/L

或者 乙(yi)二(er)胺(an)四乙(yi)酸鐵鈉鹽(yan) 734.1mg/L

1倍的(de)碳水化(hua)合(he)物和(he)其它化(hua)學物：

100倍(bei)的其它化(hua)學物濃縮(suo)液：

次(ci)黃嘌(piao)呤 1.361g/L

胸腺嘧啶脫氧(yang)核(he)苷(gan) 387.568mg/L

100倍的其它化學(xue)物濃縮液:

氯化(hua)膽堿 3g/L

肌醇 1g/L

氯(lv)化乙醇胺 200mg/L

100倍的聚(ju)胺或者其衍生物濃縮液：

L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L

1倍的水解物：

酵母物抽提(ti)物2g/L

或者酵母抽提物2g/L和大豆水解物2g/L的混合物

或者酵母抽提物2g/L和棉子水(shui)解物2g/L的混合物

步(bu)驟(zou)2：配制1倍(bei)的(de)1L液體培養基(ji)：將以上成分按1倍(bei)的(de)用量加入(ru)到含有500ml去(qu)離子水的(de)1L燒杯中并混(hun)勻，再加入(ru)去(qu)離子水定容(rong)至1L；

步(bu)驟(zou)3：調(diao)節PH值和滲(shen)(shen)透壓(ya)：用(yong)5N NaOH或者5N HCl調(diao)節pH至(zhi)7.30，用(yong)NaCl調(diao)節滲(shen)(shen)透壓(ya)至(zhi)295mOsm/L；

步(bu)驟(zou)4：用(yong)0.22μM的過濾膜除(chu)菌。

CHO細(xi)胞(bao)在(zai)本實施例(li)不(bu)(bu)同(tong)配(pei)方(fang)的(de)無血清無蛋(dan)白細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)基中(zhong)的(de)批次(ci)懸浮培(pei)養(yang)(yang)及其實驗數(shu)據見表5和(he)(he)表6。培(pei)養(yang)(yang)條件和(he)(he)實驗方(fang)法：在(zai)125ml的(de)振蕩培(pei)養(yang)(yang) 瓶(ping)中(zhong)分別加入30ml不(bu)(bu)同(tong)配(pei)方(fang)的(de)無血清無蛋(dan)白細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)基，放入37℃含有(you)5％二氧化(hua)碳的(de)培(pei)養(yang)(yang)箱中(zhong)，以每分鐘120轉搖床(chuang)培(pei)養(yang)(yang)6天，每天取(qu)樣(yang)用Trypan blue血球計數(shu)法記錄活細(xi)胞(bao)密度(倍10E6cells/ml)和(he)(he)細(xi)胞(bao)存活率(lv)(％)。

表5

表6

實施例6：

無(wu)血(xue)清無(wu)蛋白細胞培養基(ji)，成(cheng)分包括氨基(ji)酸，維生素，無(wu)機鹽和微量(liang)元素，碳水化合物(wu)和其(qi)它化學(xue)物(wu)，聚(ju)胺或(huo)者其(qi)衍生物(wu)，水解物(wu)。其(qi)具體成(cheng)分含(han)量(liang)構(gou)成(cheng)為：

氨基酸的成分及其含量：

維生(sheng)素的(de)成分及(ji)其含量(liang)：

無機(ji)鹽的成分(fen)及其含(han)量：

微量元素的(de)成分及其含量：

其(qi)它(ta)微(wei)量元(yuan)素(su)的成分(fen)及(ji)其(qi)含量：

檸檬酸鐵銨 2g/L

或者 檸(ning)檬酸鐵 489.88mg/L

或者(zhe) 乙二胺(an)四(si)乙酸(suan)鐵鈉鹽(yan) 734.1mg/L

碳水化(hua)(hua)合物和其它化(hua)(hua)學物的(de)成分及其含量：

其它化(hua)學物的成分(fen)及其含量：

次黃嘌呤 1.361g/L

胸腺嘧(mi)啶脫氧(yang)核苷 387.568mg/L

其它化學物的(de)成(cheng)分及其含量：

氯化膽堿(jian) 3g/L

肌醇 1g/L

氯化乙醇胺 200mg/L

聚胺(an)或者其衍(yan)生物的成(cheng)分(fen)及其含量：

水解物的成分及其含量：

酵母抽(chou)提物(wu)2g/L和(he)棉子水解物(wu)2g/L的混合物(wu)

本實施例無(wu)血清(qing)無(wu)蛋白細胞培養基的制備方(fang)法：

步驟(zou)1：培養基配(pei)制：將無(wu)血清無(wu)蛋白細胞培養基的成分(fen)按(an)照不同(tong)的組(zu)分(fen)配(pei)制成不同(tong)的濃縮(suo)液：

10倍的氨基酸濃(nong)縮液：

200倍的維生素(su)濃(nong)縮液：

1倍的無機鹽：

1000倍(bei)的微量元素濃縮液：

CuSO4-7H2O 124.84mg/L

MnCl2-4H2O 98.955mg/L

Na2SeO3 17.294mg/L

100倍(bei)的其(qi)它微量元素濃縮液：

ZnCl2 68.15mg/L

100倍的其它微量元素濃縮液：

檸檬酸鐵銨 2g/L

或者檸(ning)檬(meng)酸鐵 489.88mg/L

或者 乙二胺四乙酸(suan)鐵鈉鹽 734.1mg/L

1倍的(de)碳水化(hua)(hua)合(he)物(wu)和其它化(hua)(hua)學物(wu)：

100倍的其它化學(xue)物濃縮液：

次黃嘌(piao)呤 1.361g/L

胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L

100倍的其它化學物(wu)濃縮液:

氯化膽堿 3g/L

肌醇(chun) 1g/L

氯(lv)化乙醇胺 200mg/L

100倍的聚胺(an)或者其衍生物(wu)濃縮液：

1倍的水解物：

酵(jiao)母抽提物(wu)(wu)2g/L和棉子水解物(wu)(wu)2g/L的混合物(wu)(wu)

步驟(zou)2：配制1倍的1L液體(ti)培養基：將以上成分按1倍的用量加(jia)入(ru)到(dao)含有500ml去離(li)子水的1L燒(shao)杯(bei)中并混(hun)勻，再加(jia)入(ru)去離(li)子水定容(rong)至1L；

步驟3：調(diao)節PH值和(he)滲(shen)透壓(ya)：用(yong)5N NaOH或者5N HCl調(diao)節pH至7.30，用(yong)NaCl調(diao)節滲(shen)透壓(ya)至295mOsm/L；

步驟4：用0.22μM的過濾膜(mo)除菌。

CHO細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在本實(shi)(shi)施例不(bu)同(tong)配方(fang)(fang)的無(wu)血清(qing)無(wu)蛋白細(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)基中(zhong)(zhong)的批次懸浮培(pei)養(yang)(yang)及其實(shi)(shi)驗數據見表7和表8。培(pei)養(yang)(yang)條(tiao)件和實(shi)(shi)驗方(fang)(fang)法(fa)：在125ml的振(zhen)蕩培(pei)養(yang)(yang)瓶中(zhong)(zhong)分(fen)別加入(ru)30ml不(bu)同(tong)配方(fang)(fang)的無(wu)血清(qing)無(wu)蛋白細(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)(yang)基，放入(ru)37℃含有5％二氧化碳(tan)的培(pei)養(yang)(yang)箱中(zhong)(zhong)，以每分(fen)鐘120轉搖床培(pei)養(yang)(yang)6天(tian)，每天(tian)取樣用Trypan blue血球計數法(fa)記錄(lu)活細(xi)(xi)(xi)胞(bao)密度(倍10E6cells/ml)和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)存活率(％)。

表7

表8

重組蛋(dan)白CHO細(xi)胞(bao)在不(bu)同配方(fang)(fang)的無血清(qing)無蛋(dan)白細(xi)胞(bao)培養基(ji)中(zhong)的批次懸浮培養表達實驗(yan)見表9和圖1。培養條件(jian)和實驗(yan)方(fang)(fang)法：在125ml的振蕩(dang)培養瓶中(zhong)分別加入30ml不(bu)同配方(fang)(fang)的無血清(qing)無蛋(dan)白細(xi)胞(bao)培養基(ji)，放入37℃含有5％二氧化碳(tan)的培養箱中(zhong)，以每分鐘120轉搖(yao)床培養6天，取樣(yang)做Western blot。

表9

如(ru)圖1所(suo)示重(zhong)組蛋白(bai)在(zai)含有水(shui)解物的無血(xue)清無蛋白(bai)細胞培養(yang)基(ji)中的表達明(ming)顯高于在(zai)無血(xue)清無蛋白(bai)成分(fen)界(jie)定的細胞培養(yang)基(ji)中的表達。

不限上述(shu)實施例的(de)本(ben)發明所述(shu)無血清(qing)無蛋白(bai)細胞培(pei)養(yang)基各(ge)成分具體(ti)作用以及原理表達如下(xia)：

氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)：氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)是構成蛋白質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)主(zhu)要(yao)(yao)成分，同時通過(guo)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)代謝為細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生長(chang)提供能源。細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養基(ji)(ji)(ji)(ji)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)主(zhu)要(yao)(yao)包括21種(zhong)(zhong)(zhong)，其中9種(zhong)(zhong)(zhong)必須氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)：L-組氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-異亮氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-亮氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-賴氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-蛋氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-苯丙氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-蘇氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-色氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-纈氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和12種(zhong)(zhong)(zhong)非(fei)必須氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)：L-丙氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-精氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-天冬酰(xian)胺，L-天冬氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-半(ban)胱(guang)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-胱(guang)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-谷(gu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-谷(gu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺，L-甘氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-脯(fu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-絲氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)，L-酪(lao)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。由于(yu)谷(gu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺在培養基(ji)(ji)(ji)(ji)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不穩 定性，常(chang)用相同摩爾(er)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)L-丙氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酰(xian)-L-谷(gu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺取代谷(gu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺。CHO細(xi)(xi)胞(bao)(bao)是脯(fu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)缺(que)陷(xian)型細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，CHO細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生長(chang)需要(yao)(yao)脯(fu)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)。由于(yu)傳(chuan)統細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養基(ji)(ji)(ji)(ji)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)濃度(du)過(guo)低，傳(chuan)統細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養基(ji)(ji)(ji)(ji)只能支持低細(xi)(xi)胞(bao)(bao)密(mi)(mi)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)貼(tie)壁(bi)培養，要(yao)(yao)支持高細(xi)(xi)胞(bao)(bao)密(mi)(mi)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)懸浮培養，必須大幅提高培養基(ji)(ji)(ji)(ji)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)濃度(du)，同時保證各氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)平衡，避免因某種(zhong)(zhong)(zhong)氨(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)耗(hao)盡限制細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生長(chang)和重組蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達。

維生(sheng)(sheng)(sheng)素：維生(sheng)(sheng)(sheng)素是(shi)細胞(bao)生(sheng)(sheng)(sheng)長和(he)代(dai)謝中(zhong)許(xu)多(duo)重要酶(mei)的(de)輔(fu)基和(he)輔(fu)酶(mei)，細胞(bao)培(pei)養基中(zhong)的(de)維生(sheng)(sheng)(sheng)素主要是(shi)B族維生(sheng)(sheng)(sheng)素包括：泛酸鈣，煙酰(xian)胺，鹽酸吡哆醇，鹽酸硫胺，維生(sheng)(sheng)(sheng)素B12，生(sheng)(sheng)(sheng)物素，葉酸，核黃素等。

無(wu)機鹽：無(wu)機鹽對維持細胞膜的滲透壓，對營養(yang)物(wu)質通過細胞膜起著重要(yao)的調節(jie)作用(yong)。培養(yang)基(ji)(ji)中的無(wu)機鹽主要(yao)包括：Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cl-，HPO42-，HCO3-等，其中磷是構成DNA和RNA的重要(yao)元素，HCO3-起到(dao)培養(yang)基(ji)(ji)PH的調節(jie)作用(yong)。

微(wei)(wei)量(liang)元素(su)：微(wei)(wei)量(liang)元素(su)是細胞(bao)生(sheng)長和代謝中許(xu)多重要(yao)酶的(de)輔(fu)基(ji)，培養基(ji)中的(de)微(wei)(wei)量(liang)元素(su)主要(yao)包括：Fe，Zn，Cu，Mn，Se等。

鋅鹽(yan)和螯合鐵(tie)(tie)(tie)：血清中的(de)胰島(dao)素(su)(su)和轉(zhuan)鐵(tie)(tie)(tie)蛋白是促進細(xi)胞生長的(de)主(zhu)要生長因(yin)子，鋅離(li)(li)子(Zn2+)具有調(diao)節葡萄糖代(dai)謝的(de)功能(neng)，可以替代(dai)胰島(dao)素(su)(su)。螯合鐵(tie)(tie)(tie)：檸檬(meng)酸鐵(tie)(tie)(tie)銨(an)或者(zhe)檸檬(meng)酸鐵(tie)(tie)(tie)或者(zhe)乙二胺四乙酸鐵(tie)(tie)(tie)鈉鹽(yan)能(neng)有效地(di)把(ba)鐵(tie)(tie)(tie)離(li)(li)子傳遞給(gei)細(xi)胞，可以替代(dai)轉(zhuan)鐵(tie)(tie)(tie)蛋白。

碳(tan)水(shui)化(hua)合物(wu)：碳(tan)水(shui)化(hua)合物(wu)主要(yao)是為細(xi)胞的生長提供能源，為氨基酸(suan)，DNA的合成提供前體物(wu)質，細(xi)胞培養基中的碳(tan)水(shui)化(hua)合物(wu)主要(yao)是葡萄糖。

其它(ta)化(hua)學(xue)物(wu)：培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)還含有一些其它(ta)化(hua)學(xue)物(wu)，次黃嘌呤(ling)，胸腺嘧啶脫氧核(he)苷是DNA補救(jiu)合成途徑(jing)中(zhong)(zhong)的(de)(de)主(zhu)要前體物(wu)，氯化(hua)膽堿、肌醇和氯化(hua)乙醇胺是構成細(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)磷(lin)脂(zhi)的(de)(de)重要成分(fen)，丙酮酸(suan)(suan)鈉(na)和檸檬(meng)酸(suan)(suan)鈉(na)能(neng)快(kuai)速進(jin)入細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)代謝(xie)并且對培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)起(qi)到穩定的(de)(de)作(zuo)用，在(zai)(zai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)加入葡(pu)聚(ju)(ju)糖硫(liu)酸(suan)(suan)鈉(na)可(ke)以減少細(xi)胞(bao)(bao)在(zai)(zai)高(gao)細(xi)胞(bao)(bao)密度懸(xuan)浮培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)中(zhong)(zhong)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)聚(ju)(ju)團。在(zai)(zai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)加入表(biao)(biao)面活(huo)性劑Kolliphor p188可(ke)以降低(di)細(xi)胞(bao)(bao)在(zai)(zai)懸(xuan)浮培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)過程中(zhong)(zhong)所(suo)產生的(de)(de)剪切力(li)對細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)損(sun)傷。由于(yu)葡(pu)聚(ju)(ju)糖硫(liu)酸(suan)(suan)鈉(na)和表(biao)(biao)面活(huo)性劑Kolliphor p188會降低(di)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)附著能(neng)力(li)，對于(yu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)貼壁和附著生長的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)，應(ying)除去無血清無蛋白細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)的(de)(de)葡(pu)聚(ju)(ju)糖硫(liu)酸(suan)(suan)鈉(na)和表(biao)(biao)面活(huo)性劑Kolliphor p188。

聚(ju)胺(Polyamine)：聚(ju)胺對促進細胞的生長起著(zhu)重(zhong)要的作用(yong)。

水(shui)解(jie)物(wu)：通常重組(zu)蛋白(bai)(bai)在無(wu)血(xue)清無(wu)蛋白(bai)(bai)成分(fen)界(jie)定的(de)細(xi)胞(bao)培養基(ji)中的(de)表達(da)都(dou)比較低，酵母抽提(ti)物(wu)，大(da)豆水(shui)解(jie)物(wu)和棉子水(shui)解(jie)物(wu)已(yi)被(bei)廣泛用(yong)于提(ti)高重組(zu)蛋白(bai)(bai)的(de)表達(da)，在成分(fen)界(jie)定的(de)無(wu)血(xue)清無(wu)蛋白(bai)(bai)細(xi)胞(bao)培養基(ji)中加入水(shui)解(jie)物(wu)可以(yi)提(ti)高重組(zu)蛋白(bai)(bai)的(de)表達(da)。

本(ben)發明(ming)中的(de)(de)水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)均為市場(chang)上買得(de)(de)到(dao)的(de)(de)無動物(wu)(wu)(wu)源水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)，酵(jiao)母抽提(ti)物(wu)(wu)(wu)是在市場(chang)上買得(de)(de)到(dao)的(de)(de)無動物(wu)(wu)(wu)源酵(jiao)母抽提(ti)物(wu)(wu)(wu)，例(li)如(ru)BD Biosciences的(de)(de)Yeast extract UF 210929等(deng)，大豆(dou)水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)是在市場(chang)上買得(de)(de)到(dao)的(de)(de)酶(mei)分解(jie)(jie)(jie)(jie)的(de)(de)無動物(wu)(wu)(wu)源大豆(dou)水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)，例(li)如(ru)Kerry BioScience or Sheffield BioScience的(de)(de)酶(mei)分解(jie)(jie)(jie)(jie)的(de)(de)大豆(dou)水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)HyPep1502等(deng)，棉子(zi)(zi)水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)是在市場(chang)上買得(de)(de)到(dao)的(de)(de)酶(mei)分解(jie)(jie)(jie)(jie)的(de)(de)無動物(wu)(wu)(wu)源棉子(zi)(zi)水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)，例(li)如(ru)Kerry BioScience or Sheffield BioScience的(de)(de)酶(mei)分解(jie)(jie)(jie)(jie)的(de)(de)棉子(zi)(zi)水(shui)(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)(jie)物(wu)(wu)(wu)HyPep7504等(deng)。

本(ben)發明(ming)的(de)培養(yang)基中不含有蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質，所有成分都是來自(zi)無動(dong)物源的(de)，本(ben)發明(ming)無血清無蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)細(xi)胞培養(yang)基使用后活細(xi)胞密(mi)度，細(xi)胞成活率和(he)(he)重(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)表達明(ming)顯(xian)效(xiao)果優異，遠超(chao)其它細(xi)胞培養(yang)基。適用于用于重(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)和(he)(he)疫(yi)苗(miao)生產(chan)的(de)細(xi)胞，尤其是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero細(xi)胞，可以很好的(de)應用于重(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)和(he)(he)疫(yi)苗(miao)的(de)生產(chan)，降低生產(chan)成本(ben)，減少污染風(feng)險。

以(yi)上所(suo)述(shu)僅為本發(fa)明的較佳實施例而已，并不用(yong)以(yi)限制本發(fa)明，凡在(zai)(zai)本發(fa)明的精神和原則(ze)之內(nei)，所(suo)作的任(ren)何修改、等(deng)同(tong)替換、改進(jin)等(deng)，均(jun)應包含(han)在(zai)(zai)本發(fa)明的保護范圍之內(nei)。