重組結核桿菌esat6-cfp10融合蛋白及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種結核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白及其制備方法，該蛋白為大 腸桿菌表達系統原核表達所得，可用于結核菌潛伏感染人群的篩查和結核病的輔助診斷。
【背景技術】
[0002] 我國是世界上22個結核高負擔國家之一，據全國第四次結核病流行病學調查的 數據，全國受結核菌感染人數超過4億。流行病學分析顯示，在感染了結核桿菌的人群中 有10%的人結核發病率較高。因此，如何早期發現高危人群并給予預防是結核病控制的重 要問題，而其中尋找能診斷和確定患者體內是否留有存活結核桿菌應該是實現的關鍵。目 前結核病診斷主要依靠胸部X光片、涂片鏡檢、血清學檢查等，運些檢查手段均難做到大規 模普查和早期發現。PPD(結核桿菌精制蛋白衍生物）皮膚試驗雖可用于結核病的大規模 普查，但PPD包含的抗原為結核分枝桿菌、非致病性分枝桿菌及BCG所共有，因而不能區分 BCG接種、非致病性分枝桿菌感染和結核桿菌感染，更不能鑒別結核菌感染者體內有無存活 的結核桿菌；而卡介苗在世界范圍內廣泛接種。因此，尋找能區別卡介苗接種還是結核菌感 染、結核菌感染者體內有無存活結核桿菌的診斷方法非常重要。
[0003] 目前對于結核菌潛伏感染患者的診斷手段主要有結核菌素蛋白衍生物（PPD)及 特異性丫 -IFN檢測，但PPD不能有效區分卡介苗接種與結核分枝桿菌菌感染，更不能鑒別 結核菌感染者體內有無存活的結核桿菌；特異性T-IFN檢測費用昂貴、檢測技術高等實際 問題，難W在結核病高發的發展中國家實施。所W，研發一種特異性強、價格合理、方便使用 的結核菌潛伏感染用診斷試劑，是預防和治療的前提。
[0004] 結核分枝桿菌早期分泌性低分子量蛋白ESAT6,能誘導機體產生明顯的T細胞免 疫應答和釋放高水平IFN-丫。ESAT6蛋白具有良好的抗原刺激性并能被大多數結核病患者 所識別。另一種低分子量結核桿菌培養濾液蛋白CFPlO與ESAT6同屬于ESAT6家族，也是 免疫優勢抗原，能誘導機體產生免疫應答。 陽0化]W結核菌生長過程中早期分泌的特異性ESAT6、CFPlO蛋白為研究對象，研制一種 特異性強、價格合理、方便使用的結核菌潛伏感染用診斷試劑，是近年來國內外研究重點。 研究文獻資料結果顯示，無論是結核病的體外診斷還是皮膚試驗，聯用兩種或兩種W上抗 原的診斷效果均好于單一抗原。專利CN200710062693. 7公開了一種化ISpot結核感染診 斷試劑盒及其應用，該試劑盒中包含有關鍵試劑CFP10-ESAT6融合蛋白，該試劑盒可通過 對采集的血液樣本進行檢測W確定是否有結核菌感染情況。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種重組結核桿菌ESAT6-CFP10蛋白及其制備方法，為結 核菌感染人群篩查、結核病流調提供一個穩定、安全、有效、經濟、易行的措施。 陽007] 本發明所提供的重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白，氨基酸序列SEQIDNO. 1， 核巧酸序列SEQIDNO. 2,其是通過大腸桿菌表達系統進行原核表達和純化得到。
[0008] 本發明所提供的重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制備方法，包括 ESAT6-CFP10融合蛋白表達菌株的構建W及ESAT6-CFP10融合蛋白的表達與純化。
[0009] 上述所述重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制備方法中，所述ESAT6-CFP10 融合蛋白表達菌株的構建包括：（1)基因ESAT6和基因CFPlO的引物設計、合成及擴增；（2) pET-30a-ESAT6-CFP10重組質粒的構建；（3)大腸桿菌化21的轉化。
[0010] 上述所述重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制備方法中，所述步驟（1)，基因 ESAT6的上游引物序列SEQIDNO. 3、下游引物序列SEQIDNO. 4;基因CFPlO的上游引物 序列沈QIDNO. 5、下游引物序列沈QIDNO.6。 陽0川上述所述重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制備方法中，步驟似pET-30a-ESAT6-CFP10重組質粒的構建是先W祀T-30a質粒和ESAT6基因構 建祀T-30a-ESAT6重組質粒，再WpET-30a-ESAT6重組質粒和CFPlO基因構建 pET-30a-ESAT6-CFP10 重組質粒。
[0012] 上述所述重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制備方法中，所述W祀T-30a 質粒和ESAT6基因構建祀T-30a-ESAT6重組質粒的方法為：用化nI及NdeI限制性 內切酶分別對祀T-30a質粒和ESAT6基因進行雙酶切，回收雙酶切產物并置于PCR儀上， 16°C，連接2小時，轉化入大腸桿菌D冊a感受態細胞，選取單克隆菌落進行PCR鑒定和 重組質粒的測序分析，確定陽性克隆；所述W祀T-30a-ESAT6重組質粒和CFPlO基因構 建祀T-30a-ESAT6-CFP10重組質粒的方法為：用化nI及EcoRI限制性內切酶分別對 pET-30a-ESAT6重組質粒和CFPlO基因進行雙酶切，回收雙酶切產物并置于PCR儀上，16°C， 連接2. 5小時，轉化入大腸桿菌D冊a感受態細胞，選取單克隆菌落進行PCR鑒定和重組質 粒的測序分析，確定陽性克隆。
[0013] 上述所述重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制備方法中，ESAT6-CFP10融 合蛋白的表達與純化是通過IPTG誘導表達重組大腸桿菌，菌體破碎離屯、后上清液通過 SOURCE 30Q離子交換柱層析進行純化，并對純化后的蛋白進行相關鑒定和分析。
[0014] 上述所述重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制備方法中，步驟（3)大腸桿 菌化21的轉化是將祀T-30a-ESAT6-CFP10重組質粒轉化入大腸桿菌化21感受態細胞，經 PCR、測序篩選陽性轉化子。
[0015] 本發明所提供的重組結核桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白，可在制備用于結核菌潛伏 感染人群的篩查和結核病的輔助診斷試劑中應用。
[0016] 本發明所述大腸桿菌原核表達的ESAT6-CFP10融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示。該蛋白經過PCR分別擴增出具有NNNI、化KI酶切位點的ESAT6片 段及具有化KI、邸ORI酶切位點的CFPlO片段，通過酶切、連接、轉化構建重組質粒 祀T30a-ESAT6-CFP10,將該質粒轉化入大腸桿菌D冊a，經PCR、測序分析篩選出陽性克隆； 將擴增后的重組質粒轉化大腸桿菌化21，經PCR、測序及蛋白表達分析篩選陽性轉化子； IPTG誘導表達重組大腸桿菌化21。發酵菌體高壓均質破碎后離屯、所得上清液通過離子交 換層析和凝膠層析進行純化，純化后的蛋白經鑒定為ESAT6-CFP10融合蛋白。
[0017] 本發明W TB-PPD(結核菌素純蛋白衍生物）、PPD-B(胞內分枝桿菌純蛋白衍生 物）和重組結核桿菌ESAT6-CFP10蛋白等不同變態反應原對分別建立的結核分枝桿菌活 菌、結核分枝桿菌死菌W及卡介菌活菌致敏的豚鼠模型進行遲發型超敏反應試驗（即皮膚 試驗），于注射后24h、4化觀察局部硬結的縱徑與橫徑，根據48h的反應結果進行判定，平 均硬結反應直徑（縱徑與橫徑相加除W2)不小于5mm判為陽性，小于5mm判為陰性。結 果顯示：重組結核桿菌ESAT6-CFP10蛋白對卡介菌活菌致敏豚鼠和結核分枝桿菌死菌致敏 豚鼠的皮試均呈陰性反應，而對結核分枝桿菌活菌致敏豚鼠的皮試呈陽性反應；TB-PPD和 PPD-B對卡介菌活菌、結核分枝桿菌活菌和結核分枝桿菌死菌致敏豚鼠的皮試均呈陽性反 應。ESAT6-CFP10融合蛋白能夠區別卡介苗接種還是結核菌感染W及結核菌感染者體內有 無存活結核桿菌。
[0018] 相對于現有技術，本發明的有益效果是：將結核分枝桿菌早期分泌性低分子量蛋 白ESAT6和CFPlO融合在一起，通過原核表達系統表達了重組蛋白ESAT6-CFP10,該重組結 核桿菌ESAT6-CFP10蛋白在2~8°C環境下保存24個月均未出現降解，安全穩定，同時本 發明的重組結合桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白還克服了單個蛋白由于分子量太小不易純化 的缺點，可經皮膚試驗用于識別檢測是否結核菌潛伏感染。動物學實驗顯示，重組結核桿菌 ESAT6-CFP10蛋白有望用于結核菌潛伏感染人群的篩查W及結核病的輔助診斷。同時克服 了通用的特異性丫-IFN檢測方法價格昂貴、設備及操作人員要求高的的缺點，具有使用方 便、易于推廣、適合于大規模普及的特點。
【附圖說明】
[0019] 圖1是目的基因ESAT6擴增產物電泳圖；
[0020] 其中，1:DNAMark化值1^-2, 000)，2-4 :ESAT6目的基因產物。
[0021] 圖2是目的基因CFPlO擴增產物電泳圖；
[0022] 其中，1:DNAMark化值1^-2, 000)，2 :CFP10 目的基因產物。 陽02引 圖3是祀T-30a-ESAT6重組質粒目的基因電泳圖；
[0024]其中，1:DNAMarkNHDk2, 000)，2-7 :分別為祀 1'-30曰-65416-1、2、3、4、5、6重組 質粒的菌落PCR反應產物。 陽0巧]圖4是質粒祀T-30a-ESAT6-CFP10轉化D冊a菌落PCR電泳圖；
[0026]其中，1:DNAMarkNHDk2, 000)，2-7 :分別為祀T-30a-ESAT6-CFP10-l、2、3、4、5、 6重組質粒的菌落PCR反應產物。
[0027] 圖5是祀T-30a-ESAT6-CFP10質粒轉化化21菌落的PCR電泳圖；
[0028]其中，1:DNAMarkNHDk2,000)，2-7 :分別為祀T-30a-ESAT6-CFP10-BL21-l、2、 3、4、5、6重組質粒的菌落PCR反應產物。
[0029] 圖6是ESAT6-CFP10融合蛋白誘導表達電泳圖；
[0030]其中，1-3 :pET-30a-ESAT6-CFP10-BL21 菌落 1、2、3 誘導表達目的蛋白，4: pET-30a-ESAT6-CFP10-BL21菌落陰性對照（未誘導），5 :蛋白Mark化。
[0031] 圖7是凝膠層析后的高純度ESAT6-CFP10融合蛋白SDS-PAGE圖；
[0032]其中，Ol:蛋白MarkNr，02 :ESAT6-CFP10 融合蛋白。
【具體實施方式】
[0033] 下述實施例是對于本
【發明內容】
的進一步說明W作為對本發明技術內容的闡釋，但 本發明的實質內容并不僅限于下述實施例所述，本領域的普通技術人員可W且應當知曉任 何基于本發明實質精神的簡單變化或替換均應屬于本發明所要求的保護范圍。
[0034] 實施例1 :ESAT6-CFP10融合蛋白表達菌株的構建和鑒定
[0035] 1.目的基因ESAT6、CFPlO的引物設計、合成及擴增
[0036] 根據GNKNBa趾中查找目的蛋白基因序列，用01igo6. 0軟件設計引物， ESAT6-CFP10的ESAT6的上游引物為PU下游引物為P2 ;CFP10的上游引物為P3、下游引 物為P4。其中P2刪除終止密碼TGA;P3刪除起始密碼ATG;P1、P2、P3、P4相應添加了DNA 限制性內切酶酶切位點，酶切位點（劃線部分）分別是？1化(16 1)、？2(化111)、？3(化11 I)、P4(EcoRI)，在酶切位點的5'端分別添加相應的保護堿基。弓I物序列如下表：
[0038] 備注：下劃線分別為內切酶的酶切位點，斜體部分為起始密碼子。
[0039]W中國食品藥品檢定研究院提供的結核分枝桿菌標準株H37R