專利名稱：一種靶向抗腫瘤重組蛋白質及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向抗腫瘤重組蛋白質藥物及其基因工程制備方法。
背景技術：
對于腫瘤治療最重要的是首先要能相對準確區分開腫瘤細胞和正常細胞，高效特異性殺死腫瘤細胞，而這種準確區分的能力也是癌癥治療研究的熱點之一，也就是所謂的靶向殺傷腫瘤的策略。靶向殺傷腫瘤的策略是基于腫瘤細胞表面的特殊標志物或過表達的特異受體作為靶向，使細胞毒性藥物在靶向物質的引導下，相對集中于腫瘤細胞周圍并將其殺死，而對于正常細胞卻無損害。利用細胞因子與受體的特異性結合的能力，根據某些細胞因子受體在腫瘤細胞表面過量表達，而正常細胞基本沒有的這一事實，利用細胞因子攜帶細胞毒素特異殺傷腫瘤細胞就是其中的一種靶向殺傷策略。利用細胞因子作為導向藥物的研究已經有很多，表皮生長因子受體在磷狀上皮癌發生時表達異常增多，如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等；轉化生長因子受體的導向意義與表皮生長因子受體基本相同；神經分化因子受體為酪氨酸激酶家族，許多癌細胞都有高含量表達；粒細胞集落刺激因子受體在白血病細胞、口腔癌細胞、膀胱癌細胞等都有較高表達；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子受體在骨肉瘤細胞、腺癌細胞上有高含量分布；IL-2R在T細胞白血病和淋巴瘤細胞中有較高分布； IL-4R在淋巴瘤細胞中、IL-6R在急性髓樣白血病細胞、骨髓瘤細胞、肝癌細胞、前列腺癌細胞等有較高分布；IL-9R在Hodg kin氏瘤細胞、IL-13R在腎細胞瘤和細胞膠質瘤等有較高表達。這些細胞因子已有與綠膿桿菌外毒素(PEJseudomonas exotoxin)制備過重組毒素研究報道。利用腫瘤細胞表面標志分子，利用抗體與腫瘤細胞抗原結合特性，利用抗體作為導向部分攜帶毒素分子，可明顯提高靶向選擇性有效殺傷靶細胞，如單抗放射性碘治療原發性肝癌藥物-美妥昔單抗注射液導向性能良好。激素分子如LRH、α-促黑素等與PE結合，都能很好地起到導向作用；重組毒素是靶向治療癌癥較好的策略之一。PE毒素是結構與其分子作用機理已研究的非常清楚，也是目前使用最多的一種細胞毒素，其作用于真核核糖體上的蛋白合成因子EF2，使其糖基化，使蛋白合成終止而死亡； PE毒素分子被修飾和改造出現了幾種衍生物，主要是缺失細胞膜親和區，使其失去細胞結合能力，同時使用KDEL序列替換REDLK，增加其核糖體親和性，其細胞毒性增加3倍以上，目前最常用結構有PE40KDEL和PE38KDEL，目的在于減少其分子量、增加細胞毒性、增加分子穿透力和降低體內免疫學反應的副作用。我們利用hIL6作為導向載體，主要根據某些腫瘤細胞過表達IL6R這一事實，而血液細胞和組織細胞表面帶有IL6R數量的非常少，即使有表達量也非常低這一事實，利用 hIL6攜帶毒素PE38KDEL與細胞表面的IL6R特異性結合，在受體的介導下使重組毒素相對集中在腫瘤細胞膜上，形成復合物，經重組毒素分子內化段誘導的內化作用，使PE38KDEL 分子進入結合的細胞內，在哺乳動物細胞內furin酶的作用下切下一個37kDa的PE分子， 這個分子特異地與核糖體上的蛋白合成因子EF2結合，使蛋白合成終止，細胞因缺乏酶的合成而死亡。幾個種類的腫瘤細胞表面IL6R呈現過表達現象，在骨髓瘤細胞、肝癌細胞、急
3性髓樣白血病細胞和前列腺癌、結腸癌細胞等均高于正常細胞10倍以上，即腫瘤細胞上相應受體數均在3000 4000個以上，骨髓瘤細胞U266上最多含20000 (如U266)個/細胞左右。重組毒素殺死腫瘤細胞需要一定的分子數，主要取決于細胞膜受體數和內化效率，由于IL6R受體在腫瘤細胞上表達與正常細胞上至少相差10倍以上，有的甚至達千倍以上，這使腫瘤細胞上聚集的重組毒素比正常細胞多得多，而對正常細胞的毒副作用減到最低，甚至不呈現毒副作用。據實驗分析證明，保證殺死一個瘤細胞其周圍需要400 1000個左右的毒素分子。正常細胞上IL6R的受體數都少于200個，同時重組毒素分子內化的效率一般在15%左右，毒素分子對正常細胞發揮不了明顯的毒性作用。雖然美國Ira Pastan領導的課題小組率先構建了 IL6PE40，緊接著國內朱平、柳增善小組構建了 IL6Q3)PE40，溪永志小組構建了 IL6(23)PE40KDEL ；但Ira Pastan和奚永志小組在大腸桿菌均以包涵體表達，該蛋白復性率低，復性后活性略低于可溶性表達產物； 朱平、柳增善小組構雖然實現了可溶性活性表達，但表達量只有5%左右，成為了該毒素大量制備的瓶頸。國內PE重組毒素對腫瘤治療研究進行最為深入的為朱平領導的研究小組，其 LHRH-PE40已進入II期臨床試驗。美國是重組毒素原始創新地，其多種PE類重組毒素已進行臨床試驗；其中IL2-PE40是第一個上市以細胞因子為導向的重組毒素(Ontak)。由于重組毒素研究的發展，國內外已經有十幾個相關專利出現，這些上市的、臨床研究的和專利也佐證該類重組毒素在腫瘤治療上具有良好的應用前景。

發明內容
本發明提供一種靶向抗腫瘤重組蛋白質及其制備方法，以解決蛋白復性率低、復性后活性低、表達量低的問題。本發明采取的技術方案是包括截短的細胞因子hIL6通過接頭連接到綠膿桿菌外毒素A衍生體PE38KDEL上，作為導向載體的hIL6的氨基酸突變衍生體，包括截去hIL6 氨基端1- 個氨基酸。本發明的一種實施方式是做為導向載體的hIL6是截去氨基端23個氨基酸的衍生體。本發明的一種實施方式是做為導向載體的hIL6與PE38KDEL連接的接頭氨基酸序列從氨基端到羧基端為AEE。本發明靶向抗腫瘤重組蛋白質的制備方法是以該重組蛋白一級氨基酸序列為模板，利用DNA編碼技術，重新編碼合成該重組蛋白的DNA序列，再通過基因工程表達制備該重組蛋白。本發明的一種制備方法實施方式是利用大腸桿菌偏愛密碼子，反向編碼 hIL6 (T23) -PE38KDEL 蛋白，使用 pED8 (a)、pET22 (b)載體，在宿主菌 Rosstabule 中表達出
高活性重組毒素。本發明的一種制備方法實施方式是利用畢赤酵母偏愛密碼子，反向編碼 hIL6(T23)-PE38KDEL蛋白，利用pPICZa、pGAP Za、pPIC9載體，使用宿主菌畢赤酵母中 GS115、SMD1168，在BMMY培養基中，甲醇誘導，分泌表達出高活性重組毒素。本發明靶向抗腫瘤重組蛋白質在制備抗腫瘤蛋白藥物中的應用。
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本發明利用基因重組技術，將作為導向部分的hIL6的通過連接橋與修飾的 PE38KDEL毒性的相偶聯，形成一新的非天然功能蛋白質，使導向分子(hIL6)和毒素分子 (PE)各自保持原有的功能，且截斷的IL6減少了空間位阻，提高了親和性；再根據表達宿主密碼子的偏愛性，優化該蛋白基因所使用的密碼子，通過人工合成該基因，在大腸桿菌和酵母中實現其高效、可溶性活性表達，克服了原天然基因在大腸桿菌中低表達或包涵體表達； 在酵母中極低量分泌表達的的制備瓶頸，為該重組毒素的制備開辟了一條途徑。重組靶向毒素特征是從氨基端最多可截短1- 個氨基端的hIL6，在其羧基端通過AEE三個氨基酸連接到PE38KDEL細胞毒性蛋白質的氨基端。為了減少重組部分的空間位阻，減小蛋白的分子量，增加其穿透能力，增加其細胞毒性。根據本發明的目的，本發明優選方案是hIL6的氨基端截斷23個氨基酸，其中所說的細胞毒性蛋白質是PE38KDEL，連接部分的氨基酸是AEE，兩種連接均有良好的生物活性。根據本發明的目的，重組靶向蛋白質hIL6 (T23) -PE38KDEL的基因除利用原始基因片段的連接；還包括為了高效表達，根據表達宿主優化后合成或突變的基因，及根據表達載體多克隆位點，在5’端和3’而增加酶切位點而形成的基因結構。本發明的優點是通過基因改造和密碼子優化構建了靶向抗腫瘤重組蛋白質 hIL6 (T23) -PE38KDEL，使得兩個配體間空位阻就減小，活性提高；在大腸桿菌實現了高效可溶表達，使用LB培養基，IOOuM IPTG、J8°C誘導5小時，表達量達20%左右。在酵母中實現了活性分泌表達，使用pPICh表達載體的重組酵母，使用BMMY培養基、0. 5%甲醇，30°C 誘導72小時，表達量達30%左右；使用pGAPh表達載體的重組酵母，使用YPD培養基30°C 誘導72小時，表達量達14%左右。純化后的hIL6(T2;3)-PE38KDE具有高效的選擇性殺傷活性，對IL6R受體過表達腫瘤細胞具有高效殺傷活性，例如多發性骨髓瘤U266、SP2/0 ；對 IL6R受體陰性細胞無殺傷活性，如HBL-100 J93T。hIL6 (T23)-PE38KDEL對U266的選擇殺傷活性約是hIL6PE40活性的2倍，hIL6 (D24) PE40KDEL的1. 3倍。通過基因改造和密碼子優化，使得該重組毒素對IL6R過表達腫瘤細胞的殺傷活性提高，并且突破了天然基因低表達量的瓶頸，使得大規模制備該重組毒素成為可能。


圖1是本發明重組靶向蛋白質hIL6(T23)-PE38KDEL —級氨基酸組成結構示意圖， 接頭氨基酸序列從氨基端到羧基端為AEE ；圖2是本發明重組靶向蛋白質hIL6(T23)-PE38KDEL體外對腫瘤細胞的殺傷活性圖。圖3是三種重組靶向蛋白質體外殺傷U266腫瘤細胞的ID50圖，1 :hIL6PE40，2 hIL6(D24)-PE40KDEL, 3 :hIL6(T23)-PE38KDEL ；圖4是pET28a_IL6 (T23) PE38KDEL重組質粒構建示意圖；圖5是pET22b-IL6 (T23) PE38KDEL重組質粒構建示意圖；圖6是pGAPh-IL6 (T23) PE38KDEL重組質粒構建示意圖；圖7是pPICZa-IL6 (T23) PE38KDEL重組質粒構建示意圖。
具體實施例方式以下是本發明的重組靶向蛋白質hIL6(T23)_PE38KDEL兩種主結構的一級氨基酸序列。l.hIL6 (T23)-PE38KDEL的基本氨基酸長度及其分子量510，MW = 56094hIL6 (T23)通過AEE三個氨基酸連接PE38KDEL，其氨基酸序列是SEQ No. 1。2.hIL6 (T23)-PE38KDEL的基本氨基酸長度及其分子量511，MW = 56239hIL6 (T23)通過AEE三個氨基酸連接PE38KDEL，其氨基酸序列是SEQ No. 2。實施例1 人工合成下列基因，其核苷酸序列是SEQ No. 3，利用pET28a上多克隆位點Nco I 和Biol I在大腸桿菌細胞質中表達下列結構的重組靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL，重組表達載體構建見圖4。重組質粒轉入Rosstabule宿主菌中，使用LB培養基，IOOuM IPTG，
誘導5小時，表達量占上清蛋白的14%-20%左右。經分子量30，OOOMW超濾截留、IOmM PBS (pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 1。使用U266細胞和細胞檢測細胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細胞未見殺傷活性。實施例2 人工合成下列基因，其核苷酸序列是SEQ No. 3，利用pET22b在大腸桿菌中在周質空間中分泌表達下列結構的重組靶向毒素hIL6 (T23) -PE38KDEL，重組表達載體構建見圖 5。重組質粒轉入Rosstabule宿主菌中，使用LB培養基，IOOuM IPTGJ8°C誘導5小時，利用滲透休克法提取周質蛋白，表達量占上清蛋白的20% -25%左右。經分子量30，000MW超濾截留、IOmM PBS(pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 1。使用U266細胞和細胞檢測細胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細胞未見殺傷活性。實施例3 人工合成下列基因，將最優化重組毒素基因，其核苷酸序列是SEQ No. 4，插入到達載體EcoRI與Kpn I之間，重組表達載體的構建見圖6。在畢赤酵母中SMD1168中分泌表達下列結構的重組靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL，使用YPD培養基 30°C誘導72小時，表達量占培養基上清蛋白的16%左右。經分子量30，000MW超濾截留、 IOmM PBS (pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 2。使用U266細胞和細胞檢測細胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細胞未見殺傷活性。實施例4 人工合成下列基因，其核苷酸序列是SEQ No. 4，插入到pPICh表達載體EcoRI與 Xho I之間，重組表達載體的構建見圖7。在畢赤酵母中GS115中分泌表達下列結構的重組靶向毒素hIL6 (T23)-PE38KDEL，使用BMMY培養基，0. 5%甲醇30°C誘導72小時，表達量占培養基上清蛋白的左右。經分子量30，000MW超濾截留、IOmMPBS(pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 2。使用U266細胞和細胞檢測細胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細胞未見殺傷活性。實驗例1 重組靶向蛋白質hIL6 (T23) -PE38KDEL體外對腫瘤細胞的殺傷活性研究U266, SP2/0是IL6R過表達腫瘤細胞，HBL-100.293T是IL6R陰性細胞。利用似66、SP2/0、HBL-100和細胞，使用[3H]亮氨酸滲入法測定 hIL6 (T22) -PE38KDEL蛋白質抑制活性。細胞培養后使用RPMI 1640培養基洗滌3次，鋪96 孔板，每孔IX IO6個細胞、200 μ L 10%血清的1640培養液，加不同濃度的過濾除菌的各種重組毒素溶液。重組毒素溶于含有0. 2%人血清的IOmM PBS ρΗ 7. 4中，按10ng/mL、20ng/
mL、30ng/mL........加入細胞孔中，與細胞一同37°C培養30h后，[3H]亮氨酸滲入法測
定蛋白質抑制活性。HBL-100細胞和細胞ID5tl沒有變化，U266細胞ID5tl為30ng/mL， SP2/0 細胞的 ID5tl 為 40ng/mL。實驗例2 三種重組靶向蛋白質體外殺傷U266腫瘤細胞的ID50。細胞培養后使用RPMI 1640培養基洗滌3次，鋪96孔板，每孔1 X 106個U266細胞、200 μ L 10%血清的1640培養液，加不同濃度的過濾除菌的各種重組毒素溶液。重組毒素(① hIL6PE40 ；② hIL6 (D24) -PE40KDEL ；③ hIL6 (T23) -PE38KDEL)分別溶于含有 0. 2 % 人血清的 IOmM PBS ρΗ 7. 4 中，按 aig/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/
mL........ 200ng/mL加入細胞孔中，與細胞一同37°C培養30h后，[3H]亮氨酸滲入法測定
蛋白質抑制活性。hIL6PE40 的 ID50 為 80ng/mL, hIL6 (D24) -PE40KDEL 的 ID50 為 40ng/mL, hIL6 (T23)-PE38KDEL 的 ID5tl 為 30ng/mL。從圖3結果可看到hIL6 (T23) -PE38KDEL有效作用濃度(ID5tl)明顯高于hIL6PE40 和hIL6 (D24) -PE40KDEL兩個重組蛋白分子。
權利要求
1.一種靶向抗腫瘤重組蛋白質，包括截短的細胞因子hIL6通過接頭連接到綠膿桿菌外毒素A衍生體PE38KDEL上，其特征在于作為導向載體的hIL6的氨基酸突變衍生體，包括截去hIL6氨基端1- 個氨基酸。
2.根據權利要求1所述的一種靶向抗腫瘤重組蛋白質，其特征在于做為導向載體的 hIL6是截去氨基端23個氨基酸的衍生體。
3.根據權利要求1所述的一種靶向抗腫瘤重組蛋白質，其特征在于做為導向載體的 hIL6與PE38KDEL連接的接頭氨基酸序列從氨基端到羧基端為AEE。
4.如權利要求1或2或3所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質的制備方法，其特征是以該重組蛋白一級氨基酸序列為模板，利用DNA編碼技術，重新編碼合成該重組蛋白的DNA序列， 再通過基因工程表達制備該重組蛋白。
5.根據權利要求4所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質的制備方法，其特征是利用大腸桿菌偏愛密碼子，反向編碼hIL6 (T23) -PE38KDEL蛋白，使用pED8 (a)、pET22 (b)載體，在宿主菌Rosstabule中表達出高活性重組毒素。
6.根據權利要求4所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質的制備方法，其特征是利用畢赤酵母偏愛密碼子，反向編碼hIL6(T2;3)-PE38KDEL蛋白，利用pPIC^upGAP Za,pPIC9載體，使用宿主菌畢赤酵母中GS115、SMD1168，在BMMY培養基中，甲醇誘導，分泌表達出高活性重組
7.如權利要求1或2或3所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質在制備抗腫瘤蛋白藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種靶向抗腫瘤重組蛋白質及其制備方法，屬于靶向抗腫瘤重組蛋白質藥物。包括截短的細胞因子hIL6通過接頭連接到綠膿桿菌外毒素A衍生體PE38KDEL上，作為導向載體的hIL6的氨基酸突變衍生體，包括截去hIL6氨基端1-28個氨基酸。本發明進一步涉及該重組靶向蛋白在抗腫瘤中的應用。本發明的優點是通過基因改造和密碼子優化構建了靶向抗腫瘤重組蛋白質hIL6(T23)-PE38KDEL，使得兩個配體間空位阻就減小，活性提高；在大腸桿菌實現了高效可溶表達，突破了天然基因低表達量的瓶頸，使得大規模制備該重組毒素成為可能。
文檔編號C07K19/00GK102153655SQ201010620599
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者任洪林, 盧士英, 周玉, 李巖松, 柳增善, 郭德軍 申請人:吉林大學