專利名稱：由小分子靶向人癌中的gli蛋白的制作方法
相關申請的交叉參考
本申請要求2005年12月9日提交的美國臨時申請序列號60/748,968和2006年1月30日提交的美國臨時申請序列號60/763,829、2006年12月7日提交的美國申請序列號11/608,197的優先權，將其全部內容納入本文作參考。
發明領域 本發明總地涉及抑制腫瘤發生、腫瘤生長和腫瘤存活的組合物和方法。該組合物包含抑制Hedgehog和GLI信號傳導途徑的小分子化合物。

背景技術：
在胚胎發生、組織再生和癌發生的過程中，Hedgehog(Shh或Hh)、WNT、FGF和BMP信號傳導途徑形成網絡。Hh信號傳導途徑的異常激活導致的病理后果是各種人體腫瘤，如胃癌和胰腺癌。Hedgehog是一種分泌糖蛋白，它通過結合含有PATCHED1(ptch1)和SMOOTHENED(smo)的跨膜蛋白復合物和引發胞質信號轉導事件級聯反應而啟動Hh信號轉導，包括抑制導致GLI鋅指轉錄因子轉錄的蛋白激酶A。接著，鋅指轉錄因子GLI家族以內容依賴性和細胞類型特異性方式將胞外Hh刺激轉化成確定的轉錄程序(Ruiz I Altaba等，2002，Nat.Rev.Cancer 2361-72)。
包括GLI蛋白在內的幾種蛋白質參與介導Hh信號轉導(Katoh和Katoh，2005，Cancer Biol.Ther.41050-4)。脊椎動物至少有三種不同的GLI蛋白，即GLI(也稱為GLI1)、GLI2和GLI3。這些蛋白質是鋅指轉錄因子GLI家族的成員，共享高度保守的C2-H2鋅指結構域(含有五個鋅指DNA-結合基序)，含有果蠅(Drosophila)翅脈中斷(Cubitus interruptus)(Ci)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)性別決定基因tra-1(Hui等，1994，Dev.Biol.162402-13)。在果蠅中，需要Ci來激活hedgehog靶點，Ci也用作Hedgehog表達的阻抑物。
在脊椎動物胚胎發育期間，所有表達部分重疊的基因響應Hh信號轉導而被轉錄激活，能夠介導激活該途徑引起的大部分效應。在脊椎動物發育過程中，GLI1、GLI2和GLI3各自具有特定功能(Kinzler等，1984，Nature332371-374；Ruppert等，1988，Mol.Cell.Biol.83104-3113；Walterhouse等，1993，Dev.Dyn.19691-102；Hui等，1994，Dev.Biol.162402-413)。例如，Gli2突變小鼠顯示出嚴重的骨骼異常，包括顎裂、牙齒缺陷、椎體和椎間盤缺失、四肢和胸骨短小(Mo等，1997，Development 124113-23)。
Gli3是幾種身體結構的發育和分化中的重要控制基因。例如，基因數量下降導致嚴重的干擾，特別是對于四肢形態發生(Vortkamp等，1995 DNACell Biol.14629-34)。另外，在幾種人體畸形綜合征，如影響四肢和顱面發育的格雷格頭多指(cephalopolydactyly)綜合征(GCPS)和Pallister-Hall綜合征的常染色體顯性形式中鑒定到GLI3的突變。(Vortkamp等，1991，Nature352539-40；Bose等，2002，Hum.Mol.Genet.111129-35)。在小鼠中，小鼠突變的多余趾中牽扯到GLI3突變。
GLI蛋白用作轉錄激活物，通過其鋅指結構域結合于靶基因的啟動子和/或增強子序列內的DNA結合位點。近年來，鑒定到GLI蛋白結合的DNA結合序列。例如，GLI3鋅指結合的DNA序列由16個核苷酸組成，與GLI和tra-1蛋白結合的序列高度相似(Vortkamp等，1995，DNA Cell.Biol.14629-34)。這一結合位點包括以前在GLI蛋白中鑒定到的9-堿基對序列5′-GACCACCCA-3′(Kinzler和Vogelstein，1990，Mol.Cell Biol 10634-42)。據信，GLI、GLI2和GLI3結合相同或相似的DNA序列(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.2733496-3501)。近年來，Hallikas等驗證了作為GLI1、GLI2和GLI3蛋白結合位點的9bp共有序列5′-GACCACCCA-3′(Hallikas等，2006，Cell 12447-59)。
由GLI2和GLI3蛋白激活Hh/GLI靶基因可能需要轉錄共激活蛋白Creb Bing蛋白(CBP)，它能結合CBP結合域(參見

圖1；Dai等，1999，J.Biol.Chem.2748143-52；Kasper、Regl、Frischauf和Aberger，2006，Eur.J.Cancer)。
據報道，GLI1表達在GLI2和GLI3蛋白的控制下(Dai等，1999，J.Biol.Chem.2748143-52)。雖然整個GLI1蛋白是轉錄激活物，但GLI2和GLI3同時含有激活域和阻抑域(見圖1)。可通過蛋白激酶A(PKA)的作用加工GLI2和GLI3實現不同功能。全長GLI2用作弱轉錄激活物。截短一半C末端活化結構域會產生具有阻抑活性的蛋白質，而去除N末端的阻抑結構域則將GLI2轉變為強激活物。在轉基因小鼠胚胎中，不像全長蛋白質那樣，N末端截短的GLI2能激活(例如)Sonic hedgehog(Shh)基因HNF3β。這表明，暴露GLI2的激活結構域是Shh信號傳導途徑的關鍵機制之一。也描述了GLI3(而非GLI)的涉及N末端區的相似調控機制。(Sasaki等，1999，Development 1263915-24，全文納入本文作參考)。
鼠和人GLI3 cDNA的比較揭示出，推倒出的氨基酸序列之間總體同源性為85％，在某些結構域(包括鋅指)中保守性更高(>95％)(Thien等，1996，Biochim.Biophys.Acta 1307267-9)。
近年來，在包含氨基酸殘基1020-1091的羧基端鑒定到GLI的轉錄激活域。此結構域包含18個氨基酸α-螺旋(氨基酸1037-1054)，其中含有6個天冬氨酸或谷氨酸殘基或(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.2733496-3501)。這一α螺旋區與單純皰疹病毒蛋白16(VP16)轉錄激活域非常相似，包含保守基序FXXΦΦ(F＝苯丙氨酸；X＝任何殘基；Φ＝任何疏水性殘基)，稱作TAFII31的酸性激活域的普通識別元件。此外，發現了三個保守的氨基酸殘基(VP16中的Asp472、Phe479和Leu483和GLI中的Asp1040、Phe1048和Leu1052)能與TBP相關因子(TAF)TAFII31直接接觸(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.2733496-3501；Goodrich等，1993，Cell 75519-530；Klemm等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925788-5792；Uesugi等，1997，Science2771310-1313)。
其它GLI家族蛋白中存在相似的結構域。例如，描述過推定TAFU31結合域，其包含NH2-INKDNLRKDLFTVSIKA-COOH(果蠅Ci，氨基酸殘基1044-1060)，NH2-DMADFEFEQMFTDALGI-COOH(VP16，氨基酸殘基469-485)，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI，氨基酸殘基1037-1054)，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(小鼠GLI，氨基酸殘基1040-1057)，NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512)和NH2-DSQLLEPPQIDFDAIMDD-COOH(小鼠GLI2，氨基酸殘基1509-1526)。(Yoon等，1998，J.Biol Chem.2733496-3501)。此外，可由(如)GenBank登錄號AAY87165鑒定到人GLI2的推定TAFII31相互作用結構域NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(氨基酸殘基1501-1518)。另外，可由(如)GenBank登錄號Q61602鑒定到小鼠GLI3的推定TAFII31相互作用結構域NH2-ESHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(氨基酸殘基1497-1514)。用粗體和下劃線表示接觸TAFII31的保守氨基酸殘基。
雖然我們對果蠅和鼠發育過程中的Hh信號轉導知之甚多，但對隨人癌中Hh信號轉導和GLI活性而激活的分子機制和成瘤程序的了解仍然非常有限。Hh相關性癌癥的共同特性是一種或多種GLI蛋白表達水平升高。例如，近年來，發現GLI1在很多癌癥類型中過度表達，包括前列腺癌、胰腺癌和小細胞肺癌(Karhadkar等，2004，Nature 431707-12)。此外，發現Gli在兒童肉瘤中擴增，在惡性膠質瘤中增加了50倍以上(Roberts等，1989，Cancer Res.495407-13；Kinzler等，1987，Science 23670-3)。雖然業已發現Hedgehog(Hh)和其受體Patched(Ptch)在非小細胞肺癌(NSCLC)中過表達，但在這一癌癥類型中沒有發現GLI1的表達。
例如，與正常皮膚相比，在基底細胞癌(BCC)病變中發現GLI2過度表達(Ecram等，2004，J.Invest Dermatol 1221503-9；Regl等，2002，Oncogene215529-39；Hutchin等，2005，Genes Dev.19214-23)。此外，根據GLI2和GLI3的加工，在許多癌癥類型(包括肺癌和前列腺癌)的腫瘤發生過程中，GLI2和/或GLI3可能對激活Hh信號轉導更重要。
肺癌是美國和世界上癌癥死亡的主要原因，每年美國新診斷的肺癌病例>170,000，全球新診斷的肺癌病例則將近一百萬(Minna等，2002，CancerCell.1(1)49-52)。盡管在過去幾十年中產生了一些治療肺癌的激進方法，但肺癌的5年存活率仍然低于15％。肺癌分為兩類非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)。NSCLC(占所有癌癥的75-80％)由三種主要類型組成腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌(Minna等，2002，Cancer Cell.1(1)49-52)。肺癌和鱗狀細胞癌占所有肺癌的60-70％。在晚期疾病中通常采用手術、化療和放療，但結果并不令人滿意。提高肺癌治療功效是一個主要的公共衛生目標。
前列腺癌可能是男性最常見的實體瘤(Nelson等，2003，N.Engl.J.Med.349366-381)。例如，50％超過50歲的男性和基本上所有超過70歲的男性都患有某種形式的前列腺增生。在美國，前列腺癌是最頻繁診斷的癌癥，每年診斷的新病例超過250,000例。每年有40,000男性死于前列腺癌。
因此，對涉及Hh/GLI信號轉導的各種頻發和致死性惡性腫瘤而言，特異性靶向Hh/GLI-信號傳導途徑可提供治療各種致死性腫瘤的非常有效的治療方案(Pasca di Magliano和Hebrok，2003，Nat.Rev.Cancer 3903-911；Sanchez等，2005，Cancer Res.652990-2；Kasper、Regl、Frischauf和Aberger，2006，Eur.J.Cancer)。異位Hh或GLI信號傳導途徑激活導致的人類疾病的治療可能需要使用通路拮抗劑。迄今為止，通過在不同水平上阻斷信號轉導通路的信號轉導拮抗劑的治療抑制異位活性。例如，抗-Shh抗體在細胞外發揮作用，而植物生物堿，環杷明在細胞膜中的Smo水平發揮作用(參見例如美國專利申請號2005/0130922 A1；Taipale等，2000，Nature4061005-9；Sanchez和Ruiz I Altaba，2005，Mech.Dev.122(2)223-30；Athar等，2004，Cancer Res.64(20)7545-52)。描述了Hedgehog信號轉導和Smo結合的小分子調節劑，包括合成的非肽小分子Hh-Ag(Frank-Kamenetsky等，2002，J.Biol.1(2)10)、HhAntag(Romer等，2004，Cancer Cell.6(3)229-40)和Cur61414(Williams等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(8)4616-21)。此外，利用福斯高林在細胞內激活蛋白激酶A(PKA)，它是GLI信號傳導途徑的胞質抑制劑。然而，這些方法有缺點。例如，給予治療有效量的抗Shh抗體在患者中難以實現并可能影響其它正常的通路依賴性細胞。環杷明非常昂貴，僅可用于治療通過在Smo或以上水平激活Hh信號傳導途徑產生的疾病。另外，由于PKA的廣泛活性，給予福斯高林可能產生許多副作用。相反，使用抑制GLI信號轉導的小分子化合物則大有希望。
本發明者解決了在GLI蛋白，特別是GLI3過度表達的癌癥治療中尚未滿足的巨大需求。本發明提供了用于檢測和治療GLI3蛋白過度表達的許多癌癥的小分子化合物、藥物組合物、試劑盒和方法。這類癌癥包括肺癌、NSCLC、乳腺癌、結腸癌、間皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌、膠質瘤等。
發明概述 在本發明中，本發明者發現，GLI3蛋白的激活域(約70kDa)在多種人癌細胞系中過度表達，這些細胞系包括肺癌、NSCLC、乳腺癌、結腸癌、間皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌、膠質瘤等細胞系。也在轉移性結腸癌和肉瘤組織樣品中發現了GLI3的過度表達(>95％)。
因此，本發明者提出，在這些癌癥、而非正常細胞中抑制GLI3蛋白的活性形式能誘導顯著凋亡。可通過不同方式抑制GLI3蛋白信號轉導，包括但不限于(i)直接抑制GLI3蛋白的轉錄活性，(ii)抑制GLI3前體蛋白的加工，(iii)抑制GLI3激活域的磷酸化，或者(iv)抑制任何參與活性GLI3蛋白產生過程的細胞蛋白。可通過多種方式抑制GLI3蛋白信號轉導，例如使用小分子化合物、siRNA、肽或反義寡核苷酸。本發明提供了抑制GLI蛋白信號轉導，特別是GLI3蛋白信號轉導的小分子化合物。
在一個實施方式中，本發明提供具有下式的小分子化合物
式中X1和X2各自獨立地是N或C，式中X1和X2之一是N，X1和X2之一是C，因此環N與X1或X2的C形成雙鍵。此外，R1、R2和R3各自獨立地選自用0-3個R6基團任選取代的C1-C6烷基、芳基、雜芳基、環烷基和雜環烷基，所述R6基團各自獨立地選自氫、鹵素、C1-C6烷基、-OR7、-C(O)R7、-OC(O)R7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、-N(R7)C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標m是0、1或2。Y是直接鍵或C1-C4烷基，Z選自C1-C4烷基、芳基和雜芳基。R4是氫、鹵素、-OR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標m是0、1或2。R5是氫、C1-C6烷基，或任選與Y聯合形成5-6元雜環。R7各自獨立地是H或C1-C6烷基。
此外，也考慮了本發明小分子化合物的鹽、水合物、溶劑合物、異構體和前藥。
在另一實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是芳基。在另一實施方式中，R1、R2和R3各自是苯基。
在另一實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中R4是羥基。在另一實施方式中，Z是C1-C4烷基。在另一實施方式中，Z是芳基。在又一實施方式中，Z是苯基。
在另一實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是苯基，Y是C1-C4烷基，Z是C1-C4烷基或苯基，R4是羥基。
在另一實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中X1是C、X2是N。在又一實施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結構
在又一實施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結構
在其它實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中X1是N、X2是C。在另一實施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結構
在又一實施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結構
本發明還提供了藥物組合物和藥物。因此，在另一實施方式中，本發明提供了含有本發明小分子化合物和藥學上可接受的運載體的藥物組合物。
本發明還提供了使用本發明小分子化合物的方法。在本發明的一個方面，提供了一種誘導表達GLI蛋白的腫瘤細胞發生凋亡的方法。此方法包括使腫瘤細胞與足量的本發明小分子化合物相接觸的步驟，其中所述接觸步驟能誘導腫瘤細胞凋亡。GLI蛋白優選GLI2或GLI3。
在該方法的一個實施方式中，給予所述小分子化合物作為癌癥治療方案的一部分。
在本發明的另一方面，提供了一種抑制細胞的不良生長、過度增殖或存活中至少一種行為的方法。該方法包括確定該細胞是否表達GK基因或是GLI蛋白的步驟。該方法還包括使所述細胞與有效量的本發明小分子相接觸的步驟，其中所述接觸步驟導致抑制所述細胞的不良生長、過度增殖或存活中的至少一種行為。
用于本發明方法的細胞或腫瘤細胞選自結腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質瘤細胞。
可以在體外或體內實施本發明方法。因此，在本發明的另一方面，提供了一種治療癌癥患者的方法。該方法包括給予該對象治療有效量的小分子化合物的步驟，其中所述癌癥的特征是表達GLI多肽，優選GLI3多肽，所述給藥步驟導致治療該對象。
在本發明另一優選實施方式中，提供了一種抑制細胞中GLI蛋白活性的方法。該方法包括使所述細胞與本發明小分子化合物相接觸的步驟，其中所述接觸步驟導致抑制了所述細胞中GLI蛋白的活性。受抑制的GLI蛋白活性優選是GLI蛋白與細胞蛋白或核蛋白之間的蛋白質相互作用。優選的核蛋白是TAF蛋白、TATA框結合蛋白相關因子，優選TAFII31蛋白。
另外，本發明提供了一種抑制含有操作性連接于該基因啟動子的GLIDNA結合位點的基因表達的方法。此方法包括使表達GLI DNA結合位點操作性連接于其啟動子的基因的細胞與本發明小分子化合物相接觸的步驟，其中所述接觸步驟導致抑制該基因的表達。在本發明的優選實施方式中，所述基因是Wnt2基因，優選人Wnt2基因。
另外，本發明提供了本發明小分子化合物在制備抑制細胞的不良生長、過度增殖或存活中至少一種行為的藥物中的應用。在另一方面，提供了小分子化合物在制備治療癌癥的藥物中的應用。在又一實施方式中，本發明提供了小分子化合物在制備誘導細胞凋亡的藥物中的應用。在另一方面，提供了本發明小分子化合物在制備抑制細胞的GLI蛋白信號轉導的藥物中的應用。
另一方面，本發明提供了篩選方法。本發明優選方法是鑒定能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白之間的蛋白質相互作用的候選化合物的方法。在一個實施方式中，該方法包括以下步驟使候選化合物與含有GLI蛋白和TAFII31蛋白的樣品相接觸；和確定GLI蛋白與TAFII31蛋白的結合。與不存在候選化合物時GLI蛋白與TAFII31的結合相比，在候選化合物存在下GLI蛋白與TAFII31的結合水平降低表明該候選化合物能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白的相互作用。
本文提供的另一種方法是鑒定調節GLI蛋白活性的化合物的方法。在一個實施方式中，GLI蛋白活性是GLI蛋白依賴性轉錄活性，該方法用于鑒定調節GLI蛋白依賴性轉錄活性的化合物。所述方法包括使樣品與候選化合物相接觸的步驟，其中所述樣品包含具有操作性連接于報道基因的一個或多個GLI DNA結合位點的表達報道構建物；以及如果有，則測定所述候選化合物對GLI蛋白依賴性轉錄活性水平的影響。
附圖簡要說明 圖1顯示了GLI3的轉錄激活域的位置。GLI3轉錄激活域位于C末端附近，含有保守的VP16樣激活區(TAFII31結合域)，是GLI3的激活功能、而非GLI3的阻抑功能所必需。認為此FXXΦΦ基序與TAFII31直接接觸。在GLI3中，此結構域含有氨基酸序列FDAII。
圖2顯示了用于檢測人細胞系中的Gli3表達的半定量RT-PCR分析。該圖中，上圖是GLI3的示意圖，顯示了阻抑結構域(氨基酸殘基1-397)、鋅指結構域(氨基酸殘基482-637)和CBP-結合域(氨基酸殘基827-1132)。指出了PCR引物F2和R2的大概位置(詳見表1)。該圖中，中間的圖片(泳道1-17)顯示了用RT-PCR分析的以下細胞系正常肝臟(泳道1)；NSCLCH1703、H460和A549(泳道2-4)；乳腺癌HuL100、BT474和MCF-7(泳道5-7)；間皮瘤Met5A、H290、REN、H513、H28、211H和LARK1A(泳道8-14)；結腸癌SW480(泳道15)；一對原代NSCLC組織樣品(泳道16和17分別是正常和癌癥組織)。該圖中，下圖(泳道1-29)顯示了用RT-PCR分析的以下細胞系結腸癌SW480、HCT116、HT29、Lovo和CaCO2(泳道1-5)；正常結腸(泳道6)；正常腎細胞系HRE-152和HK-2(泳道7和8)；腎細胞癌786-Om Caki、769-P、A704和OMRC3(泳道9-13)；正常肺(泳道14)；間皮瘤REN、H290、211H、H513、H2052、H28和MS-I(泳道15-21)；NSCLCA549、H460、H838、H1703、H1229、H1650、H1975和A427(泳道22-29)。大多數癌細胞系和原代組織樣品表達Gli3。值得注意的是，在結腸癌細胞系HT29中沒有檢測到Gli3的表達(下圖，泳道2)。詳見實施例4。
圖3顯示了手工繪制的小分子化合物FN1-5和GLI3的FXXΦΦ基序(氨基酸序列FDAII)的RMS重疊圖。FDAII顯示為α螺旋。詳見(如)實施例2。
圖4顯示了小分子化合物FN1-1、FN1-2、FN1-3、FN1-5和FN2-1的初步篩選。設計該小分子化合物以抑制GLI3轉錄激活(TAF-結合域)。觀察到小分子化合物FN1-5能顯著殺傷所有檢測的癌細胞。DMSO用作對照。詳見(如)實施例5。
圖5是流式細胞術分析圖，其中顯示小分子化合物FN1-5能誘導結腸癌細胞系SW480凋亡。在100μM FN1-5時觀察到顯著凋亡(58.6％)，這與染色結果相符。詳見(如)實施例5和6。
圖6顯示用細胞毒試驗和NSCLC細胞系H1299、A549和H460篩選小分子化合物FN1-7、FN1-8和FN3-5，如本文所述。用小分子化合物FN1-8處理時，在所有癌細胞中觀察到顯著的細胞殺傷作用。詳見(如)實施例5。
圖7顯示用小分子化合物FN1-5、FN1-8、FN1-7、FN1-9U和FN1-9S處理LOX細胞(黑色素瘤)后細胞毒試驗的結果。一致性地，用FN1-5和FN1-8處理時觀察到顯著細胞殺傷作用。用小分子化合物FN1-7和FN1-9U孵育LOX細胞時也觀察到一些殺傷作用。活細胞用0.5％結晶紫染色。DMSO用作對照。詳見(如)實施例10。
圖8顯示不同小分子化合物對由組織樣品新鮮制備的原代培養的人間皮瘤細胞的作用。在FN1-5和FN1-8中觀察到顯著的細胞殺傷作用。在相同劑量下，小分子化合物FN1-8殺傷這種原代培養物的效力高于FN1-5。DMSO用作對照。詳見(如)實施例11。
圖9顯示用小分子化合物FN1-1、FN1-2、FN1-3、FN1-5、FN1-7、FN1-8、FN2-1、FN2-5和FN3-5調節NSCLC細胞系A549中的Wnt2啟動子活性。FN1-5和FN1-8均能顯著下調Wnt2啟動子活性。DMSO和＂空載體＂是對照。詳見(如)實施例27。
圖10顯示用小分子化合物FN1-5、FN1-7、FN1-8、FN1-9U、FN1-9S、FN2-1和FN3-5調節結腸癌細胞系HCT116的TOP/FOP活性。發現FN1-5和FN1-8能顯著下調TOP/FOP活性。DMSO用作對照。詳見(如)實施例31。
圖11顯示，小分子化合物FN1-5和FN1-8不調節NSCLC A549細胞的SOCS3啟動子活性。空載體和DMSO用作對照。詳見(如)實施例32。
圖12顯示用FN1-5和FN1-8處理后結腸癌細胞中Dvl-3、胞漿β-聯蛋白、存活素和肌動蛋白(對照)的Western印跡分析。小分子化合物FN1-5和FN1-8能抑制結腸癌細胞中的經典Wnt信號轉導。詳見(如)實施例33。
圖13顯示用FN1-5和FN1-8處理后NSCLC細胞中Dvl-3、胞漿β-聯蛋白、存活素和肌動蛋白(對照)的Western印跡分析。小分子化合物FN1-5和FN1-8能抑制NSCLC細胞中的經典Wnt信號轉導。詳見(如)實施例33。
圖14顯示時程實驗的結果，表明FN1-8能誘導Malme-3M細胞(A)、A375細胞(B)和SK-Mel-5細胞(C)發生顯著凋亡，而不誘導人正常皮膚成纖維細胞細胞(D)凋亡。詳見實施例10。
圖15顯示小分子化合物FN1-8能下調黑色素瘤細胞系Malme-3M(A)、A375(B)、SK-Mel-2(C)和SK-Mel-5(D)中GLI1-誘導的轉錄活性。詳見實施例29。
圖16顯示小分子化合物FN1-8能降低NSCLC細胞系A549中GLI蛋白-TAF誘導的轉錄激活水平。詳見實施例35。
圖17顯示小分子化合物FN1-8在小鼠異種移植瘤模型NSCLCH460(箭頭)和黑色素瘤LOX(箭頭)中的體內功效。用FN1-8處理后顯著抑制了腫瘤生長。詳見(如)實施例36和37。
圖18顯示用小鼠異種移植瘤模型(NSCLC H460)進行的小分子化合物FN1-8的體內功效研究。A.用小分子化合物FN1-8處理后顯著抑制了腫瘤生長。箭頭指出每天注射小分子化合物FN1-8或用作對照的DMSO(連續6天各兩次)。B.顯示由各組小鼠切下的腫瘤。DMSO，DMSO處理；FN1-8，用本文所述的小分子化合物FN1-8處理。C.用FN1-8處理后瘤重顯著降低。結果是平均值±SD(誤差線)。詳見(如)實施例36。
圖19顯示用小鼠異種移植瘤模型(黑色素瘤LOX)進行的小分子化合物FN1-8的體內功效研究。A.用小分子化合物FN1-8處理后顯著抑制了腫瘤生長。箭頭指出每天注射小分子化合物FN1-8或用作對照的DMSO(連續6天各兩次)。B.顯示由各組小鼠切下的腫瘤。DMSO，DMSO處理；FN1-8，用本文所述的小分子化合物FN1-8處理。C.用FN1-8處理后瘤重顯著降低。結果是平均值±SD(誤差線)。詳見(如)實施例37。
圖20顯示用小鼠異種移植瘤模型(結腸癌HT29)進行的小分子化合物FN1-8的體內功效研究。詳見實施例35。A.用小分子化合物FN1-8處理后腫瘤生長不受影響。箭頭指出每天注射小分子化合物FN1-8或用作對照的DMSO(連續6天各兩次)。B.用FN1-8處理后瘤重類似于DMSO對照組。結果是平均值±SD(誤差線)。詳見(如)實施例38。
圖21顯示小分子化合物FN1-5(A)和FN1-8(B)在小鼠(腹膜內注射)中的藥代動力學分析。結果表示為獲自三只小鼠的數據的平均值和SD(誤差線)。詳見實施例43。
圖22顯示小分子化合物FN1-5(A)和FN1-8(B)在小鼠(口服給藥)中的藥代動力學分析。結果表示為獲自三只小鼠的數據的平均值和SD(誤差線)。詳見實施例43。
圖23顯示共免疫沉淀分析的定量結果，該結果證明，小分子化合物FN1-8能阻斷GLI蛋白和TAFII31蛋白的蛋白質相互作用。通過測定共免疫沉淀實驗中各條帶的密集度(任意單位)定量測定GLI-TAF結合域肽(GLI-TAFbd)和TAFII31蛋白的結合。將DMSO處理后各GLI-TAFbd肽的結合設定為100％。FN1-8以劑量依賴方式干擾了這種結合用20 μM和50μM FN1-8處理后，GLI1-TAFbd的結合分別為73.6％和33.5％，GLI2-TAFbd分別為73.8％和60％，GLI3-TAFbd分別為71.6％和28.6％。詳見實施例35。
發明詳述 I.定義 除非另有定義，本文所用的所有科技術語具有本發明所屬領域技術人員通常理解的含義。以下參考文獻為技術人員提供了本發明所用許多術語的普通定義Singleton等，微生物學和分子生物學字典(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology)(第2版，1994)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(劍橋科技字典)(Walker編，1988)；TheGlossary of Genetics(遺傳學詞匯表)，第5版，R.Rieger等(編)，SpringerVerlag(施普林格出版社)(1991)；以及Hale和Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology(哈珀柯林斯生物學字典)(1991)。本文所用的以下術語具有所屬含義，除非另有說明。
本文所用術語＂烷基＂指含有所示碳原子數的直鏈或支鏈烴基(即C1-C10指1-10個碳)，可包括二價和多價基團。飽和烴基的例子包括以下基團，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的類似物和異構體。
本文所用術語＂烯基＂指含有一個或多個雙鍵的不飽和烷基。烯基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁間二烯基)、2，4-戊二烯基和3-(1，4-戊二烯基)以及更高級的類似物和異構體。
本文所用術語＂炔基＂指含有一個或多個三鍵的不飽和烷基。炔基的例子包括乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基以及更高級的類似物和異構體。
術語＂氨基酸＂指天然產生和合成的氨基酸，以及功能類似于天然產生氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產生氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。＂氨基酸類似物＂指與天然產生氨基酸的基本化學結構相同的化合物，如含有結合于氫、羧基、氨基和R基團的α碳，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物可含有修飾的R基團(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但其基本化學結構仍然與天然產生氨基酸相同。＂氨基酸模擬物＂指化學結構與氨基酸的普通化學結構不同、但功能與天然產生氨基酸類似的化合物。
氨基酸可用公知的三字母符號或由IUPAC-IUB生化命名委員會推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸也可用其普遍接受的單字母代號表示。
本文所用術語＂芳基＂指含有5-12個環原子的多不飽和芳香烴取代基，它可以是單環或者稠合在一起或共價連接的多環(至多三環)。芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基和芐基。本發明也可采用其它芳基。
本文所用的＂生物樣品＂是含有核酸或多肽的生物組織或液體的樣品。這類樣品一般來自人，但包括分離自除人之外的哺乳動物或嚙齒動物，如小鼠和大鼠的組織。生物樣品也可包括組織切片，如活檢樣品和尸檢樣品、為組織學目的的冷凍切片、血液、血漿、血清、痰液、糞便、淚液、粘液、毛發、皮膚等。生物樣品也包括外植體以及來自患者組織的原代和/或轉化的細胞培養物。＂生物樣品＂也指來自動物的細胞或細胞群或一定量的組織或液體。生物樣品常常是從動物體內取出的，但術語＂生物樣品＂也可指在體內分析(即不用從動物體內取出)的細胞或組織。＂生物樣品＂一般含有動物細胞，但該術語也指可用于測量癌癥相關性多核苷酸或多肽水平的無細胞生物物質，如血液、唾液或尿液的無細胞組分。本發明可采用許多類型的生物樣品，包括但不限于組織活檢樣品、血樣、口腔刮出物、唾液樣品或乳頭溢液。本文所用的＂組織活檢＂指一定量的從動物，優選人取出用于診斷分析的組織。在癌癥患者中，可取出腫瘤中的組織，用于分析腫瘤內的細胞。＂腫瘤活檢＂可指任何類型的活檢，如穿刺活檢、細針穿刺活檢、手術活檢等。
＂提供生物樣品＂指獲得用于本發明所述方法的生物樣品。常常通過從患者中取出細胞樣品完成這一過程，但也可使用以前分離的細胞(如另一個人、在另一個時間和/或出于另一種目的分離)，或在體內進行本發明方法，來完成這一過程。有治療或結果歷史的存檔組織特別有用。
＂癌細胞＂、＂轉化＂細胞或在組織培養物中＂轉化＂指自發性或誘導性表型改變，不一定包括攝入了新的遺傳物質。雖然可通過轉化病毒的感染和摻入新的基因組DNA，或攝取外源性DNA進行轉化，但也可自發地或通過接觸致癌物而轉化，從而使內源性基因突變。轉化與表型改變有關，例如細胞永生化、異常生長控制、非形態改變和/或惡變(參見Freshney，Cultureof Animal Cell a Manual of Basic Technique(動物細胞培養基本技術手冊)(第3版，1994))。
術語＂細胞生長改變＂指體外或體內細胞生長和增殖的任何改變，如形成灶、貼壁非依賴性、半固體或軟瓊脂生長、接觸抑制改變和生長的密度限制、缺少生長因子或血清要求、細胞形態改變、獲得或失去永生化、獲得或失去腫瘤特異性標記、注入合適的動物宿主時形成或抑制腫瘤的能力和/或細胞永生化。參見例如，Freshney，Culture of Animal Cell a Manual ofBasic Technique(動物細胞培養基本技術手冊)第231-241頁(第3版，1994)。
＂使含量關聯＂指將一個樣品中測定的物質、分子或標記(如Gli或GLI)的含量與另一樣品中測定的相同物質、分子或標記的含量作比較。在另一樣品中測定的相同物質、分子或標記的量可能對給定癌癥特異。
本發明范圍內也包括術語＂測定量＂的同義詞，包括但不限于檢測、測定、測試或確定某分子如Gli或GLI的存在、不存在、量或濃度。
本文所用術語＂環烷基＂指含有3-15個碳和1-3個稠合或共價連接環的飽和環烴。本發明所用的環烷基包括但不限于環戊基、環己基、環庚基和環辛基。本發明所用的雙環烷基包括但不限于[3.3.0]雙環辛烷基、[2.2.2]雙環辛烷基、[4.3.0]雙環壬烷、[4.4.0]雙環癸烷(萘烷)、螺環[3.4]辛烷基、螺環[2.5]辛烷基等。
本文所用術語＂環烯基＂指含有3-15個碳和1-3個稠合或共價連接環的的不飽和環烴。本發明所用的環烯基包括但不限于環戊烯基、環己烯基、環庚烯基和環辛烯基。本發明也可采用雙環烯基。
＂測定功能作用＂指測定某化合物提高或降低受GLI蛋白間接或直接影響的參數的作用，如功能、酶、物理和化學作用。這類功能作用可通過本領域技術人員已知的任何方式測定，如光譜特征改變(如熒光、吸光度、折射率)、流體力學(如形狀)、色譜或該蛋白的溶解度特性，測定誘導標記或GLI蛋白的轉錄激活；測定結合活性如結合TAF蛋白(如TAFII31)的活性，測定細胞增殖、測定凋亡等。也可用本領域技術人員已知的實驗如體外實驗，如軟瓊脂上的細胞生長；貼壁依賴性；接觸抑制和生長的密度限制；細胞增殖；細胞轉化；生長因子或血清依賴性；腫瘤特異性標記水平；侵入基質膠；體內腫瘤生長和轉移；發生轉移的細胞中mRNA和蛋白質表達和癌細胞的其它特征，來測定化合物(如小分子化合物)對癌癥的功能作用。可通過本領域技術人員已知的許多方式評估功能作用，例如，用顯微鏡定量或定性測定形態特征的改變、測定Gli RNA或蛋白質水平的改變、測定RNA穩定性、鑒定下游或報道物基因表達(CAT、熒光素酶、β-gal、GFP等)，如通過化學發光、熒光、比色反應、抗體結合、誘導標記和配體結合實驗進行測定。＂功能作用＂包括體外、體內和離體活性。
本發明范圍包括術語＂測定＂的同義詞，包括但不限于檢測、測定、測試或確定某分子如GLI多肽、標簽、本發明小分子化合物的存在、不存在、量或濃度。該術語指定性或定量測定。
在Shh信號轉導、GLI信號轉導或Wnt2信號轉導中，術語＂下調＂或＂抑制＂指經Shh信號轉導、GLI信號轉導或Wnt2信號轉導的已知實驗測定，部分或完全阻斷Shh信號轉導、GLI信號轉導或Wnt2信號轉導。抑制劑是(例如)本發明小分子化合物。
用于治療的本發明小分子化合物的＂有效量＂、＂有效劑量＂、＂足量＂或其語法等同形式是足以緩解、或以某種方式減輕癥狀或者阻止或逆轉疾病進展的量。通過給予具體藥物組合物緩解特定疾病如癌癥的癥狀指，可能與給予該藥物組合物有關的永久性或暫時性、持續性或瞬時性減輕。可在體內和體外給予“有效量”。
“表達載體”或“表達構建物”是重組或合成產生的核酸構建物，其含有能夠在宿主細胞中轉錄特定核酸的一系列專用核酸元件。表達載體可以是質粒、病毒或核酸片段的一部分。表達載體一般包含待轉錄的操作性連接于啟動子的核酸。
術語＂GLI＂指GLI蛋白家族。GLI蛋白包括GLI(也稱為GLI1)、GLI2和GLI3。優選的GLI蛋白是GLI1、GLI2或GLI3。
術語＂Gli＂指GLI蛋白編碼基因。因此，Gli1，Gli2和Gli3分別是編碼GLI1、GLI2和GLI3蛋白的基因。
術語＂GLI蛋白活性＂指GLI信號轉導，包括例如，GLI轉錄激活下游基因、GLI蛋白與GLI DNA結合位點的結合以及GLI蛋白與其它蛋白如TAF或共同激活物如CBP(Creb蛋白結合蛋白)的結合。
術語＂GLI DNA結合位點＂指GLI蛋白能結合并且可由其激活基因轉錄的核苷酸序列。GLI DNA結合位點參見例如Vortkamp等(1995，DNA Cell.Biol.14629-34)Kinder和Vogelstein(1990，Mol.Cell.Biol.10634-42)和Yoon等(998，J Biol Chem 2733496-3501)。例如，GLI3鋅指結合的GLI DNA結合位點參見Vortkamp等(1995，DNA Cell.Biol.14629-34)由16個核苷酸組成，與GLI和tra-1蛋白結合的序列高度相似。此結合位點包含9-堿基對序列5′-GACCACCCA-3′。應理解，GLI3 DNA結合位點不需要與Vortkamp等(1995，DNA Cell.Biol.14629-34)鑒定的GLI DNA結合位點100％相同。例如，近年來，Hallikas等確定了GLI1、GLI2和GLI3的DNA結合特異性，也發現GLI結合于(例如)5′-TACCAACCCA-3′、5′-GCCCACCCA-3′、5′-GGCCACCCA-3′和5′-GATCACCCA-3′，其中下劃線核苷酸表示9 bp共有序列的差異(Hallikas等，2006，Cell 124(1)47-59；全文納入本文作參考)。本領域已知確定GLI蛋白與GLI DNA結合位點結合的實驗，包括例如，電泳遷移率變動分析(EMSA；Fried和Crothers，1981，Nucleic Acids Res.96505-6525；Hallikas等，2006，Cell 12447-59)、SELEX(Roulet等，2002Nat.Biotechnol.20831-835)和色譜結合實驗。
＂GLI＂多肽包括天然產生或重組的形式。因此，在一些實施方式中，本文所述的GLI多肽和GLI亞域多肽可包含對應人GLI序列的序列。因此，本文提供了示范性GLI，它是本領域已知的。例如，鑒定了幾種脊椎動物GLI1、GLI2和GLI3蛋白，例如人GLI1(GenBank登錄號NM_005269、P08151)、小鼠GLI1(GenBank登錄號NM_010296、AB025922、AAC09169、P47806)、斑馬魚GLI1(GenBank登錄號NM_178296)、人GLI2(GenBank登錄號NM_030381；NM_030380；NM-030379、DQ086814)、小鼠GLI2(GenBank登錄號XM_922107)、人GLI3(GenBank登錄號NM_000168、AJ250408、M57609、P10071、AAY87165)、黑猩猩GLI3(GenBank登錄號NM_001034190、AY665272、Q5IS56)、小鼠GLI3(GenBank登錄號X95255、NM_008130、NP_032156、Q61602)、大鼠GLI3(GenBank登錄號XM_225411)、斑馬魚GLI3(GenBank登錄號NM_205728、AY377429)。
GLI蛋白可以是全長GLI蛋白，或者可以是部分GLI蛋白，如GLI蛋白亞域。例如，＂GLI3＂多肽指人GLI3的多肽和多態性變體、等位基因、突變體(i)其氨基酸序列優選在至少約100、150、200、250、300、500或更多氨基酸的區域上與選自GenBank登錄號NM_000168、AJ250408、M57609、P10071和AAY87165的人GLI3的氨基酸序列的相同性大于約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，優選91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高，(ii)包含氨基酸基序FXXΦΦ(F＝苯丙氨酸；X＝任何殘基；Φ＝任何疏水性殘基)，優選氨基酸序列FDAII，(iii)包含轉錄激活域，(iv)結合GLI DNA結合位點和/或(v)結合TAF。
＂Gli核酸＂或＂gli多核苷酸＂指編碼GLI、GLI2或GLI3蛋白的脊椎動物基因。＂Gli核酸＂包括天然產生或重組的形式。Gli多核苷酸或GLI多肽編碼序列一般來自人，但可能來自其它哺乳動物，包括但不限于除人之外的靈長動物、嚙齒動物如大鼠、小鼠或倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或其它哺乳動物。已經克隆和鑒定了用于實施本發明的Gli核酸，例如人Gli1(GenBank登錄號NM_005269)、小鼠Gli1(GenBank登錄號NM_010296、AB025922)、斑馬魚Gli1(GenBank登錄號NM_178296)、人Gli2(GenBank登錄號NM_030381；NM_030380；NM-030379、DQ086814)、小鼠GH2(GenBank登錄號XM_922107)、人GH3(GenBank登錄號NM_000168、AJ250408、M57609)、黑猩猩Gli3(GenBank登錄號NM_001034190、AY665272)、小鼠Gli3(GenBank登錄號X95255、NM_008130)、大鼠Gli3(GenBank登錄號XM_225411)、斑馬魚Gli3(GenBank登錄號NM_205728、AY377429)。Gli多核苷酸可以是全長Gli多核苷酸，即編碼完整GLI蛋白的多核苷酸，或者可以是編碼GLI蛋白亞域的部分Gli多核苷酸。
術語＂GLI途徑＂、＂GLI信號轉導＂或＂GLI信號傳導途徑＂可互換使用，指hedgehog蛋白與其受體結合啟動、導致GLI蛋白表達和/或激活的信號傳導途徑。
本文所用術語＂鹵素＂指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)等元素。
術語＂hedgehog＂與術語＂Hh＂可互換使用，它是結合Hh受體而啟動Hh信號傳導途徑、導致GLI蛋白表達或激活的細胞因子。哺乳動物中有三種Hh家族基因，它們是超聲刺猬基因(Sonic hedgehog，Shh)、印度刺猬基因(India hedgehog，Ihh)和沙漠刺猬基因(Desert hedgehog，Dhh)。本領域已知幾種脊椎動物hedgehog蛋白，例如，人SHH、鼠SHH、大鼠SHH、人IHH和鼠DHH。
本文所用術語＂雜芳基＂指含有5-12個環原子的多不飽和芳香烴取代基，它可以是單環或稠合在一起或共價連接的多環(至多三環)，環中至少有一個雜原子，如N、O或S。雜芳基可通過雜原子連接于該分子的其余部分。雜芳基的非限制性例子包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。本發明所用的其它雜芳基包括吡啶基N-氧化物、四唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基，或者被取代、特別是單取代或雙取代的任何上述基團。
本文所用術語＂雜環烷基＂指含有3-15個環原子和1-3個稠合或共價連接環的飽和環烴，環中至少有一個雜原子，如N、O或S。此外，雜原子可占據雜環與該分子其余部分連接的位置。雜環烷基的例子包括1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
本文所用術語＂異構體＂指具有不對稱碳原子(光學中心)或雙鍵的本發明化合物。本發明范圍內包括外消旋物、非對映異構體、幾何異構體和單獨異構體。
＂標簽＂或＂可檢測部分＂是可用分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理手段檢測的組合物。例如，有用的標簽包括3H、125I、32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(如通常用于ELISA的酶)、生物素、異羥基洋地黃毒甙元或半抗原和蛋白質或可通過某種方式(如將放射性標記摻入小分子化合物)得以檢測的其它實體。該標簽可摻入小分子化合物的任何位置上。
生物樣品中所用的術語＂Gli mRNA水平＂或＂Wnt2 mRNA水平＂指細胞或生物樣品中存在的分別由Gli或Wnt基因轉錄的mRNA量。mRNA通常編碼功能性GLI或WNT蛋白，但可能存在改變或消除編碼蛋白功能的突變。＂Gli mRNA水平＂或＂Wnt2 mRNA水平＂不需要定量，但可簡便地通過人的主觀觀測得以檢測(與或不與對照樣品水平或對照樣品預計水平作比較)。
生物樣品中的＂GLI多肽水平＂或＂Wnt2多肽水平＂指細胞或生物樣品中存在的分別由Gli或Wnt2 mRNA翻譯的多肽的量。多肽可能具有或不具有GLI或WNT2蛋白活性。＂GLI多肽水平＂或＂WNT2多肽＂不需要定量，但可簡便地通過人的主觀觀測得以檢測(與或不與對照樣品水平或對照樣品預計水平作比較)。
本文所用的多肽(如GLI)水平或活性的“調節劑”包括該多肽的激活劑和/或抑制劑，用該術語描述能激活或抑制多肽表達水平或多肽活性的化合物。優選多肽是GLI1、GLI2或GLI3。激活劑是(例如)誘導或激活本發明多肽表達或結合、刺激、提高、打開、激活、幫助或增強活化、敏化或上調本發明多肽的活性的化合物。激活劑包括天然產生和合成的化合物、小化學分子等。激活劑試驗包括例如將候選化合物施用于表達GLI多肽的細胞，然后測定功能作用。將包含用潛在激活劑處理的GLI多肽的樣品或試驗與不用該激活劑處理的對照樣品作比較，以檢測作用程度。指定對照樣品(不用候選化合物處理)的相對活性為100％。當相對于對照的多肽活性值為110％，任選130％、150％，任選200％、300％、400％、500％或1000-3000％或者更高時，則實現多肽激活。抑制劑是(例如)使本發明多肽表達抑制或失活，或者結合、降低、關閉、失活、阻礙或降低表達、脫敏或下調本發明多肽活性的化合物。抑制劑包括干擾GLI蛋白表達的核酸如siRNA和反義RNA，以及天然產生和合成的化合物、小化學分子等。本文描述了抑制劑試驗。將包含用潛在抑制劑處理的GLI多肽的樣品或試驗與不用該抑制劑處理的對照樣品作比較，以檢測作用程度。指定對照樣品(不用候選化合物處理)的相對活性為100％。當相對于對照的多肽活性值降低10％，任選20％，任選30％，任選40％，任選50％、60％、70％、80％或90-100％時，則實現多肽抑制。
術語＂藥學上可接受的＂指給予對象，優選人對象時，在生理上能耐受或者一般不產生過敏或相似不良反應的組合物。優選地，本文所用術語＂藥學上可接受的＂指聯邦或州政府管理機構批準或者美國藥典或其它普遍接受的藥典列出的可用于動物、更具體是人。
術語＂多肽＂、＂肽＂和＂蛋白質＂在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術語應用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應天然產生氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產生的氨基酸聚合物、含有修飾殘基的氨基酸聚合物和非天然產生的氨基酸聚合物。
本文所用術語＂前藥＂指在生理條件下易于發生化學變化而提供本發明化合物的化合物。此外，前藥可以在離體環境中通過化學或生化方法轉化為本發明化合物。例如，放入含有合適的酶或化學試劑的透皮貼劑儲庫中時，前藥可緩慢轉變為本發明化合物。
＂啟動子＂的定義為介導核酸轉錄的核酸控制序列陣列。本文所用的啟動子包括轉錄起始位點附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型啟動子中的TATA元件。啟動子也任選包含遠端增強子或阻抑元件，它們與轉錄起始位點的距離可長達幾千個堿基對。
＂組成型＂啟動子是在大多數環境和發育條件下有活性的啟動子。＂誘導型＂啟動子是在環境或發育調控下有活性的啟動子。術語＂操作性連接＂指核酸表達控制序列(如啟動子、或轉錄因子結合位點陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列介導對應于第二序列的核酸轉錄。
術語＂重組＂用于修飾(如)細胞、核酸、蛋白質或載體時，表明該細胞、核酸、蛋白質或載體通過引入異源核酸或蛋白質或者改變天然核酸或蛋白質被修飾，或該細胞衍生自如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞能表達該細胞的天然(非重組)形式中未發現的基因，或表達在其它情況下異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。本文所用術語＂重組核酸＂指最初通過操縱核酸(例如使用聚合酶和核酸內切酶)在體外形成、通常未見于天然條件下的核酸。以此方式，實現不同序列的操作性連接。因此，線性形式的分離核酸，或通過連接通常不相連的DNA分子在體外形成的表達載體，都被認為是本發明目的的重組。應理解，制備重組核酸并將其引入宿主細胞或生物體后，它會以非重組形式復制，即利用宿主細胞的體內細胞機器、而非體外操作進行復制；然而，這類核酸一旦重組產生后，雖然隨后以非重組形式復制，但仍被認為是出于本發明目的的重組。相似地，＂重組蛋白＂是用重組技術產生的蛋白質，即通過如上所述重組核酸的表達產生的蛋白質。
本文所用的＂化療藥耐受性＂指對化療藥治療無反應，即通過這種治療無法殺死或抑制腫瘤生長。
本文所用術語＂鹽＂指根據本文所述化合物上的具體取代基，用相對無毒的酸或堿制備的活性化合物的鹽。當本發明化合物含有相對酸性的官能團時，可通過將這類化合物的中性形式與足量所需堿(純堿或該堿在合適的惰性溶劑中的溶液)相接觸而獲得堿加成鹽。藥學上可接受的堿加成鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機氨基鹽或鎂鹽，或相似的鹽。本發明化合物含有相對堿性的官能團時，可通過將這類化合物的中性形式與足量所需酸(純酸或該酸在合適的惰性溶劑中的溶液)相接觸而獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的例子包括由無機酸衍生的鹽以及由相對無毒的有機酸衍生的鹽，所述無機酸衍生的鹽包括例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、氫碘酸鹽或亞磷酸鹽等，所述有機酸衍生的鹽包括例如，乙酸鹽、丙酸鹽、異丁酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、富馬酸鹽、苦杏仁酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯基磺酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽等。也包括氨基酸如精氨酸等和有機酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見例如，Berge，S.M.等，＂PharmaceuticalSalts＂(藥物鹽)，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。某些特定的本發明化合物同時含有堿性和酸性官能團，因而該化合物能轉化成堿或酸加成鹽。
可通過將該鹽與堿或酸接觸并以常規方式分離母體化合物，再次產生該化合物的中性形式。該化合物的母體形式與各種鹽形式在某些物理特性上(例如在極性溶劑中的溶解度)不同，但出于本發明目的這些鹽相當于該化合物的母體形式。
本文所用術語＂溶劑合物＂指與溶劑復合的本發明化合物。可與本發明化合物形成溶劑合物的溶劑包括普通有機溶劑如醇(甲醇、乙醇等)、醚、丙酮、乙酸乙酯、鹵代溶劑(二氯甲烷、氯仿等)、己烷和戊烷。其它溶劑包括水。水作為復合溶劑時，該復合物稱為＂水合物＂。
術語＂對象＂或＂患者＂指需要治療病癥(如癌癥)、失調或疾病的哺乳動物，優選人。
術語＂TAF＂指TBP相關因子。TAF優選為TAFII，即參與介導RNA聚合酶II轉錄的真核基因的轉錄激活的TAF蛋白。TAF蛋白能與其它轉錄激活物或阻抑物相互作用(Goodrich和Tjian，Curr Opin Cell Biol 6(3)4O3-9(1994)；Albright和Tjian，Gene 242(1-2)1-13(2000))。TAF優選來自人、小鼠、果蠅或酵母。與GLI相互作用的TAF蛋白優選為TAFII31蛋白。Klemm等克隆了人TFIID亞基，將其稱為hTAFII32(Klemm等，1995，Proc Natl AcadSci USA，92(13)5788-92)。這種32-kD蛋白分離自HeLa細胞核提取物并經過部分測序。鑒定的cDNA具有推定的264個殘基的氨基酸序列，并且與果蠅TAFII40有關。Klemm等已證明，TAFII32能與GTF2B和病毒轉錄反式激活物VP16相互作用(Klemm等1995，Proc Natl Acad Sci USA，92(13)5788-92)。作者證明，重組表達的TAFII32在部分重組的TFIID復合物中有功能，重組復合物通過GAL4-VP16融合蛋白介導激活作用。TAFII32和TAFII31是同一種蛋白質的兩個名稱，現在也稱為TAF9。Lu等克隆了TAF9，他們將其稱為TAFII31。TAF9能編碼264個氨基酸的蛋白質。免疫沉淀和結合分析證明TAF9與p53的N末端結構域相互作用的位點與MDM2的結合位點相同，MDM2是細胞中主要的p53活性負調節物。(Lu等，1995，Proc Natl Acad Sci USA，92(11)5154-8)。人TAFII31核苷酸和蛋白序列可參見(例如)GenBank登錄號U25112、U21858和NM_016283。
本文所用術語“治療”包括(1)預防疾病(如癌癥)，即使傾向于發生該疾病但尚未出現該疾病的任何癥狀的對象不發生該疾病的臨床癥狀；(2)抑制該疾病，即阻滯或減少該疾病或其臨床癥狀的發生；或(3)緩解該疾病，即使該疾病或其臨床癥狀消退。治療指病癥、失調或疾病的癥狀或病理得到改善或有益改變的任何方式。優選地，需要這種治療的對象是哺乳動物，更優選人。
＂腫瘤細胞＂指腫瘤中的癌前細胞、癌細胞和正常細胞。
術語＂Wnt＂指一類哺乳動物基因家族，其編碼與果蠅體節極性基因wingless有關的蛋白質。在人中，Wnt基因家族一般編碼38-43 kDa富含半胱氨酸的糖蛋白，其含有疏水性信號序列和保守的天冬酰胺-連接的寡糖共有序列(Shimizu等，Cell Growth Differ 8(12)1349-58(1997))。Wnt家族包括至少19個哺乳動物成員。示范性Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15和Wnt16。本發明優選的Wnt蛋白是Wnt2，優選人Wnt2蛋白。
II.小分子化合物 A.GLI3靶序列的選擇 轉錄激活域的序列同源性很小，在沒有結合靶蛋白時通常缺乏折疊結構。相信本文所述的GLI、GLI2和GLI3能通過轉錄激活域內的α-螺旋區與TBP相關因子TAFII31相接觸(參見圖3)。本發明一方面認識到，雖然在許多物種中單獨的GLI、GLI2和GLI3轉錄激活域非常保守，但它們本身的差異很大。例如，人GLI1，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI1，氨基酸殘基1037-1054)和小鼠GLI1，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(小鼠GLI1，氨基酸殘基1040-1057)的反式激活域相同。另外，人GLI2，NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(氨基酸殘基1501-1518)和小鼠GLI2，NH2-DSQLLEPPQIDFDAIMDD-COOH(小鼠GLI2，氨基酸殘基1509-1526)的反式激活域的差別只有一個氨基酸殘基位置(斜體和下劃線)。人GLI3，NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512)和小鼠GLI3，NH2-ESHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(氨基酸殘基1497-1514)的反式激活域的差別也只有一個氨基酸殘基位置(斜體和下劃線)。
然而，人GLI1、人GLI2和人GLI3之間有很大差異(星號表示人GLI1、GLI2和GLI3之間相同的氨基酸殘基) NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI1，氨基酸殘基1037-1054)，＊＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ ＊ NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(人GLI2，氨基酸殘基1501-1518)， ＊＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ ＊ NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512)， 以下是對人GLI1和人GLI2的TAFII31作用結構域的比較(星號代表相同的氨基酸殘基) NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI1，氨基酸殘基1037-1054) ＊＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ ＊ NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(人GLI2，氨基酸殘基1501-1518) 以下是對人GLI2和人GLI3的TAFII31作用結構域的比較(星號代表相同的氨基酸殘基) NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(人GLI2，氨基酸殘基1501-1518) ＊＊ ＊＊ ＊＊＊＊＊＊＊ ＊＊ NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512) 如上所述，已經鑒定了GLI2和GLI3在哺乳動物骨骼發育過程中特定和冗余的功能，然而，例如，GLI1而非GLI3能激活組織培養物中的HNF-3β增強子(Mo等，1997，Development 124113-123；Sasaki等，1997，Development1241313-1322)。TAF結合或結合親和力的差異可能導致GLI1，GLI2和GLI3的不同特性。
Yoon等描述，GLI1轉錄激活域類似于VP16d轉錄激活域，包括含有保守FXXΦΦ基序的α螺旋區。(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.，273(6)3496-3501)。結合于靶蛋白TAFII31后，VP16激活域經誘導由隨機卷轉變為α-螺旋，已鑒定到三個殘基與TAFII31直接接觸D472、F479和L483(Uesugi等，1997，Science，2771310-1313)。也在包含FXXΦΦ(FVAIL)的人GLI1的激活域中發現了這三個氨基酸殘基(D1040、F1048和L1052)。
GLI3中的FXXΦΦ基序是FDAII。這一GLI3基序非常可能直接參與接觸TAF，可能是TAFII31。
也在腫瘤抑制基因p53的激活域和NF-κB p65中發現了FXXΦΦ基序。p53的細胞弱化子MDM2能將p53的FXXΦΦ基序與NF-κB p65和VP16區別開來，并且特異性抑制p53活性(Uesugi和Verdine，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(26)14801-14806)。因此，合理地假定含有FXXΦΦ基序的多肽I的激活域可與也含有FXXΦΦ基序但具有不同氨基酸序列的多肽II的激活域區別開來。因此，也可能通過設計和使用模擬多肽I的FXXΦΦ基序，即多肽I的FXXΦΦ基序的氨基酸序列的小分子化合物，來顯著抑制多肽I(如GLI3)的活性，但不顯著抑制多肽II的活性。
因此，本發明目的是提供能顯著抑制GLI3信號轉導，但不顯著抑制GLI或GLI2信號轉導的小分子化合物。因此，本發明一方面提供了能區別影響GLI1、GLI2和GLI3的轉錄激活潛能的小分子化合物。
在本發明的一個實施方式中，小分子化合物抑制或減少了GLI3與TAF，優選TAFII31的結合。
在本發明另一實施方式中，提供了模擬GLI蛋白(優選人或小鼠GLI蛋白)FXXΦΦ基序的小分子化合物。在優選實施方式中，該小分子化合物模擬了GLI3的FXXΦΦ基序FDAII(見圖3)。
在本發明其它實施方式中，該小分子化合物模擬了GLI2的FXXΦΦ基序FDAIM。在本發明的另一實施方式中，該小分子化合物模擬了GLI1的FXXΦΦ基序FVAIL。
B.本發明小分子化合物 如上所述，本發明目的之一是提供模擬GLI多肽，優選GLI3多肽的轉錄激活域的小分子化合物。現有技術領域描述了含有三芳基/烷基雜環化合物的許多α-螺旋模擬物。然而，沒有充分研究基于吡唑啉的模擬α-螺旋區的化合物。因此，本發明目的之一是提供基于吡唑啉并且模擬GLI轉錄激活域的α-螺旋區，優選GLI3轉錄激活域的α-螺旋區的小分子化合物。圖3顯示了本發明小分子化合物(FN1-5；見下)的RMS重疊，其中包括含有GLI3 FDAII基序的擬定α螺旋區。
因此，本發明化合物包含具有下式的小分子化合物
式中X1和X2各自獨立地是N或C，式中X1和X2之一是N，X1和X2之一是C，因此環N與X1或X2的C形成雙鍵。此外，R1、R2和R3各自獨立地選自用0-3個R6基團任選取代的C1-C6烷基、芳基、雜芳基、環烷基和雜環烷基，所述R6基團各自獨立地選自氫、鹵素、C1-C6烷基、-OR7、-C(O)R7、-OC(O)R7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、-N(R7)C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標m是0、1或2。Y是直接鍵或C1-C4烷基，Z選自C1-C4烷基、芳基和雜芳基。R4是氫、鹵素、-OR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標m是0、1或2。R5是氫、C1-C6烷基，或任選與Y聯合形成5-6元雜環。R7各自獨立地是H或C1-C6烷基。
此外，也考慮了本發明小分子化合物的鹽、水合物、溶劑合物、異構體和前藥。
在另一實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是芳基。在另一實施方式中，R1、R2和R3各自是苯基。
在另一實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中R4是羥基。在另一實施方式中，Z是C1-C4烷基。在又一實施方式中，Z是芳基。在又一實施方式中，Z是苯基。
在另一實施方式中，本發明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是苯基，Y是C1-C4烷基，Z是C1-C4烷基或苯基，R4是羥基。
因此，本發明小分子化合物優選包括但不限于
其它本發明化合物包括以下小分子化合物
本領域技術人員應理解，其它小分子化合物也可用于本發明。
C.小分子化合物的制備 可通過以下方法制備本發明小分子化合物使肉桂酸乙酯和苯甲醛苯腙縮合，然后通過乙酯皂化并與胺反應形成所需的酰胺最終產物(參見實施例3)。或者，先使肉桂酸與胺反應制備酰胺，然后與苯甲醛苯腙縮合，以制備本發明小分子化合物。本領域技術人員認識到，存在制備本發明小分子化合物的其它方法。
在本發明的一個實施方式中，本發明小分子化合物包含標簽。這對于檢測和測試體內給藥后小分子化合物的分布特別有用。例如，3H可用作常規藥動學/藥效學研究的標簽。可通過光譜、光化學、生化、免疫化學、化學或其它物理方法檢測含有標簽的小分子化合物。
本發明小分子化合物也可在構成該化合物的一個或多個原子上含有非天然同位素部分。例如，可用放射性同位素，如氚(3H)或碳-14(14C)標記該化合物。本發明范圍應包括本發明化合物的所有同位素變體(無論是否有放射性)。
D.用細胞試驗檢測小分子化合物 可在體外和體內篩選本發明小分子化合物的活性。在體外試驗中，本發明提供了基于細胞的細胞毒試驗和凋亡試驗，如本文所述(參見例如實施例1)。在體內試驗中，本發明提供了小鼠異種移植瘤試驗，如本文所述(參見例如實施例33-35)。
III.藥物組合物 本發明一方面提供了含有至少一種本發明小分子化合物和任選的藥學上可接受的運載體的藥物組合物或藥物。可給予患者藥物組合物或藥物以治療(例如)諸如癌癥等病癥。
A.制劑和給藥 本發明小分子化合物可用于制備含有有效量本發明小分子化合物、聯合或混合適合腸道或胃腸道外施用的賦形劑或運載體的藥物組合物或藥物。
可通過標準技術采用一種或多種生理上可接受的運載體或賦形劑配制本發明所用的藥物組合物或藥物。本文描述了合適的藥物運載體，參見E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(雷明頓藥物科學)。可配制本發明小分子化合物及其生理上接受的鹽和溶劑合物，以便通過任何合適的途徑給藥，這些途徑包括吸入、外用、經鼻、口服、胃腸道外或直腸途徑。因此，可用注射器或其它設備通過皮內、皮下、靜脈內、肌肉內、鼻內、腦內、氣管內、動脈內、腹膜內、膀胱內、胸膜內、冠狀動脈內或腫瘤內注射給予該藥物組合物。也考慮了透皮給藥，以及吸入或氣霧劑給藥。可通過口服、直腸或陰道途徑給予片劑和膠囊。
在口服給藥中，藥物組合物或藥物可通過常規手段采取(例如)藥學上可接受的賦形劑制備的片劑或膠囊形式給藥。優選含有活性成分即本發明小分子化合物，以及以下物質的片劑和明膠膠囊，這些物質包括例如(a)稀釋劑或填料，如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纖維素(如乙基纖維素、微晶纖維素)、甘氨酸、果膠、聚丙烯酸酯和/或磷酸氫鈣、硫酸鈣；(b)潤滑劑，如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、硬脂酸金屬鹽、膠體二氧化硅、氫化植物油、玉米淀粉、苯甲酸鈉、乙酸鈉和/或聚乙二醇；對片劑而言還含有(c)粘合劑，如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或羥丙基甲基纖維素；如果需要還可加入(d)崩解劑，如淀粉(如馬鈴薯淀粉或淀粉鈉)、乙醇酸、瓊脂、藻酸或其鈉鹽、或泡騰混合物；(e)濕潤劑，如十二烷基硫酸鈉和/或(f)吸附劑、著色劑、調味劑和甜味劑。
片劑可以是按照本領域已知方法進行薄膜或腸溶衣包衣的。口服給藥的液體制劑可采取以下形式，例如，溶液劑、糖漿劑或混懸劑，或者它們可以是干燥產品，臨用前用水或其它合適的載體重建。可通過常規方法用藥學上可接受的添加劑制備這類液體制劑，所述添加劑包括例如助懸劑，如山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪；乳化劑，如卵磷脂或阿拉伯膠；非水性載體，如杏仁油、油脂、乙醇或分餾的植物油；和防腐劑，如對羥基苯甲酸或山梨酸的甲酯或丙酯。所述制劑也可適當地含有緩沖劑、調味劑、著色劑和/或甜味劑。如果需要，可適當配制口服給藥制劑，以便控制釋放該活性化合物。
就吸入給藥而言，可通過加壓包裝或噴霧器以氣溶膠噴霧的形式方便地遞送化合物，其中應用了合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供遞送可計量數量的閥門來確定劑量單位。可配制含有該化合物的粉末混合物和合適的粉末基料(如乳糖或淀粉)的用于吸入器或吹藥器的明膠膠囊和藥筒。
可配制用于胃腸外注射給藥，如推注或連續輸注的本發明小分子化合物。可以用添加防腐劑的單位劑型(如)安瓿或多劑量容器盛放注射制劑。可注射組合物優選為水性等滲溶液劑或混懸劑，栓劑優選由脂肪乳劑或混懸劑制備。該組合物可以是無菌組合物和/或含有輔助試劑，如防腐劑、穩定劑、濕潤劑或乳化劑、促溶劑、調節滲透壓和/或緩沖液的鹽。或者，活性成分可以是臨用前用合適的載體，如無菌無熱原水重建的粉末形式。此外，它們還可含有其它有治療價值的物質。按照常規的混合、造粒或包衣方法制備該組合物，其含有約0.1-75％，優選約1-50％的活性成分。
適用于透皮給藥的制劑包含有效量的本發明化合物和運載體。優選的運載體包括可吸收的藥學上可接受的溶劑，以幫助其穿過宿主皮膚。例如，透皮裝置是繃帶形式，其包括襯墊部件，含有化合物和任選運載體的儲庫；任選的速率控制屏障，以便在一段較長時間內以可控和預定的速率將該化合物給予宿主皮膚；和將該裝置固定在皮膚上的機構。也可采用基質透皮制劑。
局部應用，如用于皮膚和眼睛的合適制劑優選本領域熟知的水性溶液劑、軟膏、乳膏或凝膠。這類制劑可含有增溶劑、穩定劑、張度增強劑、緩沖劑和防腐劑。
該化合物也可配制到例如含有常規栓劑基料如可可油或其它甘油酯的栓劑或保留灌腸劑直腸組合物，如栓劑或保留灌腸劑中。
而且，可將該化合物配制成長效制劑。可通過植入(如皮下或肌肉內)或肌肉內注射給予這類長效制劑。因此，例如，可用合適的聚合材料或疏水性材料或離子交換樹脂配制該化合物(例如，用可接受的油配制成乳劑)，或配制成微溶性衍生物，例如，微溶鹽。
如果需要，可以在包裝或配藥裝置中提供該組合物，所述裝置可含有一個或多個含有活性成分的單位劑量形式。該包裝可以(例如)包含金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。該包裝或配藥裝置可附有給藥說明。
在本發明的一個實施方式中，藥物組合物或藥物含有有效量的如上所述本發明化合物和另一種治療劑，如化療藥。化療藥的例子包括但不限于柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環磷酰胺、胞嘧啶阿糖胞苷、雙氯乙基亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、氯潑尼松、羥基孕酮、睪酮、他莫昔芬、達卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧柯福霉素、4-羥基過氧環磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、長春新堿、長春堿、依托泊甙、三甲曲沙、替尼泊苷、順鉑和二乙基乙烯雌酚(DES)。通常參見，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(默克診斷治療手冊)，第15版，1987，第1206-1228頁，Berkow等編，新澤西州羅韋(Rahway，N.J.)。
與本發明小分子化合物一起使用時，這類化療藥可單獨使用(如5-FU和小分子化合物)、連續給藥(如給予5-FU和小分子化合物一段時間后，給予(如)MTX和小分子化合物)，或者與一種或多種這類化療藥(如5-FU、MTX和小分子化合物，或者5-FU、放療和小分子化合物)聯用。可通過相同或不同的給藥途徑給藥，或者在同一藥物制劑中一起給藥。
在本發明的一個方面，與手術和任選給予的另一化療藥聯合給予治療有效量的本發明小分子化合物。
B.治療有效量和給藥 在本發明的一個實施方式中，將治療有效劑量的藥物組合物或藥物給予患者，以預防、治療或控制癌癥。將足量的藥物組合物或藥物給予患者，以在患者中產生有效的治療效果。有效治療效果是，至少部分阻滯或減慢該疾病的癥狀或并發癥的效果。能夠達到這一目的的量被定義為＂治療有效劑量＂。
所給的活性小分子化合物的劑量取決于溫血動物(哺乳動物)的種類、體重、年齡、個體狀況、待治療區域的表面積和給藥形式。劑量大小也取決于向具體對象給予具體小分子化合物時伴隨的副作用的存在、特性和程度。約50-70千克的哺乳動物的口服給藥單位劑量可含有約5-500毫克活性成分。一般地，本發明活性小分子化合物的劑量是足以實現所需效果的劑量。
可由對象體內小分子化合物累積測定值計算最優給藥方案。通常，劑量為1納克-1,000毫克/千克體重，可每天、每周、每月或每年給予一次或多次。本領域普通技術人員不難確定最優劑量、給藥方法和給藥頻率。
在本發明的一個實施方式中，在數天中，每天給予含有本發明小分子化合物的藥物組合物或藥物的劑量范圍為約1毫克小分子化合物/千克對象體重(1毫克/千克)至約1克/千克。在另一實施方式中，每日劑量的范圍為約5mg/kg-500mg/kg。在又一實施方式中，每日劑量為約10mg/kg-250mg/kg。在另一實施方式中，每日劑量為約25mg/kg-150mg/kg。每日劑量可每天給藥一次，或分成亞劑量每天給藥多次，如每天給藥兩次、三次或四次。
為了實現所需療效，小分子化合物必須以治療有效的日劑量給予多天。因此，治療有效地給予小分子化合物以治療對象的癌癥需要定期(如每天)給藥持續一段時間，這段時間為三天至兩周或更長時間。一般地，可以連續給予小分子化合物至少三天，常常是連續至少5天，更經常是連續至少10天，有時連續給藥20、30、40或更多天。雖然每日連續給藥是實現治療有效劑量的優選途徑，但即使不是每天給予該小分子化合物也可實現治療有益的效果，只要重復給藥的頻率足以在對象中維持治療有效濃度的小分子化合物。例如，可以每隔一天、每三天給予該小分子化合物，或者如果采用較高劑量范圍并且對象能耐受，則可每周給藥一次。給藥方案參見(例如)實施例33-35和圖15-17。
這類小分子化合物的最優劑量、毒性和療效可取決于單個小分子化合物的相對效力，可通過細胞培養或實驗動物所用的標準藥學方法測定，例如，測定LD50(對50％群體致死的劑量)和ED50(對50％群體治療有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數，可表示為LD50/ED50之比。優選治療指數大的化合物。雖然可采用具有毒副作用的化合物，但應該小心設計將這類化合物靶向患病組織部位以最大程度降低對正常細胞的損傷、從而降低副作用的遞送系統。
獲自(例如)細胞培養試驗和動物研究的數據可用于確定人用劑量范圍。這類小分子化合物的劑量優選在包含ED50的毒性很小或無毒性的循環濃度范圍內。根據所用劑型和給藥途徑，該劑量可在此范圍內變動。對本發明方法所用的任何小分子化合物而言，最初可由細胞培養試驗估計治療有效劑量。可在動物模型中確定劑量，以使循環血漿濃度范圍包含細胞培養中測定的IC50(對癥狀實現半數最大抑制的受試化合物濃度)。可利用這類信息更準確地確定人用劑量。可通過高效液相色譜(HPLC)確定血漿中的濃度。通常，對典型對象而言，小分子化合物的劑量當量約為1ng/kg-100mg/kg。
成功治療后，可能需要對該對象進行維持治療，以防止所治療疾病(如癌癥)的復發。
IV.鑒定表達GLI蛋白的細胞 A.檢測GLI蛋白 在另一實施方式中，檢測癌癥的方法包括測定來自對象(如患者)的生物樣品中GLI多肽，優選GLI1，GLI2或GLI3多肽的水平。在優選實施方式中，確定含有轉錄激活域的GLI3蛋白的激活片段水平。檢測到GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽水平增加或GLI3蛋白激活片段水平增加(相對于正常水平)說明該對象患有癌癥。
例如，GLI1、GLI2或GLI3表達上調表明癌癥，或者可能與各種癌癥相關聯。因此，GLI1、GLI2或GLI3多肽或者Gli1、Gli2或Gli3多核苷酸可用作診斷癌癥的生物標記物。在本發明的一個優選實施方式中，測定生物樣品中GLI蛋白如GLI3的含量。一般地，例如，由正常、健康或非癌對象提供的生物樣品中GLI3含量與癌癥患者或懷疑患有癌癥的對象提供生物樣品中的GLI3含量相關聯。癌癥患者或懷疑患有癌癥的對象提供的生物樣品中檢測到的GLI3含量可能是給定癌癥特異性的。
例如，可通過任何具體檢測方法檢測GLI多肽如GLI3多肽，這些方法包括但不限于親和力捕獲、質譜、GLI3的傳統免疫試驗、PAGE、Western印跡或HPLC，如本文的進一步描述或本領域技術人員所知。
可用于此目的的檢測范例包括光學方法、電化學方法(測定電壓和測定電流的技術)、原子力顯微術和射頻方法如多級共振光譜。除共聚焦和非共聚焦顯微術外，光學方法的例子是檢測熒光、發光、化學發光、光吸收、反射、透光度和雙折射或折射率(如表面等離振子共振、橢圓光度法、共振鏡法、光柵耦合器波導法或干涉量度法)。
B.檢測Gli mRNA 在一個實施方式中，檢測癌癥的方法包括確定對象(如患者)生物樣品中編碼GLI多肽，優選GLI3多肽的轉錄物的水平(參見例如Genbank登錄號NM 007191和SEQ ID NO1)。檢測到Gli mRNA，優選GLI3 mRNA水平相對于正常水平升高表明該對象患有癌癥。在一個實施方式中，確定GlimRNA水平的步驟包括擴增反應。在另一實施方式中，通過測定細胞中編碼GLI多肽的mRNA表達水平評估是否存在癌癥。Gli mRNA水平高于相應非癌組織表明存在癌癥。評估具體基因的RNA表達水平的方法是本領域技術人員眾所周知的，包括雜交和擴增試驗等。
1.直接雜交試驗 用核酸雜交技術檢測和/或定量測定Gli基因轉錄物(mRNA或由其制備的cDNA)水平的方法是本領域技術人員眾所周知的。例如，評估Gli多核苷酸如Gli3多核苷酸存在、不存在或含量的一種方法包括Northern印跡。也可通過本領域已知技術分析基因表達水平，例如打點印跡、原位雜交、RNA酶保護、檢測DNA微芯片試驗等。
2.擴增試驗 在另一實施方式中，用擴增試驗測定Gli基因，優選Gli3基因的表達水平。在這類試驗中，Gli核酸序列用作擴增反應(如聚合酶鏈反應或PCR)的模板。在定量擴增中，擴增產物的量與原始樣品中模板量成正比。與合適對照進行比較能衡量樣品中的Gli mRNA水平。定量擴增的方法是本領域技術人員熟知的。定量PCR的詳細方案參見(如)Innis等(1990)PCRProtocols，A Guide to Methods and Applications(PCR方案方法和應用指南)，紐約學術出版社公司(Academic Press，Inc.N.Y.))。已知的Gli核酸序列(參見例如，本文中的ATCC登錄號)足以使本領域技術人員選擇引物來擴增該基因的任何部分。半定量RT-PCR分析參見(例如)實施例1和圖2。
在一個實施方式中，采用基于TaqMan的試驗定量測定癌癥相關性多核苷酸。基于TaqMan的試驗采用發熒光的寡核苷酸探針，其含有5′熒光染料和3′淬滅劑。該探針與PCR產物雜交，但本身無法延伸，因為其3′末端有封端劑。在后續循環中擴增PCR產物時，聚合酶如AmpliTaq的5′核酸酶活性導致切割TaqMan探針。這種切割分離了5′熒光染料和3′淬滅劑，從而隨著擴增的進行提高了熒光水平(參見例如，帕金埃爾默公司(Perkin-Elmer)提供的文獻，如www2.perkin-elmer.com)。
其它合適擴增方法包括但不限于連接酶鏈反應(LCR)(參見Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)；Landegren等，Science 2411077(1988)；和Barringer等，Gene 89117(1990))、轉錄擴增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))、自身維持序列復制(Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 871874(1990))、打點PCR和接頭銜接子PCR等。
V.方法 本發明小分子化合物可以各種方式應用。本發明提供了使用本發明小分子化合物進行以下操作的方法，例如，(i)誘導表達GLI多肽的細胞凋亡，(ii)抑制表達GLI多肽的細胞的不良生長、過度增殖或存活，(iii)治療表達GLI多肽的病癥如癌癥，(iv)抑制具有GLI DNA結合位點的基因表達和(v)抑制GLI多肽的活性。
任何表達GLI多肽，優選GLI3多肽的細胞或腫瘤細胞可用于實施本發明方法。表達GLI多肽的細胞或腫瘤細胞優選選自結腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質瘤細胞。
本發明方法可以在體外或體內實施。
A.用小分子化合物誘導細胞凋亡 凋亡在多細胞生物體的發育和穩態中起到核心作用。＂凋亡＂指程序性細胞死亡，其特征是某些細胞特征，如膜起泡、染色質皺縮和片段化、形成凋亡小體和陽性＂TUNEL＂(末端脫氧核苷酸轉移酶-介導的UTP缺口末端標記)染色圖案。凋亡過程中的后一步驟是質膜降解，使凋亡細胞泄漏各種染料(如碘化丙錠)。
凋亡可能由集中于最終效應物機制的多個獨立信號傳導途徑誘導，這些機制由幾種死亡受體與其配體(屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體/配體超家族)之間的多種相互作用組成。最佳表征的死亡受體是CD95(＂Fas＂)、TNFR1(p55)、死亡受體3(DR3或Apo3/TRAMO)、DR4和DR5(apo2-TRAIL-R2)。凋亡的最終效應物機制是激活了稱為胱冬酶的一系列蛋白酶。這些胱冬酶的激活導致一系列有活力的細胞蛋白的裂解和細胞死亡。
本發明提供了誘導表達GLI蛋白的細胞凋亡的方法。在一個方面，誘導細胞凋亡的方法包括使細胞暴露于組合物或使細胞接觸含有本發明小分子化合物的組合物的步驟。在優選實施方式中，該組合物包含小分子化合物FN1-5。在另一優選實施方式中，該組合物包含小分子化合物FN1-8。一般地，使細胞暴露于或接觸有效量的組合物，這種接觸能誘導凋亡。在優選實施方式中，GLI蛋白是GLI2或GLI3。
在本發明另一優選實施方式中，使細胞暴露于含有本發明小分子的組合物包括將該組合物引入細胞。
在本發明的另一方面，提供了誘導腫瘤細胞凋亡的方法，其包括給予本發明小分子化合物的步驟。在優選實施方式中，所述小分子化合物是FN1-5。在另一優選實施方式中，所述小分子化合物是FN1-8。
在優選實施方式中，使細胞離體暴露于或離體接觸該組合物。在另一優選實施方式中，使細胞在體內暴露于或在體內接觸該組合物。
B.用小分子化合物抑制細胞的不希望的生長、增殖或存活 本發明的目的之一是提供治療癌癥的新型治療方案，該方案包括施用防止通過GLI信號傳導途徑進行信號轉導的本發明小分子化合物。本發明一方面提供了抑制細胞的不良生長、過度增殖或存活中至少一種行為的方法。這種方法包括確定該細胞是否表達Gli基因或者GLI多肽的步驟。此方法也包括使細胞接觸有效量的本發明小分子的步驟，其中所述接觸步驟導致抑制了細胞的不良生長、過度增殖或存活中至少一種行為。
抑制其不良生長、過度增殖或存活中至少一種行為的細胞或腫瘤細胞優選選自結腸癌細胞、黑色素瘤細胞、間皮瘤細胞、肺癌細胞、腎細胞癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肉瘤細胞、卵巢癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、肝細胞癌細胞、鼻咽癌細胞、胰腺癌細胞和膠質瘤細胞。
在本發明另一優選實施方式中，提供了一種抑制表達GLI多肽，優選GLI3的細胞增殖的方法。＂增殖＂指細胞生長、細胞或病理囊腫的繁殖或增多。該方法包括使細胞接觸有效量的小分子化合物的步驟，所述有效量能抑制細胞增殖。優選地，單用或聯用小分子化合物FN1-5或FN1-8能抑制細胞，優選癌細胞的增殖。
在本發明的優選實施方式中，在體外實施此方法。如本文進一步所述，也可在體內實施本發明方法。
許多腫瘤都會轉移。因此，在本發明的另一方面，采用本發明小分子化合物預防轉移灶的形成。此方法包括給予腫瘤細胞本發明小分子化合物的步驟，這種給藥能防止轉移。在優選實施方式中，該小分子化合物是FN1-5。在另一優選實施方式中，該小分子化合物是FN1-8。
在本發明的優選實施方式中，表達GLI蛋白并接觸本發明小分子化合物的細胞是選自下組的癌細胞結腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質瘤細胞。優選癌細胞是肺癌細胞、結腸癌細胞或黑色素瘤細胞。
C.用小分子化合物治療癌癥 可以在體外和體內實施本發明方法。因此，在本發明的另一方面，提供了治療患有癌癥的對象的方法。此方法包括給予該對象治療有效量的小分子化合物的步驟，其中所述癌癥的特征是表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽，其中給藥步驟導致治療了該對象。
如本文所示，大部分癌癥表達GLI多肽，優選GLI3多肽(圖2；數據未顯示)。因此，可用本發明小分子化合物治療大部分對象癌癥。癌癥優選選自結腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質瘤。
因此，在本發明的優選實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的結腸癌的對象。
在本發明另一優選實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的乳腺癌的對象。
在本發明的又一優選實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的鼻咽癌的對象。
在本發明的一個實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的肺癌的對象。肺癌包括但不限于支氣管癌[鱗狀細胞癌、未分化的小細胞癌、未分化的大細胞癌、腺癌]、肺胞癌[細支氣管癌]、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨瘤性錯構瘤、間皮瘤、SCLC和NSCLC。
在本發明另一實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的肉瘤的對象。肉瘤包括但不限于諸如血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤和畸胎瘤等癌癥。
在本發明的另一實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的胃腸道癌癥的對象。胃腸道癌癥包括但不限于食道癌[鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤]、胃癌[上皮癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤]、胰腺癌[膽管腺癌、胰島素瘤、高血糖素瘤、胃泌素瘤、類癌瘤、舒血管腸肽瘤]、小腸癌[腺癌、淋巴瘤、類癌瘤、卡波濟氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤]和大腸癌[腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤]。
在本發明的一個實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的泌尿生殖道癌癥的對象。泌尿生殖道癌癥包括但不限于腎癌[腺癌、腎母細胞瘤(腎胚細胞瘤)、淋巴瘤、白血病、腎細胞癌]、膀胱癌和尿道癌[鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌]、前列腺癌[腺癌、肉瘤]和睪丸癌[精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、萊迪希細胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、類腺瘤、脂肪瘤]。
在本發明另一實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的肝癌的對象。肝癌包括但不限于肝細胞癌、膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤和血管瘤。
在本發明的一個實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的皮膚癌的對象。皮膚癌包括但不限于惡性黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波濟氏肉瘤、痣、發育異常的痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕疙瘩和牛皮癬。
在本發明的一個實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的婦科癌癥的對象。婦科癌癥包括但不限于子宮癌[子宮內膜癌]、宮頸癌[宮頸上皮癌、侵襲前宮頸發育異常]、卵巢癌[卵巢上皮癌(漿液性囊腫腺癌、粘質囊腫腺癌、子宮內膜樣癌、透明細胞腺癌、未分類上皮癌]、粒層泡膜細胞瘤、塞爾托利-雷迪(Sertoli-Leydig)細胞瘤、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤和其它胚細胞瘤]、陰門癌[鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤]、陰道癌[透明細胞上皮癌、鱗狀細胞癌、葡萄狀肉瘤(胚胎橫紋肌肉瘤)和輸卵管癌[上皮癌]。
在本發明的又一實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的骨癌的對象。骨癌包括但不限于成骨肉瘤[骨肉瘤]、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤因肉瘤、惡性淋巴瘤[網狀細胞肉瘤]、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤、脊索瘤、骨軟骨瘤[骨軟骨外生骨疣]、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、骨樣骨瘤和巨細胞瘤。
在本發明的一個實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的神經系統癌癥的對象。神經系統癌癥包括但不限于顱骨癌癥[骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃色瘤、骨佩吉特病]、腦脊膜癌癥[腦脊膜瘤、腦脊膜肉瘤、膠質瘤病]、腦癌[星形細胞瘤、髓母細胞瘤、膠質瘤、室管膜瘤、生殖細胞瘤(松果體瘤)、多形性膠質母細胞瘤、少突膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤]和脊髓癌[神經纖維瘤、腦脊膜瘤、膠質瘤、肉瘤]。
在本發明的一個實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的血液癌癥的對象。血液癌癥包括但不限于血液癌[骨髓性白血病(急性和慢性)、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、骨髓增生性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育異常綜合征]、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤(惡性淋巴瘤)。
在本發明的一個實施方式中，用小分子化合物治療患有表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的腎上腺癌的對象。腎上腺癌包括但不限于神經母細胞瘤。
本發明提供了治療或預防表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的癌癥的方法。在本發明的一個實施方式中，此方法包括給予患者藥物組合物的步驟。這類藥物組合物包含(例如)本發明小分子化合物。在優選實施方式中，該小分子化合物是FN1-5。在另一優選實施方式中，該小分子化合物是FN1-8。本發明藥物組合物單獨給藥或與一種或多種其它治療性化合物或治療聯合給藥。這類治療性化合物或治療的例子包括但不限于紫杉醇、環磷酰胺、他莫昔芬、氟尿嘧啶和多柔比星。此外，其它化療藥如本文所述。
癌癥治療方法可任選包括以下一個或多個步驟由個體獲得組織或液體的生物樣品；(例如)使該生物樣品接觸GLI1、GLI2或GLI3的抗體，以篩選表達GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的生物樣品；或通過檢測Gli1、Gli2或Gli3mRNA篩選表達Gli1、Gli2或Gli3多核苷酸的生物樣品。
許多癌癥最初是用本文所述的化療藥治療的。然而，癌癥常常對這些化療藥產生耐藥性，隨后這些藥物則不再有效。因此，在一個實施方式中，癌癥是多藥耐藥性癌癥或頑固性癌癥。因此，在本發明的另一方面，用本發明小分子化合物克服腫瘤細胞對化療藥的耐藥性。這種方法包括給予對至少一種化療藥產生耐藥性的腫瘤細胞本發明小分子化合物的步驟，其中所述給藥導致隨后腫瘤細胞死亡。在優選實施方式中，該小分子化合物是FN1-5。在另一優選實施方式中，該小分子化合物是FN1-8。
D.抑制含有GLI PNA結合位點的基因表達 因為GLI多肽，如GLI1、GLI2或GLI3多肽用作轉錄激活物，所以本發明方法對GLI轉錄活性的抑制作用也應抑制或下調下游基因，即其表達受GLI，優選GLI1、GLI2或GLI3調節的基因的表達。GLI一般通過結合其關聯DNA結合位點來調節下游基因的表達，所述關聯DNA結合位點操作性連接于下游基因的啟動子和/或增強子序列。例如，描述了GLI3的DNA結合位點(Vortkamp等，1995，DNA Cell.Biol 14629-34；Hallikas等，2006，Cell 124(1)47-59)。
本發明一方面鑒定了GLI1、GLI2或GLI3下游基因。按照本發明，通過對懷疑受GLI1、GLI2或GLI3調控的基因的啟動子和/或增強子區域進行DNA測序來鑒定GLI1、GLI2或GLI3下游基因。在表達或過度表達GLI1、GLI2或GLI3的癌癥中，預計GLI1、GLI2或GLI3下游基因也表達或過度表達。也可通過使基因組片段化并使用所得片段作為本領域已知的凝膠遷移試驗中的探針來鑒定具有GLI DNA結合位點的GLI下游基因。這類試驗中鑒定的任何片段可進行擴增、鑒定和/或用作核酸探針，用于篩選和鑒定來源基因，如本領域已知篩選基因組DNA文庫。(本發明提供了)鑒定哺乳動物增強子元件中的GLI結合位點的另一種方法，因此，GLI靶基因是增強子元件定位器(EEL；Hallikas等，2006，Cell 12447-59)。例如，Hallikas等鑒定了含有兩個或多個在小鼠與人和大鼠與人的比對中保守的GLI結合位點的幾個增強子元件。這些增強子元件與GLI靶基因相連，例如胞吐囊復合物元件Sec5(SEC5L1)、NULL(NM_018271；NM_144962)、早期生長反應蛋白3(EGR-3)(鋅指蛋白pilot)(EGR3)、PR-結構域鋅指蛋白10(PRDM10)、T-框轉錄因子TBX2(T-框蛋白2；TBX2)、SOX-13蛋白(1型糖尿病自身抗原ICA12)(島細胞抗原12)(SOX13)、補丁蛋白(patched protein)同源物1(PTC1)(PTC)(PTCH)以及與DAN和Cerberus有關的蛋白質(NM_022469)。因此，可采用本發明小分子化合物抑制這些靶基因的表達。
因此，在本發明的一個實施方式中，抑制了操作性連接于啟動子和/或增強子序列的含有GLI DNA結合位點，優選GLI1、GLI2或GLI3DNA結合位點的GLI下游基因。采用抑制GLI信號轉導的本發明方法可抑制下游基因。具體說，本發明提供了抑制GLI3下游基因表達的方法，所述方法包括給予表達GLI3下游基因的細胞本發明小分子化合物的步驟，其中所述給藥導致抑制了GLI3下游基因的表達。任選地，這一方法包括驗證GLI3下游基因被抑制的步驟。可采用本領域已知方法，如RT-PCR或Western印跡分析達到這一目的。
除Hallikas等(Hallikas等，2006，Cell 12447-59)鑒定的GLI靶基因以外，本發明也將Wnt2基因鑒定為GLI靶基因，即含有GLI DNA結合位點(參見本文實施例)。因此，在本發明的一個實施方式中，下游基因是Wnt基因，優選Wnt-2基因，更優選人Wnt2基因。在此實施方式中，抑制GLI3信號轉導導致抑制或下調Wnt-2以及Wnt-2信號轉導。抑制Wnt-2信號轉導能影響(例如)Dvl和β-聯蛋白的表達，如美國專利申請10/678,639和11/131,425所述。
GLI3位于GLI1和GLI2的上游，似乎也能通過結合Gli1和Gli2基因的啟動子/增強子區域內GLI3DNA結合位點調節Gli1和Gli2基因的轉錄。因此，GLI3、GLI1和GLI2的信號轉導不是平行的，而更可能是在同一信號傳導途徑內。因此，在本發明的一個實施方式中，下游基因是Gli1基因，優選人Gli1基因。在此實施方式中，抑制GLI3信號轉導導致抑制或下調Gli1表達以及GLI1信號轉導。
在本發明另一實施方式中，下游基因是Gli2基因，優選人Gli2基因。在此實施方式中，抑制GLI3信號轉導導致抑制或下調Gli2表達以及GLI2信號轉導。
E.抑制GLI多肽的活性 GLI多肽具有本文所述的幾種生物學活性。本發明一方面提供了抑制GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法。此方法包括使GLI多肽接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽活性的步驟。在本發明另一實施方式中，此方法包括使表達GLI多肽的細胞接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽活性的步驟。
例如，GLI多肽是轉錄激活物蛋白，一般通過結合于或作用于TBP相關因子(TAF)發揮其轉錄激活潛能。因此，在本發明一方面，抑制GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法包括使GLI多肽接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與TAF結合或GLI多肽與TAF相互作用的步驟。在本發明的另一實施方式中，此方法包括使表達GLI多肽的細胞接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與TAF結合或GLI多肽與TAF相互作用的步驟。
GLI多肽是轉錄激活物蛋白，一般通過結合于或作用于輔助激活物如CBP發揮其轉錄激活潛能。因此，在本發明一方面，抑制GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法包括使GLI多肽接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與輔助激活物結合或GLI多肽與輔助激活物相互作用的步驟。在本發明另一實施方式中，此方法包括使表達GLI多肽的細胞接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與輔助激活物結合或GLI多肽與輔助激活物相互作用的步驟。
本文所述的GLI多肽是轉錄激活物蛋白，一般通過結合于或作用于GLIDNA結合位點發揮其轉錄激活潛能。因此，在本發明的另一方面，抑制GLI多肽，優選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法包括使GLI多肽接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與GLI DNA結合位點結合的方法。在本發明另一實施方式中，此方法包括使表達GLI多肽的細胞接觸本發明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與GLI DNA結合位點結合的步驟。
可以在體外或體內抑制GLI多肽活性。
F.小分子化合物在制備藥物組合物或藥物中的應用 本發明另一方面提供了本發明小分子化合物在制備治療和/或預防性治療病癥，如表達GLI多肽，優選GLI3多肽的癌癥的藥物組合物或藥物中的應用。
在另一實施方式中，本發明提供了小分子化合物在制備誘導癌細胞凋亡的藥物組合物或藥物中的應用，其中所述癌細胞表達GLI多肽，優選GLI3多肽。
在另一相關方面，本發明提供了小分子化合物在制備與治療表達GLI多肽，優選GLI3多肽的癌癥的另一種化療抗癌劑聯用的藥物組合物或藥物中的應用。本文描述了本發明提供的藥物組合物和藥物。
G.篩選GLI蛋白活性調節劑 用本領域已知和本文所述的方法鑒定抑制劑和激活劑，這些抑制劑和激活劑在本文中稱為GLI蛋白活性的調節劑。可利用許多不同篩選方案來鑒定能夠調節GLI多肽活性的除本文所述化合物之外的其他化合物。術語＂調節＂包括與合適對照相比提高或降低測定的GLI多肽活性。
這些篩選方法可用于細胞，特別是哺乳動物細胞，尤其是人細胞，甚至更優選人癌細胞。總的來看，篩選方法包括篩選各種化合物以鑒定能夠調節GLI多肽活性的化合物。該方法通常包括以下步驟(a)使候選化合物與GLI多肽，含有GLI多肽的樣品或表達GLI多肽的哺乳動物細胞相接觸；和(b)測定在候選化合物存在下的GLI多肽活性。與合適對照(如不存在候選化合物時的GLI多肽，不存在候選化合物時含有GLI多肽的樣品或不存在候選化合物時表達GLI多肽的哺乳動物細胞)中的GLI多肽活性相比測定的活性提高或降低表明，該候選化合物能調節GLI多肽的活性。一旦用本發明篩選方法之一鑒定到候選化合物或候選藥物，一般將其稱為化合物或藥物，而非候選化合物或候選藥物。
可選擇能將GLI多肽活性提高或降低至所需程度的化合物進一步研究，并評估細胞可用性、藥代動力學分析、細胞毒性、生物相容性等。
在一個優選方面，該篩選方法包括篩選候選化合物以鑒定能抑制或降低GLI多肽活性的化合物。在另一方面，該篩選方法包括篩選候選化合物以鑒定能提高GLI多肽活性的化合物。
在一個方面，本發明提供了一種鑒定能調節GLI蛋白活性的化合物的方法。本發明優選方法是鑒定能夠調節GLI蛋白和TAFII31蛋白之間的蛋白質相互作用的候選化合物的方法。在一個實施方式中，此方法包括以下步驟使候選化合物于含有GLI蛋白和TAFII31蛋白的樣品相接觸；確定GLI蛋白與TAFII31蛋白的結合。與不存在候選化合物時GLI蛋白與TAFII31的結合相比，在候選化合物存在時GLI蛋白與TAFII31的結合水平降低表明該候選化合物能夠抑制GLI蛋白與TAFII31蛋白之間的相互作用。與不存在候選化合物時GLI蛋白與TAFII31的結合相比，在候選化合物存在時GLI蛋白與TAFII31蛋白的結合水平升高表明該候選化合物能夠提高GLI蛋白與TAFII31蛋白之間的相互作用。
在一個實施方式中，GLI蛋白活性是GLI蛋白依賴性轉錄活性，該方法用于鑒定能調節GLI蛋白依賴性轉錄活性的化合物。該方法包括以下步驟使樣品與候選化合物相接觸，其中該樣品包含具有一個或多個操作性連接于報道基因的GLI DNA結合位點的表達報道構建物；以及如果有，則測定所述候選化合物對GLI蛋白依賴性轉錄活性水平的影響。
可采用本領域已知的許多報道基因。合適的報道基因包括但不限于熒光素酶、CAT(氯霉素-乙酰基轉移酶)、GFP(綠色熒光蛋白)和β-Gal(β-半乳糖苷酶)。
采用(如)本文所述的結合試驗，如免疫沉淀試驗和轉錄試驗(參見例如，實施例35)，可評估不存在或存在候選化合物時對GLI蛋白與TAFII31結合的調節。通常，可將本文所述試驗用于篩選方法，用待測候選化合物替換這些試驗中分析的小分子化合物。
如本文所述，抑制GLI蛋白活性可導致癌細胞凋亡。因此，在本發明的另一個方面，提供了一種鑒定能誘導凋亡的候選化合物的方法。在此方法的優選實施方式中，該方法包括以下步驟(a)使GLI多肽與候選化合物相接觸，和(b)確定候選化合物是否結合于GLI多肽，抑制GLI多肽的活性；其中結合GLI多肽或抑制GLI多肽活性的候選化合物是適用于誘導凋亡的候選化合物。
任選地，如本文所述鑒定候選化合物的方法包括選擇結合GLI多肽或調節GLI多肽活性的化合物的步驟。
可采用本文所述的凋亡試驗和本領域已知試驗評估本文所述方法鑒定的用于誘導凋亡的候選化合物。
采用公知試驗，如臺盼藍染料排斥試驗、MTT([3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑])試驗等評估候選化合物在正常細胞(如非癌細胞)中可能存在的細胞毒活性。沒有細胞毒活性的化合物被認為是候選化合物。
a)篩選化合物 除上述篩選方法和本文所述試驗外，在本發明篩選方法的另一實施方式中，使用了利用細胞的雙雜交系統(＂媒人雙雜交系統(MATCHMAKERTwo-Hybrid system)＂、＂哺乳動物媒人雙雜交測定試劑盒＂、＂媒人單雜交系統＂(克隆泰克公司(Clontech))；＂HybriZAP雙雜交載體系統＂(司查塔基公司(Stratagene))；也參見Dalton和Treisman，1992，Cell 68597-612；Fields和Sternglanz，1994，Trends Genet 10286-92)。
例如，在雙雜交系統中，使GLI多肽與SRF-結合區或GAL4-結合區融合并在酵母細胞中表達。使結合GLI多肽的TAFII31多肽與VP16或GAL4轉錄激活區融合，也在酵母細胞中表達。或者，可使結合GLI多肽的TAFII31多肽與SRF結合區或GAL4結合區融合，使GLI多肽與VP16或GAL4轉錄激活區融合。受試化合物無法抑制GLI多肽和TAFII31多肽的結合時，二者的結合能激活報道基因，因而可檢測到陽性克隆。除HIS3基因外，可使用(如)Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、熒光素酶基因等作為報道基因。或者，受試化合物能抑制GLI多肽和TAFII31多肽的結合時，也可檢測到這兩種多肽不結合(例如，不表達lazZ基因產生白色酵母集落，而表達lacZ基因則產生藍色集落)。
本發明篩選方法中可采用任何受試化合物，例如細胞提取物、細胞培養物上清液、微生物發酵產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化蛋白或粗蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。也可利用本領域已知的組合庫方法中的許多方法來獲取本發明受試化合物，包括(1)生物文庫，(2)空間可尋址的平行固相或溶液相文庫，(3)需要去卷積的合成文庫方法，(4)＂一珠一化合物＂文庫法和(5)采用親和色譜選擇的合成文庫法。采用親和色譜選擇的生物文庫法僅限于肽文庫，而另外四種方法可用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lam，1997，Anticancer Drug Des.12145)。在本領域中可見合成分子文庫的方法的例子(DeWitt等，1993，ProcNatl Acad Sci USA 906909；Erb等，1994，Pro.Natl Acad Sci USA 9111422；Zuckermann等，1994，J Med Chem 372678；Cho等，1993，Science 2611303；Carell等，1994，Angew Chem Int.Ed Engl.332059；Carell等，1994，AngewChem Irtt Ed.Engl.332061；Gallop等，1994，J Med Chem 371233)。化合物文庫可存在于溶液中(參見Houghten，1992，Bio/Techniques 13412)或珠上(Lam，1991，Nature 35482)、芯片上(Fodor，1993，Nature 364555)、細菌上(美國專利號5,223,409)、芽孢上(美國專利號5,571,698；5,403,484和5,223,409)、質粒上(Cull等，1992，Proc Natl Acad Sci USA 891865)或噬菌體上(Scott和Smith，1990，Science 249386；Devlin，1990，Science249404；Cwirla等，1990，Proc Natl Acad Sci USA 876378；Felici，1991，J Mol Biol 222 301；美國專利申請20020103360)。按照本發明篩選方法接觸細胞或蛋白質的受試化合物可以是一種化合物或一組化合物。將一組化合物用于本發明篩選方法時，該化合物可依次或同時接觸。
用本發明篩選方法分離的化合物是能調節GLI多肽活性，以誘導凋亡和治療或預防病癥如癌癥(如本文所述)的化合物。通過本發明篩選方法獲得的化合物也包括通過本發明篩選方法獲得的化合物結構的一部分通過添加、缺失和/或取代發生轉變的化合物。
天然產生的GLI多肽和重組GLI多肽均可用于實施本發明方法。
本文提供了檢測和測定用本文所述方法鑒定的化合物、藥物或拮抗劑的方法，所述方法包括確定給定的化合物、藥物或小分子化合物能否用于實施本發明方法的各種接受的測試。本發明方法可任選包括檢測核酸如mRNA(如通過核酸雜交或PCR)、多肽(如Western印跡、免疫試驗或質譜)、酶活性(如報道基因產物如熒光素酶的酶活性)，或者誘導或抑制凋亡的步驟。這些檢測方法是本領域熟知的。
VI.試劑盒 為應用于上述診斷、研究和治療應用，本發明也提供了試劑盒。在診斷和研究應用中，這類試劑盒可包括以下任何或所有物質測定試劑、緩沖液、本發明小分子化合物、GLI多肽、Gli核酸、抗-GLI抗體、雜交探針和/或引物、Gli表達構建物等。治療產物可包括無菌鹽水或另一種藥學上可接受的乳劑和懸浮基料。
此外，該試劑盒可包括說明材料，其中含有實施本發明方法的指南(即方案)。該說明可以各種形式存在于主題試劑盒中，其中的一種或多種形式可存在于試劑盒中。
雖然說明書一般包含手寫或打印的材料，但它們不限于此。本發明考慮了能夠儲存說明并將它們傳遞給終端用戶的任何介質。這類介質包括但不限于電子儲存介質(如磁盤、磁帶、錄音帶、芯片)、光學介質(如CD ROM)等。這類介質可包括提供這類說明材料的因特網地址。
可按照本發明制備各種試劑盒和組件，這取決于該試劑盒的目標用戶和用戶的具體需求。
在本發明的優選實施方式中，該試劑盒是藥盒，包含含有以下組分的藥物組合物(i)小分子化合物，優選FN1-5或FN1-8和(ii)藥學上可接受的運載體。藥盒任選裝有說明該藥物組合物可以或應該用于治療表達GLI多肽或Gli核酸，優選GLI3多肽或Gli3核酸的癌癥的說明書。
本發明試劑盒還可包含進行質譜的試劑。這類試劑是本領域技術人員熟知的，包括例如探針或芯片。
本發明其它試劑盒實施方式包括允許本領域普通技術人員進行本文所述的任何方法變化形式的任選功能組件。
雖然為了闡述和理解的需要通過說明和舉例的方式詳細描述了上述發明，但本領域普通技術人員通過本發明內容能明白，可以在不背離本發明構思和范圍的情況下進行某些變化、改變、修飾和等效取代。結果是，在僅由所附權利要求書確定的本發明范圍內對本文所述的實施方式進行各種修飾、改變等。本領域技術人員不難了解可變化、改變或修飾以產生基本相似結果的各種非關鍵參數。
雖然在本文中描述的本發明各個部件含有多種實施方式，但應理解，除非另有說明，本發明給定部件的各個實施方式能夠與本發明其它部件的各個實施方式一起使用，各種應用應構成有區別的本發明實施方式。
將本說明書引用的所有發表物、專利和專利申請全文納入本文作參考，就好像將各篇發表物、專利或專利申請特別和單獨納入本文作參考那樣。
從上述公開可理解，本發明有各種應用。還通過以下實施例說明了本發明，它們僅為說明，而不應以任何方式限制本發明的定義和范圍。
VII.實施例 實施例1總方法 A.細胞系 大部分人細胞系獲自美國典型培養物保藏中心(A.T.C.C.；弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas，Virginia))。這些細胞系包括非小細胞肺癌(NSCLC)細胞A549、H1703、H460、H358、H322、H838、H1299、H1650、H1975和A427；間皮瘤細胞21IH、H513、H2052、H28和Met5A；結腸癌細胞SW480、HCT116、HT29、Lovo和CaCO2；乳腺癌細胞MCF7、HuL100、SKBR-3和BT474；肉瘤MG-63、MNNG、A-204和SJSA-I；黑色素瘤細胞LOX、FEM、FEMX、A375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5、SK-Mel-28和Malme-3M；人正常皮膚成纖維細胞、Malme-3；腎細胞癌細胞786-O、Caki、769-P、A704和OMRC3；前列腺癌細胞系LnCAP；膠質瘤細胞系U87；肝細胞癌細胞HepG2和SK-Hep-1；正常肌肉細胞系；正常腎細胞系HRE152和HK-2。其它人間皮瘤癌細胞系H290和MS-I獲自馬里蘭州弗雷德里克的國立衛生研究院(National Institute of Health，NIH，Frederick，Maryland)，LRK1A和REN由賓西法尼亞州費城的賓州大學(University ofPennsylvania，Philadelphia，Pennsylvania)的Steven Albelda博士實驗室友情提供。正常間皮細胞系LP-9獲自麻薩諸塞州波士頓的哈佛大學的細胞培養核心機構(Cell Culture Core Facility，Harvard University，Boston，Massachusetts))。人胰腺癌細胞系BxPC3、Panc4.21、CFPAC-1和L3.6sl由加州大學舊金山分校(University of California，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)Matthias Hebrok博士的實驗室友情提供。人鼻咽癌細胞系HNE-I和HONE-I由俄亥俄州哥倫布的俄亥俄州立大學(Ohio State University，Columbus，Ohio)的Ronald Glaser博士友情提供。人胃癌細胞系NUGC3、MNK28和AGS由加州大學舊金山分校(University of California，SanFrancisco)(加利福尼亞州舊金山)的Xin Chen博士友情提供；食道癌細胞系SEG-I、TE-7、BIC-I和OE21由加州大學舊金山分校(University of California，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)的Michael Korn博士友情提供；卵巢癌細胞系AZ23247由加州大學舊金山分校(University of California，SanFrancisco)(加利福尼亞州舊金山)的Karen Smith-McCune博士友情提供。
大多數細胞系用補充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的RPMI1640常規培養，但LP-9用含有15％ CS加10ng/ml EGF加0.4μg/ml HC的M199培養；卵巢癌細胞系AZ23247用補充有10％胎牛血清(UCSF細胞培養機構(UCSF Cell Culture Facility))的M15培養基培養；正常腎細胞系HRE152用補充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的αMEM培養；獲自馬里蘭州沃科司威爾的克隆泰科公司(Clonetics，Walkersville，Maryland)的正常人小氣道上皮細胞(SAEC)和支氣管上皮細胞(NHBE)(原代培養物)用克隆泰克SAGMTM Bullet試劑盒培養。所有細胞系均在含有5％CO2的37℃潮濕培養箱中培養。
B.組織樣品 在手術時獲取初次進行治愈性腫瘤切除術患者的新鮮的癌組織和相鄰正常組織(IRB批準號H8714-15319-040)，立即用液氮快速冷凍。這些組織樣品在液氮中以-170℃保存待用。原代組織培養物的制備方法如下經由進行切除術的患者同意，由其獲得新鮮癌癥組織，切成小塊(直徑1-2mm)，然后按照生產商方案用膠原酶A(印第安納州印第安納波利斯的羅氏應用科學公司(Roche Applied Science，Indianapolis，Indiana))室溫消化2小時。離心消化獲得的單個細胞，用補充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的RPMI1640洗滌細胞團兩次。然后，將細胞重懸于相同培養基中，用6孔板在含有5％CO2的37℃潮濕培養箱中培養，直到它們可用于進一步治療。
C.細胞存活率試驗(基于細胞的細胞毒試驗) 本發明小分子化合物一般溶解于DMSO，濃度為30mM。然后在細胞培養條件下測定范圍是0、10、30、50至100μM的不同濃度的小分子化合物。為了測定治療后的細胞存活率，用該小分子化合物在6孔板中培養細胞約3天。去除細胞培養基后，加入1ml 0.5％結晶紫溶液(用20％乙醇和20％甲醇制備)，染色細胞5分鐘。然后，用自來水沖洗掉結晶紫溶液。根據結晶紫染色平板的密度估計細胞存活率。
測定增殖或細胞毒試驗中活細胞數目的另一種試驗是比色法MTS試驗。可購得MTS測定試劑(普洛麥格公司(Promega Corp.)，威斯康星州麥迪遜)。該試劑含有四唑鎓化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，內鹽；MTS]和電子偶聯試劑(吩嗪乙基硫酸鹽；PES)。PES的化學穩定性提高，使其能夠與MTS混合形成穩定溶液。MTS四唑鎓化合物(歐文試劑(Owen.s reagent))被細胞生物還原成有色的甲

產物，該產物在組織培養基中可溶。可通過代謝活性細胞中的脫氫酶產生的完成這種轉化。經490nm吸光度測定的甲

產量與培養基中的活細胞數成正比。因為MTS甲

產物在組織培養基中可溶，所以此試驗需要的步驟比使用四唑鎓化合物如MTT要少。MTT還原產生的甲

產物是結晶沉淀，需要額外步驟來溶解這些晶體，然后記錄570nm的吸光度讀數。
B.凋亡分析 按照生產商方案用膜聯蛋白V FITC凋亡檢測試劑盒(加州卡馬里奧的生物資源公司(Biosource，Camarillo，CA))分析凋亡。用不同濃度的不同小分子化合物處理約3天后，通過胰酶消化收獲細胞，染色，立即用流式細胞術分析(FACScan；貝克頓迪金森公司(Decton Dickinson)，新澤西州富蘭克林湖(Franklin Lake，New Jersey))。暴露磷脂酰絲氨酸但細胞膜完整的早期凋亡細胞將結合膜聯蛋白V-FITC，但不結合碘化丙錠(PI)。壞死或晚期凋亡階段的細胞會同時標記上膜聯蛋白V-FITC和PI。＂％凋亡細胞＂或＂％凋亡＂指早期晚期凋亡細胞之和。
E.半定量RT-PCR 用凱杰RNeasy小抽試劑盒(加州巴倫西亞(Valencia，California))分離細胞系或組織樣品的總RNA。用英杰生物技術公司(加利福尼亞州卡爾斯巴德)的一步RT-PCR試劑盒在GeneAmp PCR系統2700(加州福斯特城的應用生物系統公司(Applied Biosystems，Foster City，California))中進行RT-PCR。RT-PCR引物獲自加州阿拉米達的歐普龍技術公司(Operon TechnologiesInc.，Alameda，California)。擴增Hedgehog和Wnt信號傳導途徑中不同基因的引物序列見下表(表1；F，正向引物；R，反向引物)。標出各引物對產生的PCR產物的預計大小。GAPDH用作內標。
表1.半定量RT-PCR中的引物序列 F.瞬時轉染cDNA構建物 在瞬時轉染實驗中，在轉染前24小時用不含抗生素的生長培養基將細胞(2 x 105)接種于六孔板。按照生產商方案，通過LipofectamineTM 2000(英杰生物技術公司；加利福尼亞州卡爾斯巴德)介導，用2.0μg pCDNA3載體中的cDNA或2.0μg pCDNA3空載體作對照進行轉染。然后在含有5％CO2的37℃潮濕培養箱中培養轉染細胞，直到它們可用于分析。Gli2 cDNA由奧地利薩爾茲堡的薩爾茲堡大學(University of Salzburg，Salzburg，Austria)的Fritz Aberger博士友情提供。Gli1和Gli3 cDNA由馬里蘭州巴爾的摩的約翰霍普金斯大學(Johns Hopkins University，Baltimore，Maryland)的悉尼金梅綜合癌癥中心(Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center)的BertVogelstein博士和Kenneth W.Kinzler博士友情提供。TAFII31 cDNA由麻薩諸塞州劍橋的哈佛大學的Gregory L.Verdine博士友情提供。
G.啟動子活性分析 轉染前一天，將細胞(1 x 105)接種于裝有不含抗生素的生長培養基的12孔板。細胞達到80-90％匯合度時，用0.5μg pGL3Basic載體中的各啟動子構建物和0.025μg含有花蟲熒光素酶的pRL-TK載體(普洛麥格公司(Promega)；威斯康星州麥迪遜)共同轉染它們，含有花蟲熒光素酶的pRL-TK載體用作轉化效率的內標。用Lipofectamine 2000TM(英杰生物技術公司)介導轉染約6小時。然后用含有濃度為30μM的各種小分子化合物的新鮮培養基更換原來的培養基，再培養得到的細胞18-24小時，并進行熒光素酶試驗。簡要說，用裂解緩沖液裂解細胞，用雙熒光素酶試驗系統(普洛麥格公司)和照度計測定各孔細胞的螢火蟲和花蟲熒光素酶活性。將熒光素酶的測定活性標準化至pRL-TK載體活性，并相對于pGL3-Basic空載體的基本活性給出其活性(設定為統一)。所示數據代表平均值(±S.D.)。一式三份地進行所有測定，在至少三次獨立實驗中重復進行。加州大學舊金山分校(University of California，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)Jablons博士的實驗室克隆和鑒定了人Wnt-2啟動子-熒光素酶構建物、人SOCS3啟動子-熒光素酶構建物和人Gremlin啟動子-熒光素酶構建物(He等，BiochemBiophy Res Comm，2003；和未公開數據)。6GLI-TKO-熒光素酶構建物(含有6個共有GLI DNA結合序列重復)由加州大學舊金山分校(University ofCalifornia，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)Matthias Hebrok博士的實驗室友情提供。
H.TOPFLASH試驗 將細胞接種于12孔板。如上所述將TOPFLASH或FOPFLASH報道質粒(Upstate；弗吉尼亞州夏洛茨維爾(Charlottesville，Virginia))瞬時轉染到細胞中。通過pTOPFLASHpFOPFLASH熒光素酶活性之比測定Tcf-介導的基因轉錄，各活性值標準化至pRL-TK報道物(共同轉染的內標)的熒光素酶活性。一式三份地進行所有測定，至少重復三次。
I.Western印跡 用標準方案(伊利諾斯州羅克福德的皮爾斯生物技術公司(PierceBiotechnology，Rockford，Illinois)獲得用或不用小分子化合物處理(30μM處理2-3天)的細胞培養物的全部蛋白質。用伯樂(Bio-Rad)蛋白質測定試劑測定蛋白質濃度。將全部細胞裂解物蛋白(5-20μg)煮沸5分鐘，用10-20％SDS-PAGE分離。用半干轉移槽(加州貝尼西亞的伯樂公司(Bio-Rad；Benicia，California))將蛋白質轉移到Immobilon-P膜(麻薩諸塞州貝德福德的密理伯公司(Millipore Corp.，Bedford，Massachusetts))上。用Tris-緩沖鹽水配制的5％脫脂奶粉和0.1％吐溫20在4℃下封閉膜過夜，然后用第一抗體在室溫下培育1小時。用Tris-緩沖鹽水配制的5％脫脂奶粉和0.1％吐溫20洗滌膜三次，每次10分鐘。辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔或驢抗小鼠抗體用作第二抗體。用化學發光魯米諾試劑(圣克魯斯生物技術公司(SantaCruz Bio-technology))觀察蛋白質。抗Dvl-3抗體和抗-存活素抗體購自加州圣克魯斯(Santa Cruz，California)的圣克魯斯生物技術公司。抗胱冬酶3抗體來自麻薩諸塞州劍橋的癌基因公司(Oncogene，Cambridge，Massachusetts)。抗-β-肌動蛋白抗體購自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Corp.)(密蘇里州圣路易斯(St.Louis，Missouri))。抗-β-聯蛋白抗體購自肯塔基州列克星敦的轉導實驗室公司(TransductionLaboratories，Lexington，Kentucky)。抗-細胞色素c抗體來自BD生物科學公司(BD Biosciences)(加州圣地亞哥)。為了檢測β-聯蛋白的改變，如我們實驗室以前發表的文獻所述制備胞漿提取物并進行檢測。
J.體內抗腫瘤發生研究 在攜帶人癌細胞的小鼠異種移植瘤模型體內檢測小分子化合物FN1-8。簡要說，在無熱原條件下培育雌性無胸腺裸小鼠品系NCRNU-M(5-10周齡，體重20-25克；塔康(Taconic)，德國城(Germantown)，紐約)。使用三種人癌細胞系NSCLC H460、黑色素瘤LOX(均顯示Gli3激活)和結腸癌HT29(沒有激活Gli3，用作陰性對照)。各組中使用10只小鼠，在背部區域皮下注射體積100μl的3 x 106個癌細胞。接種后，使人癌細胞在小鼠中生長7天，變成可見的腫瘤塊。然后給動物注射小分子化合物FN1-8，劑量為50毫克/千克體重(1毫克/小鼠/天)。單獨的DMSO用作對照。在小鼠腹部進行腹膜內注射時，將化合物和對照體積調整為40μl。注射化合物(6次注射)后1小時內處死一只小鼠，收集血液。然后用質譜分析血樣中的化合物水平，以驗證吸收到小鼠血流中的化合物。每天大約在相同時間進行注射，共注射14天。完成化合物處理后使腫瘤再生長1-2周。每三天測定一次腫瘤大小，用寬(x)和長(y)計算腫瘤體積(x2y/2，其中x<y)。數據表示為平均值(±S.D.)。
K.TUNEL染色分析腫瘤異種移植物上的凋亡 在體內實驗結束時，處死后從不同治療組的小鼠上切下腫瘤。切下的腫瘤立即進行低溫粉碎，然后測定各樣品的腫瘤質量。按照生產商方案用ApopTag過氧化物酶原位寡核苷酸連接凋亡檢測試劑盒(加州特美克拉的開米康國際公司(Chemicon International，Temecula，California))對腫瘤樣品進行TUNEL染色。
L.用于評估毒性的組織學檢查 體內研究完成后，切下小鼠的不同器官。這些器官包括肝、肺、心、腎、腸、卵巢、腦、脾、皮膚和肌肉。用4％甲醛緩沖液固定樣品，石蠟包埋，切片，并用蘇木精和伊紅(HE)染色進行組織學分析。由小鼠病理學家檢查與DMSO對照相比所有器官的HE染色玻片的毒性證據。
M.統計學分析 所示數據代表平均值(±S.D.)。用Excel的不配對T檢驗比較不同處理和細胞系。
實施例2模擬Gli3轉錄激活域的肽FDAII 為了用小分子模擬GLI3轉錄激活域的FDAII基序，構建FDAII的3D結構模型。如Yoon等(1998，J Biol Chem 2733496-3501)所述，GLI1多肽的FVAIL基序產生α-螺旋結構。也應該對GLI3多肽的FDAII基序的α螺旋結構建模。因此，產生了GLI3多肽的FDAII基序的α螺旋結構，通過合理化學設計來設計模擬此基序結構的小分子化合物。設計了含有吡唑啉結構的小分子化合物。圖3顯示小分子化合物FN1-5(本文所述)和GLI3多肽的FDAII基序(模擬為α-螺旋的)之間的RMS重疊圖。
實施例3制備小分子化合物 a)1，3，5-三苯基-4，5-二氫吡唑-4-羧酸乙酯(FN1-1)的制備
將肉桂酸乙酯(7，2.55g)、苯甲醛苯腙(2，4.21g)，三水合氯胺-T(6.45g)和甲醇(45mL)的混合物加熱回流22小時。用50％乙酸乙酯的正己烷溶液(400mL)稀釋反應混合物，過濾并蒸發。用柱色譜純化殘留物(硅膠200g，洗脫液0-10％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發得到無色結晶狀FN1-1(8，1.25g)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ 7.66-7.64(m，1H)，7.46-7.22(m，13H)，6.88(t，J＝7.2Hz，1H)，4.81(d，J＝4.0 Hz，1H)，4.70(d，J＝4.0Hz，1H)，4.07(四重峰，J＝7.2Hz，2H)，0.97(t，J＝7.2Hz，3H)。MS371.9(M+H)，325.5，297.5。
b)1，3，5-三苯基-4，5-二氫吡唑-4-羧酸(FN1-2)的制備 FN1-1(53mg)、甲醇(0.5mL)、1，4-二噁烷(0.5mL)和10％(w/v)氫氧化鈉水溶液(0.1mL)的混合物在室溫下保溫1小時。用水(30mL)稀釋反應混合物，用30％乙酸乙酯的正己烷溶液洗滌。用2N鹽酸酸化水相，用乙酸乙酯萃取。用水洗滌萃取物兩次(各5mL)，然后用鹽水(5mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，蒸發得到FN1-2(38mg)。MS297.9(M-CO2H)。
c)正丁基-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-3)的制備
以類似于FN1-5的方式，用正丁胺代替4-(羥基苯基)乙胺制備FN1-3。MS420.9(M+Na)，398.9(M+H)，325.5，297.5。
d)N-(5-羥基戊基)-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-5)的制備
將FN1-1(22mg)、5-氨基戊醇(100微升)和N-N-二甲基甲酰胺(200微升)的混合物于95℃加熱20小時。用乙酸乙酯(10mL)稀釋反應混合物，用水洗滌兩次(各5mL)，然后用鹽水(5mL)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發。用柱色譜純化殘留物(硅膠10mL，洗脫液0-70％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發得到淺黃色無定形FN1-5(12mg)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.69-7.67(m，1H)，7.34-7.14(m，13H)，6.94(t，J＝7.6Hz，1H)，6.37(寬t，1H)，4.82(d，J＝4.8Hz，1H)，4.48(d，J＝4.8Hz，1H)，3.53(t，J＝6.4Hz，2H)，3.40-3.33(m，1H)，3.22-3.14(m，1H)，1.56-1.41(m，6H)。MS450.6(M+Na)，428.6(M+H)，325.5，297.5。UV吸收峰348nm(0.05％TFA-MeOH-水8:2)。
e)N-(3-羥丙基)-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-7)的制備
以類似于FN1-5的方式，用3-氨基丙醇代替4-(羥基苯基)乙胺制備FN1-7。MS422.9(M+Na)，400.9(M+H)，325.5，297.5。
f)N-(2-(4-羥基苯基)乙基)-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-8)的制備
將FN1-1(11mg)、4-(羥基苯基)乙胺(132mg)和N-N-二甲基甲酰胺(100微升)的混合物于95℃加熱20小時。用乙酸乙酯(10mL)稀釋反應混合物，用水洗滌兩次(各5mL)，然后用鹽水(5mL)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發。用柱色譜純化殘留物(硅膠10mL，洗脫液0-50％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發得到淺黃色無定形FN1-8(9.5mg)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ 7.66-7.63(m，1H)，7.34-7.16(m，14H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，6.94(t，J＝6.8Hz，1H)，6.84(d，J＝8.4Hz，1H)，6.52(d，J＝8.4Hz，1H)，6.35(寬t，J＝5.6Hz，1H)，4.66(s，1H)，4.65(d，J＝4.8Hz，1H)，4.41(d，J＝4.8Hz，1H)，3.56-3.42(m，2H)，3.40-3.33(m，1H)，2.76-2.57(m，2H)。MS484.5(M+Na)，462.5(M+H)，325.5，297.5。UV吸收峰351nm(0.05％TFA-MeOH-水8:2)。
通過液相色譜-質譜分析小分子化合物FN1-8的制劑，發現它的純度為90-95％(數據未顯示)。
g)5-(1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羰基)氨基戊酸(FN1-9U)和5-(1，3，4-三苯基-4，5-二氫-吡唑-5-羰基)氨基戊酸(FN1-9S)的制備
將乙酰氯(5mL)加入甲醇(150mL)中，以制備氯化氫的甲醇溶液，然后加入5-氨基戊酸(1g)。將該混合物在室溫下保溫過夜，蒸發以分離5-氨基戊酸甲酯鹽酸鹽。5-氨基戊酸甲酯鹽酸鹽(251mg)、肉桂酸(74mg)、HBTU(168mg)、二異丙基乙胺(0.87mL)和二甲基甲酰胺(2mL)在室溫下保溫1小時。用乙酸乙酯(20mL)稀釋反應混合物，用水洗滌兩次(各10mL)，然后用鹽水洗滌(10mL)，干燥(Na2SO4)，蒸發以分離(4-甲氧基羰基)丁基肉桂酰胺(1，100mg)。將(4-甲氧基羰基)丁基肉桂酰胺(1，100mg)、苯甲醛苯腙(2，113mg)、三水合氯胺-T(160mg)和甲醇(2mL)的混合物加熱回流22小時。用50％乙酸乙酯的正己烷(40mL)溶液稀釋該反應混合物，過濾并蒸發。用柱色譜純化殘留物(硅膠20g，洗脫液0-10％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，以分離5-(1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羰基)氨基戊酸甲酯(3，13mg)和5-(1，3，4-三苯基-4，5-二氫-吡唑-5-羰基)氨基戊酸甲酯(4，103mg)。通過與酰胺羰基相鄰的CH的1H-和13-C NMR化學改變鑒定各異構體的位向化學。通過FN1-2制備中所述的標準酯水解條件由3獲得5-(1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羰基)氨基戊酸(5，FN1-9U)。MS464.9(M+Na)，442.9(M+H)，325.8，297.9。通過類似于FN1-2制備的方式由4獲得5-(1，3，4-三苯基-4，5-二氫-吡唑-5-羰基)氨基戊酸(6，FN1-9S)。MS464.9(M+Na)，442.9(M+H)，325.8，297.9。
5和6位向化學的指定與其ESI-MS片段相當一致即，5產生的去羰基峰(m/z＝297)比6大，因為其β-酮亞氨基結構有利于去羰基化。


FN1-9U(右上圖)和FN1-9S(左上圖)的ESI-MS。由于去羰基化片段的形成(下圖)，FN1-9U在m/z＝297時的峰大于FN1-9S。
h)1，3-二苯基-5-異丁基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酸乙酯(FN2-1)的制備
簡單地用正己烷沖洗60％氫化鈉在礦物油中的分散體(0.24g)以去除油，并將該分散體懸浮于無水二甲基甲酰胺(5mL)中。在冰水浴中冷卻該懸浮液，加入磷代乙酸三乙酯(1.0mL)。攪拌該混合物0.5小時后，在冰浴溫度下加入3-甲基正丁醛(0.65mL)。室溫攪拌該混合物過夜，用水(10mL)處理，用50％乙酸乙酯的正己烷溶液(30mL)萃取，用水洗滌兩次(各20mL)，然后用鹽水(20mL)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發。用柱色譜純化殘留物(硅膠40mL，洗脫液0-5％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發得到無色油狀5-甲基-己-2-烯酸乙酯。通過類似于FN1-1的方式，用5-甲基-己-2-烯酸乙酯代替實施例2中的肉桂酸乙酯制備FN2-1。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ 7.35-7.29(m，3H)，7.25(dt，J＝2.0Hz，6.8Hz，2H)，7.13(dd，J＝1.6Hz， 6.4Hz，2H)，7.06(d，J＝8.0Hz，2H)，6.84(t，J＝7.6Hz，1H)，4.52(d，J＝5.6Hz，1H)，4.26(d，J＝5.6Hz，1H)，4.21(四重峰，J＝7.2Hz，2H)，2.14(dd，J＝9.2Hz，14.8Hz，1H)，2.05(dd，J＝5.6Hz，15.2Hz，1H)，1.95(雙七重峰，J＝2.8Hz，6.0Hz，1H)，1.21(t，J＝7.2Hz，3H)，0.94(d，J＝6.4Hz，6H)。MS351.9(M+H)，277.9，194.7。
i)N-(5-羥基戊基)-1，3-二苯基-5-異丁基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN2-5)的制備
通過類似于FN1-5的方式用FN2-1代替FN1-1制備FN2-5。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ 7.31-7.25(m，5H)，7.09-7.03(m，4H)，6.92(t，J＝7.2Hz，1H)，6.63(寬t，J＝5.6Hz，1H)，4.30(d，J＝6.0Hz，1H)，4.20(d，J＝6.0Hz，1H)，3.59(t，J＝6.0Hz，2H)，3.31(dd，J＝4.4Hz，6.8Hz，1H)，3.28(dd，J＝4.4Hz，6.8Hz，1H)，2.12(dd，J＝8.8Hz，14.8Hz，1H)，2.05(dd，J＝6.0Hz，15.6Hz，1H)，1.93(雙七重峰，J＝2.4Hz，6.8Hz，1H)，1.53(五重峰，J＝6.4Hz，2H)，1.50(五重峰，J＝6.4Hz，2H)，1.32(五重峰，J＝6.4Hz，2H)，0.92(d，J＝6.8Hz，3H)，0.90(d，J＝6.8Hz，3H)。MS431.0(M+Na)，409.0(M+H)，305.9，277.9。
j)N-(5-羥基戊基)-1-苯基-3，5-雙(異丁基)-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN3-5)的制備
通過類似于實施例2的方式用5-甲基-2-己酸乙酯代替實施例2中的肉桂酸乙酯并用3-甲基正丁醛苯腙代替實施例2中的苯甲醛苯腙制備1-苯基-3，5-雙(異丁基)-4，5-二氫吡唑-4-羧酸乙酯。通過類似于實施例4的方式用1-苯基-3，5-雙(異丁基)-4，5-二氫吡唑-4-羧酸乙酯代替實施例4中的FN1-1，制備FN3-5。MS411.0(M+Na)，389.1(M+H)，285.9，257.9。
實施例4大多數癌細胞系表達Gli3 通過半定量RT-PCR分析幾種癌細胞系和原代組織樣品，以研究Gli3的表達。圖2顯示了檢測Gli3表達的RT-PCR的示范性分析。經分析發現表達可檢測水平的Gli3mRNA的細胞系包括正常肝臟(圖2，中圖，泳道1)；NSCLCH1703、H460和A549(圖2，中圖，泳道2、3、4)；乳腺癌HuL100、BT474和MCF-7(圖2，中圖，泳道5、6、7)；間皮瘤Met5A、H290、REN、H513、H28和211H(圖2，中圖，泳道8-13)；結腸癌SW480(圖2，中圖，泳道15)；一對原代NSCLC組織樣品(圖2，中圖，泳道16和17分別是正常組織和癌組織)。LARK1A不顯示可檢測的Gli3 mRNA表達水平(圖2，中圖，泳道14)。
在另一組相似的RT-PCR實驗中，分析Gli3表達，并在結腸癌細胞SW480、Lovo和CaCO2(圖2，下圖，泳道1、4、5)；正常結腸(圖2，下圖，泳道6)；正常腎細胞系HRE-152和HK-2(圖2，下圖，泳道7和8)；腎細胞癌786-O、Caki、769-P、A704和OMRC3(圖2，下圖，泳道9-13)；正常肺(圖2，下圖，泳道14)；間皮瘤REN、H290、211H、H513、H2052、H28和MS-1(圖2，下圖，泳道15-21)；NSCLCA549、H460、H838、H1703、H1299、H1650和H1975(圖2，下圖，泳道22-28)中進行檢測。因此，大部分癌細胞系表達Gli3。在細胞系HCT116(圖2，下圖，泳道2)、HT29(圖2，下圖，泳道3)和A427(圖2，下圖，泳道29)中發現無Gli3表達或其表達水平低。
實施例5篩選GLI3信號轉導的小分子抑制劑 用本文所述的細胞試驗初步篩選本發明小分子化合物。圖4顯示了這種分析的結果。用濃度為100μM的小分子化合物FN1-1、FN1-2、FN1-3、FN1-5和FN2-1培育兩種NSCLC細胞系H1299和A549以及兩種結腸癌細胞系SW480和HCT116。DMSO用作對照。在所有測試的癌細胞系中觀察到FN1-5的顯著細胞殺傷作用(活細胞用0.5％結晶紫染色)。此試驗將抑制GLI轉錄激活域(TAF-結合域，TAFbd)的小分子化合物FN1-5鑒定為活性命中化合物。
圖6顯示了用三種NSCLC細胞系(H1299、A549和H460)和一種結腸癌細胞系(SW480)測試小分子化合物FN1-7、FN1-8和FN3-5的細胞毒試驗結果。如上所述將癌細胞系接種于6孔板，用50和100μM各化合物(母液溶解于DMSO，30mM)培育3天。在所有受試癌細胞系中觀察到FN1-8的顯著細胞殺傷作用，FN1-8是小分子化合物FN1-5的修飾形式。也采用流式細胞術進行凋亡分析，結果一致(數據未顯示)。因此，采用本文所述的合理的設計-篩選方法，鑒定到抑制GLI3轉錄激活域(TAF-結合域)的另一種小分子化合物FN1-8。
實施例6小分子FN1-5和FN1-8能誘導結腸癌細胞系CaCO2和SW480凋亡 用本發明小分子化合物處理結腸癌細胞后，用流式細胞術檢測細胞凋亡。在圖5所示的代表性實施例中，觀察到用100μM FN1-5處理3天后結腸癌細胞系SW480顯著凋亡(58.6％)(表2)。此結果與染色結果相一致。
使用本發明小分子化合物FN1-5和FN1-8進行細胞毒性試驗時，觀察到對人結腸癌細胞系LoVo和CaCO2的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。FN1-8似乎比FN1-5的細胞殺傷作用更有效。小分子化合物FN1-5和FN1-8均能誘導CaCO2凋亡(表2和3)。
也用10、30、50和100μM化合物FN1-9U和FN1-9S培育兩種結腸癌細胞系SW480和HCT116。沒有觀察到顯著的細胞殺傷作用或凋亡(數據未顯示)。
實施例7小分子FN1-5而非FN1-8能在結腸癌細胞系HT29中誘導細胞殺傷和凋亡 將小分子化合物FN1-5用于細胞毒性試驗時，在人結腸癌細胞系HT29中觀察到顯著的細胞殺傷作用(數據未顯示)。然而，即使在較高劑量(50μM；數據未顯示)下，用小分子化合物FN1-8處理也沒有觀察到細胞殺傷作用。
用小分子化合物FN1-5和FN1-8處理細胞后，用流式細胞術檢測結腸癌細胞系HT29凋亡。雖然FN1-5能誘導HT29細胞凋亡(50μM觀察到35％凋亡細胞；表2)，用FN1-8處理后沒有觀察到凋亡(表3)。這些結果與上述染色結果相一致。因此，小分子化合物FN1-8在HT29細胞中既不影響存活也不誘導凋亡的結果證明，在其它細胞系中檢測到的FN1-8介導的作用不是由于FN1-8的一般毒性。
在這個方面值得注意的是，雖然HT29細胞表達Gli1和Gli2(數據未顯示；Zhu等，2004，Cancer Lett.207(20205-214)，但沒有觀察到HT29細胞中的Gli3表達(圖2，下圖，泳道3)。
實施例8小分子化合物FN1-5和FN1-8誘導NSCLC細胞凋亡 用本發明小分子化合物處理幾種NSCLC細胞系后，用流式細胞術檢測凋亡。例如，用100μM FN1-5處理3天后，觀察到NSCLC細胞系H1299顯著凋亡(55.9％凋亡)，A549顯著凋亡(30.0％凋亡)(其它數據見表2)。這些結果與染色結果一致。
用30μM和50μM FN1-8處理3天后，也觀察到NSCLC細胞系H460(50μM時75.2％凋亡；表3)和H838(50μM時82.3％凋亡；表3)顯著凋亡。這些結果與染色結果一致。FN1-5也能誘導H460和H838細胞凋亡(表2)。一致的是，觀察到FN1-8在相同劑量下誘導凋亡的效力高于FN1-5(表2和3)。
使用本發明小分子化合物FN1-5和FN1-8進行細胞毒性試驗時，觀察到對NSCLC細胞系H460、H838、H1975、H1650和H1703顯著的細胞殺傷作用。比較相同濃度時，FN1-8對這些細胞系的強度似乎高于FN1-5(數據未顯示)。
用NSCLC細胞系A549、H358和H322進行小分子化合物FN1-8的劑量滴定實驗。將A549、H358和H322細胞接種于6孔板，用DMSO(對照)或7.5μM、10μM、15μM、20μM和30μM FN1-8分別培育3天。加入15μM或更高濃度的FN1-8時觀察到對這些細胞系的顯著和劑量依賴性細胞殺傷作用。FN1-8在A549和H368細胞中誘導細胞殺傷作用的濃度稍低于H322細胞(數據未顯示)。用20μM FN1-8培育3天后，約28％A549細胞和58％H358細胞發生凋亡(表3)。
給予小分子化合物FN1-8后，分析了NSCLC細胞A549、H358和H322中的細胞存活時程。用10μM和20μM FN1-8培育A549細胞，分別用15μM和30μM FN1-8培育H358和H322細胞。然后用流式細胞術檢測不同時間點上活細胞和死細胞的百分數。3天后，FN1-8對A549細胞顯示出劑量依賴性細胞殺傷作用。在H358細胞中，FN1-8的細胞殺傷作用在1天后已經很明顯，在H322細胞則為2天后(數據未顯示)。
小分子化合物FN1-8也能顯著抑制NSCLC細胞的細胞增殖，所述NSCLC細胞包括A549、H358和H322細胞。通過以下方法證明這一點用7.5μM或15μM FN1-8培育細胞，然后按照生產商方案在加入化合物后的不同時間點上進行MTS試驗。已發現，1天后，FN1-8能以劑量依賴性方式抑制這些細胞的細胞增殖(數據未顯示)。
根據用小分子化合物FN1-5和FN1-8獲得的篩選結果，用本文所述的細胞毒和凋亡試驗檢測其它小分子化合物對H1299和A549細胞的影響。使用10、30、50和100μM化合物FN1-9U和FN1-9S時，沒有觀察到顯著的細胞殺傷作用或凋亡(數據未顯示)。
實施例9小分子化合物FN1-5和FN1-8在原代培養的NSCLC中誘導細胞殺傷作用和凋亡 也用流式細胞術檢測本發明小分子化合物在原代培養的NSCLC細胞(由組織樣品新鮮制備)中誘導的凋亡。例如，用10、30和50μM FN1-8或30和50μM FN1-5處理3天后，觀察到原代培養的NSCLC細胞顯著凋亡(數據未顯示)。例如，在50μM FN1-8時觀察到約60％凋亡細胞。這些結果與采用原代培養NSCLC細胞以及化合物FN1-5和FN1-8進行的細胞毒試驗獲得的結果相一致(數據未顯示)。再一次發現相同濃度時FN1-8的效力高于FN1-5。
實施例10小分子化合物FN1-5和FN1-8能誘導黑色素瘤細胞凋亡 用細胞毒試驗和黑色素瘤細胞系LOX檢測小分子化合物FN1-5、FN1-8、FN1-7、FN1-9U和FN1-9S的作用。將LOX細胞接種于6孔板，用100μM各化合物(將母液溶解于DMSO，30mM)培育3天，如本文所述。一致的是，觀察到FN1-5和FN1-8的顯著細胞殺傷作用(圖7)。用小分子化合物FN1-7和FN1-9U培育LOX細胞時，也觀察到一些殺傷作用。活細胞用0.5％結晶紫染色。
也用人黑色素瘤細胞系LOX和不同劑量的小分子化合物FN1-5和FN1-8檢測細胞殺傷作用。將LOX細胞接種于6孔板，用10、30和50μM各化合物培育3天，如本文所述。觀察到這兩種化合物在50μM時均有顯著的細胞殺傷作用。似乎FN1-8殺傷LOX細胞的效力高于FN1-5，因為與30μM FN1-5比30μM FN1-8的細胞殺傷作用更高(數據未顯示)。
用不同濃度的這兩種化合物和流式細胞術更詳細地分析用小分子化合物FN1-5和FN1-8處理LOX細胞時的細胞殺傷作用。處理3天后，所有測試濃度的這兩種化合物均能誘導LOX細胞系顯著凋亡10μM小分子化合物FN1-5誘導14.0％凋亡，30μM誘導16.6％凋亡，50μM誘導58.1％凋亡；對照DMSO誘導10.9％(表2)；(b)10μM小分子化合物FN1-8誘導16.7％凋亡，30μM誘導19.0％凋亡，50μM誘導78.9％凋亡(對照DMSO誘導10.9％凋亡)(表3)。再一次，在相等劑量下小分子化合物FN1-8的凋亡誘導能力似乎稍高于FN1-5(表2和3)。
用黑色素瘤細胞系A375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28進行小分子化合物FN1-8的劑量滴定實驗。將A375細胞接種于6孔板，分別用DMSO(對照)或2μM、5μM、10μM、20μM和40μM FN1-8培育3天。加入10μM或更高濃度的FN1-8時觀察到對此細胞系產生顯著和劑量依賴性的細胞殺傷作用(數據未顯示)。在黑色素瘤細胞系G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28中觀察到相似的細胞殺傷作用(數據未顯示)。用20μM FN1-8培育4天后，約20％Malme-3M細胞、28％SK-Mel-2細胞、36％SK-Mel-5細胞、41％A375細胞和17％G361細胞發生凋亡，而在相同條件下少于3％正常皮膚成纖維細胞發生凋亡(表3)。
小分子化合物FN1-8也會顯著抑制黑色素瘤細胞增殖，這些細胞包括Malme-3M、A375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28細胞系。通過以下方法證明這一點用5μM或10μM FN1-8培育細胞，在加入該化合物后按照生產商方案在不同時間點上進行MTS試驗。在Malme-3M、G361、SK-Mel-2和SK-Mewl-28中，10μM FN1-8處理1-2天后能抑制這些細胞的增殖，在A375和SK-Mel-5細胞中，1天后就已經出現這種作用(數據未顯示)。
給予小分子化合物FN1-8后，分析黑色素瘤細胞系(Malme-3M、A375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28)的細胞存活時程。用10μM或20μM FN1-8培育這些黑色素瘤細胞。然后用流式細胞術檢測不同時間點上存活細胞和死細胞的百分數。在所有檢測的黑色素瘤細胞中，20μM FN1-8作用2天后具有顯著的細胞殺傷作用(圖18A、B和C，數據未顯示)。
為了研究本發明小分子化合物如FN1-8能否特異性殺傷癌細胞，在給予10μM和20μM FN1-8后，也用人正常皮膚成纖維細胞細胞(Malme-3)進行細胞存活的時程試驗。用10μM和20μM FN1-8培育這些細胞，6天后沒有觀察到細胞殺傷作用(圖18D)。因此，將FN1-8給予正常皮膚成纖維細胞不能影響這些正常皮膚細胞的活力。這一發現表明，FN1-8的細胞殺傷作用是對癌細胞特異的。
實施例11小分子FN1-5和FN1-8能誘導間皮瘤細胞系211H和H290以及原代培養的間皮瘤細胞凋亡 也用間皮瘤細胞系H290、211H、MS1和REN以及不同劑量的小分子化合物FN1-5和FN1-8檢測細胞殺傷作用。將細胞接種于6孔板，如本文所述用1、10和30μM各化合物培育3天。觀察到這兩種化合物在30μM時對H290和211H細胞有顯著的細胞殺傷作用(數據未顯示)。然而，這兩種化合物在測試濃度下對MS-1和REN細胞沒有顯著影響(數據未顯示)。
用流式細胞術檢測經小分子化合物FN1-5和FN1-8處理的間皮瘤細胞系211H的凋亡。用30μM FN1-5(37.5％；表2)或30μM FN1-8(30.7％；表3)處理3天后，觀察到間皮瘤細胞系211H顯著凋亡。
下一步，檢測不同小分子化合物對由組織樣品新鮮制備的原代培養的人間皮瘤細胞的影響。如本文所述將原代培養物接種于6孔板，用50和100μM各化合物(FN1-5、FN1-7、FN1-8和FN3-5；母液溶解于DMSO，30mM)培育3天。觀察到FN1-5和FN1-8的顯著細胞殺傷作用。再一次，在相同劑量下，小分子化合物FN1-8殺傷此原代培養物的效力高于FN1-5。沒有發現化合物FN1-7和FN3-5的顯著細胞殺傷作用(圖8)。
下一步，用不同劑量(10μM、30μM和50μM)的小分子化合物FN1-5處理由組織樣品新鮮制備的原代培養的人間皮瘤細胞3天后，用流式細胞術檢測凋亡。在中等劑量(30和50μM)的FN1-5和FN1-8(分別見表2和3)下，觀察到凋亡增加。與圖8所示染色結果相一致，在相同劑量下FN1-8的凋亡誘導效力高于FN1-5(表2和3)。
也用10、30、50和100μM化合物FN1-9U和FN1-9S培育間皮瘤細胞系MS-1。雖然用100μM FN1-9U觀察到一些細胞殺傷作用，用FN1-9S沒有觀察到細胞殺傷作用或凋亡(數據未顯示)。
實施例12小分子化合物FN1-5和FN1-8對人前列腺癌細胞系LnCAF的影響 采用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人前列腺癌細胞系LnCAP的影響。30和50μM FN1-5處理后以及10、30和50μM FN1-8處理后分析LnCAP細胞活力。在50μM FN1-8時觀察到顯著的細胞殺傷作用(數據未顯示)。觀察到FN1-5的細胞殺傷作用小得多(數據未顯示)。
也利用流式細胞術檢測小分子化合物FN1-5和FN1-8在LnCAP細胞中誘導的凋亡。用10、30和50μM FN1-8或者30和50μM FN1-5處理3天后，觀察到LnCAP細胞顯著凋亡(表2和3)。例如，在50μM FN1-8時觀察到約42％凋亡細胞。這些結果與上述細胞毒性試驗的結果相一致。再一次，發現相同濃度下FN1-8的效力高于FN1-5。
實施例13小分子化合物FN1-5和FN1-8對人胰腺癌細胞系的影響 利用本文所述細胞毒性試驗測定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人胰腺癌細胞系L3.6sl、Panc4.21、BxPC3和CFPAC-1的影響。分析經10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細胞的活力。觀察到50μM FN1-5或FN1-8對所有分析的人胰腺癌細胞系有顯著的細胞殺傷作用(數據未顯示)。然而，與另外三種胰腺癌細胞系相比，FN1-5在Panc4.21中介導的細胞殺傷作用較低。
也利用流式細胞術檢測小分子化合物FN1-5和FN1-8在人胰腺癌細胞系L3.6sl、Panc4.21、BxPC3和CFPAC-1細胞中誘導的凋亡。用10、30和50μM FN1-8或者30和50μM FN1-5處理3天后，在除Panc4.21以外的所有分析的人胰腺癌細胞系中觀察到顯著凋亡，在Panc4.21中FN1-5似乎無法誘導凋亡(表2和3)。例如，在50μM FN1-5和50μM FN1-8下觀察到約45％凋亡細胞。這些結果與上述細胞毒試驗的結果相一致。而FN1-5和FN1-8在L3.6sl誘導的凋亡程度相似，相同濃度下FN1-5在CFPAC-1細胞中誘導凋亡的效力略高，FN1-8在Panc4.21和BxPC3細胞中誘導凋亡反應的效力高于FN1-5(表2和3)。
實施例14小分子化合物FN1-5和FN1-8對人乳腺癌細胞系MCF-7的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人乳腺癌細胞系MCF-7的影響。用30和50μM FN1-5處理后，以及用10、30和50μM FN1-8處理后，分析MCF-7細胞的活力。在50μM FN1-8和50μM FN1-5時觀察到顯著的細胞殺傷作用(數據未顯示)。在此試驗中，FN1-8的效力高于FN1-5。
實施例15小分子化合物FN1-5和FN1-8對人卵巢癌細胞系AZ23247的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人卵巢癌細胞系AZ23247的影響。用10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后，分析AZ23247細胞活力。用30μM和50μM的這兩種化合物觀察到顯著的細胞殺傷作用(數據未顯示)。
實施例16小分子化合物FN1-5和FN1-8對人腎細胞癌細胞系的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人腎細胞癌細胞系786-O、Caki和OMRC3的影響。分析經10、30和50μMFN1-5或FN1-8處理后這些細胞的活力。在所有分析的人腎細胞癌細胞系中觀察到50μM FN1-8和50μM FN1-5的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。在此試驗中FN1-8的效力高于FN1-5。
實施例17小分子化合物FN1-5和FN1-8對人食道癌細胞系的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人食道癌細胞系SEG-1、TE-7、BIC-1和OE21的影響。分析經10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細胞的活力。在所有分析的人食道細胞中觀察到50μM FN1-8和50μM FN1-5的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。在此試驗中FN1-8的效力高于FN1-5。
通過半定量RT-PCR檢測人食道癌細胞系SEG-I、TE-7、BIC-I和OE21中Hh信號轉導的激活。在這些細胞系中發現Hh途徑，包括Ptch 1、Gli1、Gli2和Gli3的表達被激活(數據未顯示)。
實施例18小分子化合物FN1-5和FN1-8對人胃癌細胞系的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人胃癌細胞系NUGC3、MNK28和AGS的影響。分析經10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細胞的活力。在所有分析的人胃細胞中觀察到50μMFN1-8和50μM FN1-5的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。在此試驗中FN1-8的效力高于FN1-5。
實施例19小分子化合物FN1-5和FN1-8對人肉瘤細胞系的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人肉瘤細胞系MG63和MNNG的影響。分析經10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細胞的活力。在所有分析的肉瘤細胞中觀察到50μM FN1-8的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。在這些肉瘤細胞系中沒有觀察到FN1-5的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。
實施例20小分子化合物FN1-5和FN1-8對人肝細胞癌細胞系的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人肝細胞癌細胞系HEPG2和SK-Hep-1的影響。分析經10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細胞的活力。在所有分析的人胃細胞中觀察到50μMFN1-8和50μM FN1-5的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。在此試驗中FN1-8的效力高于FN1-5。
實施例21小分子化合物FN1-5和FN1-8對人鼻咽癌細胞系的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人鼻咽癌細胞系HNE1和HONE1的影響。分析經10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細胞的活力。在所有分析的人胃細胞中觀察到50μMFN1-8和50μM FN1-5的顯著細胞殺傷作用(數據未顯示)。在此試驗中FN1-8的效力高于FN1-5。
實施例22小分子化合物FN1-5和FN1-8對人膠質瘤細胞系U87的影響 利用本文所述的細胞毒性試驗確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對人膠質瘤細胞系U87的影響。分析經30和50μM FN1-5或10、30和50μMFN1-8處理后U87細胞的活力。觀察到50μM FN1-8的顯著細胞殺傷作用，用50μM FN1-5獲得的程度較低(數據未顯示)。
實施例23小分子化合物對正常人肌肉細胞的影響 在正常人肌肉細胞中檢測不同劑量的小分子化合物FN1-8、FN1-7和FN1-5的細胞殺傷作用。結構與另外兩種化合物相似、但在所測試的癌細胞系中細胞毒性不高的FN1-7用作陰性對照。將正常肌肉細胞接種于6孔板中，用1、10、30和50μM各化合物培育3天(與本文所述其它相似實驗的方式相同)。在所有劑量的所有化合物中，都沒有觀察到顯著的細胞殺傷作用，這表明FN1-5和FN1-8對正常肌肉細胞無毒性。FN1-5和FN1-8似乎能特異性殺傷癌細胞。
此外，用不同劑量的FN1-5或FN1-8處理正常人肌肉細胞后，用流式細胞術檢測凋亡誘導。將正常肌肉細胞接種于6孔板，用1、10、30和50μM各化合物培育3天，如上所述。與DMSO對照相比，用所有劑量的這兩種化合物處理后，凋亡細胞數沒有顯著差異，進一步說明FN1-5和FN1-8對正常肌肉細胞均無毒性(表2和3)。這一結果也表明，FN1-5和FN1-8能特異性誘導癌細胞凋亡。
實施例24小分子化合物FN1-5和FN1-8對正常人腎細胞的影響 檢測了不同劑量的小分子化合物FN1-5和FN1-8對正常人腎細胞的細胞殺傷作用。將正常腎細胞接種于6孔板，用30和50μM化合物FN1-5以及10、30和50μM FN1-8培育3天(與本文所述其它相似實驗的方式相同)。在所有劑量的所有化合物中，都沒有觀察到顯著的細胞殺傷作用，這表明FN1-5和FN1-8對正常腎細胞無毒性(數據未顯示)。
此外，用不同劑量的FN1-5(30和50μM)或FN1-8(10、30和50μM)處理正常人腎細胞后，用流式細胞術檢測凋亡誘導。與DMSO對照相比，用所有劑量的這兩種化合物處理后，凋亡細胞數沒有顯著差異，進一步說明FN1-5和FN1-8對正常腎細胞均無毒性(表2和3)。
實施例25小分子FN1-5的凋亡誘導作用小結 下表小結了用所示濃度的小分子化合物FN1-5處理后觀察到的凋亡細胞百分率。如本文所述進行實驗。N.d.，未進行。
表2用小分子化合物FN1-5誘導細胞凋亡 實施例26小分子FN1-8的凋亡誘導作用小結 下表小結了用所示濃度的小分子化合物FN1-8處理后觀察到的凋亡細胞百分率。如本文所述進行實驗。N.d.，未進行。
表3用小分子化合物FN1-8誘導細胞凋亡 實施例27小分子在NSCLC細胞系A549中調節Wnt2啟動子活性 為了檢測本發明小分子化合物的特異性，檢測該化合物調節Gli下游靶基因表達的能力。Gli激活后能激活下游Wnt信號轉導，Hh/Gli信號轉導能調節Wnt基因表達。克隆人Wnt2啟動子后發現在其啟動子區中含有推定的Gli-DNA結合位點(數據未顯示)。因此，用幾種本發明小分子化合物處理NSCLC細胞系A549(表達Wnt2)后，測定Wnt2啟動子-熒光素酶報道活性。用30μM處理18-24小時后，FN1-5和FN1-8均能顯著下調Wnt2啟動子活性(圖9)。沒有類似于FN1-5和FN1-8的強效細胞殺傷作用的小分子化合物對Wnt2啟動子活性的下調影響較低或無影響(圖9)。此結果與細胞毒性和凋亡分析相一致，強烈表明FN1-5和FN1-8均能通過抑制Wnt2表達的Gli轉錄來誘導凋亡。
實施例28小分子化合物FN1-5和FN1-8能調節癌細胞的Hedgehog途徑 為了進一步檢測本發明小分子化合物的作用機制，在NSCLC細胞系H460和A549中檢測化合物FN1-5和FN1-8對Hedgehog(Hh)信號傳導途徑的影響。用30μM各化合物(FN1-5或FN1-8)培育H460和A549細胞2天，然后分離全部RNA，用于半定量RT-PCR分析。發現Hh途徑的關鍵組件和直接靶基因(如Ptch1和GH1)被下調(數據未顯示)。GAPDH用作對照。
與上述內容相似地，利用Wnt2啟動子-熒光素酶報道活性試驗發現FN1-8處理后Wnt2表達也下調(數據未顯示)。這些結果表明，小分子化合物FN1-5和FN1-8可能是Hh和Wnt途徑的雙抑制劑。此外，似乎FN1-8對這兩條途徑的抑制作用高于FN1-5，這與這些細胞系的凋亡分析相一致(數據未顯示)。
如半定量RT-PCR所示，小分子化合物FN1-5和FN1-8也可調節黑色素瘤細胞系LOX、結腸癌細胞系SW480和由組織新鮮制備的原代培養的人間皮瘤細胞的hedgehog途徑(數據未顯示)。令人感興趣的是，在HT29細胞中沒有觀察到顯著改變(數據未顯示)。
實施例29小分子化合物FN1-8在黑色素瘤細胞中能下調GLI1-誘導的轉錄 為了進一步檢測小分子化合物FN1-8的特異性，具體說，在不存在和存在小分子化合物FN1-8的情況下檢測GLI-依賴性轉錄，以測定FN1-8調節Hh/Gli信號傳導途徑的作用。具體說，利用連接熒光素酶報道基因的6個GLI-結合位點重復單元(6xGLI BS；Sasaki等，Development 124(7)1313-22(1997))作為GLI依賴性轉錄替代測定的質粒表達構建物來檢測將FN1-8給予幾種黑色素瘤細胞系后的6xGLI BS-熒光素酶活性，所述黑色素瘤細胞系包括Malme-3M(圖15A)、A375(圖15B)、SK-Mel-2(圖15C)和SK-Mel-5(圖15D)。在所有測試的4種黑色素瘤細胞系中，共同表達GLI1(將本文所述的Gli1表達質粒轉染到黑色素瘤細胞中)能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(圖15A-D，＂Gli+DMSO＂柱)。這驗證了，過度表達(即外源性加入)的GLI1能特異性結合GLI-結合位點，并且功能性誘導熒光素酶報道基因的轉錄。將不表達GLI1的對照載體也轉染到這些黑色素瘤細胞中，但不會產生高水平的熒光素酶活性(圖15A-D，＂對照載體+DMSO＂柱)。20μMFN1-8處理16-20小時后，觀察到熒光素酶活性水平顯著降低(圖15A-D，＂Gli+20μM FN1-8＂柱)。因此，小分子化合物FN1-8能顯著降低這些黑色素瘤細胞中GLI1誘導的轉錄。此結果表明，FN1-8是GLI依賴性轉錄的抑制劑。這一發現也提供了抑制細胞中GLI依賴性轉錄的方法。
實施例30小分子化合物FN1-5和FN1-8能下調胰腺癌細胞中GLI1-和GLI2-誘導的轉錄 為了進一步檢測小分子化合物FN1-5和FN1-8抑制Hh/Gli信號傳導途徑的特異性，也測定了不存在和存在這些化合物時胰腺癌細胞中的GLI依賴性轉錄。具體說，利用實施例29所述的(6xGli BS)熒光素酶報道基因構建物測定單獨GLI1(將本文所述的Gli1表達質粒轉染到Panc4.21細胞中)或單獨GLI2(將本文所述的Gli2表達質粒轉染到Panc4.21細胞中)的6xGLIBS-熒光素酶過度表達能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(數據未顯示)。這驗證了過度表達(即外源性加入)的GLI1或GLI2多肽能特異性結合GLI-結合位點，并且功能性誘導熒光素酶報道基因的轉錄。將不表達Gli1或Gli2或Gli3表達載體的對照載體轉染到這些胰腺癌細胞中時，不會產生高水平的熒光素酶活性(數據未顯示)。Gli3表達不導致熒光素酶活性升高的事實可能是由于GLI3中同時存在激活物和阻抑物結構域。
20μM FN1-5或FN1-8處理16-20小時后，觀察到熒光素酶活性水平顯著降低(數據未顯示)。因此，小分子化合物FN1-5和FN1-8能顯著降低胰腺癌細胞中GLI1-和GLI2-誘導的轉錄。這些結果表明，FN1-5和FN1-8可用作GLI1-和GLI2-依賴性轉錄的抑制劑。這一發現也提供了抑制細胞中GLI1-和GLI2-依賴性轉錄的方法。
在單獨實驗中，發現共同轉染TAFII31表達質粒與GLI1或GlLI2表達質粒也能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(數據未顯示)。加入FN1-5或FN1-8(20μM，16-20小時)后，6xGLI BS-熒光素酶活性顯著降低(數據未顯示)。TAFII31表達質粒含有通過PCR克隆到含有c-Myc標簽的哺乳動物表達載體(pCDNA3.1(-)B)的EcoRI(5′)和BamHI(3′)位點中產生的全長TAFII31 cDNA。TAFII31的序列對應于GenBank登錄號U25112。
實施例31用小分子化合物調節結腸癌細胞系HCT116和SW480中的TOP/FOP活性 作為本發明小分子化合物的另一個特異性檢測，使用TOP/FOP實驗測試了小分子化合物FN1-5、FN1-7、FN1-8、FN1-9U、FN1-9S、FN2-1和FN3-5可否調節經典Wnt信號轉導的轉錄活性。在這些實驗中，使用通過TOP/FOP實驗測定具有高TCF轉錄活性的結腸癌細胞系。圖10顯示了HCT116細胞的結果。用30μM處理18-24小時后，發現FN1-5和FN1-8能顯著下調TOP/FOP活性。使用不誘導顯著細胞殺傷作用的化合物在此試驗中觀察到沒有顯著下調。此結果也與細胞毒性、凋亡和Wnt2啟動子活性分析相一致，表明FN1-5和FN1-8能通過抑制Wnt2表達的Gli轉錄誘導凋亡，進而抑制Wnt信號轉導依賴性轉錄。
也分析了上述相同化合物在結腸癌細胞系SW480中調節TOP/FOP活性的概況。雖然化合物FN1-5對此細胞系的影響較小，但與HCT116細胞中降低約36％相比，小分子化合物FN1-8在SW480細胞中使TOP/FOP活性降低了約32％(數據未顯示)(見圖10)。
實施例32由小分子化合物調節SOCS-3和Gremlin啟動子活性 作為本發明小分子化合物的第三個特異性檢測，分析了這些化合物調節非Gli激活下游靶點的基因表達的能力。選擇JAK/STAT途徑的抑制劑和下游靶基因SOCS3進行此實驗。SOCS3的表達不受Gli和/或Wnt活化的控制。而且，在Jablons博士實驗室(加州大學舊金山分校；數據未顯示)克隆的人SOCS3啟動子中沒有發現GLI和TCF結合位點。因此，用小分子化合物FN1-5、FN1-7、FN1-8和FN1-9U處理NSCLC細胞系A549后測定SOCS3啟動子-熒光素酶報道活性。30μM處理18-24小時后，發現FN1-5和FN1-8都不能調節SOCS3啟動子活性，類似于沒有細胞殺傷作用的其它化合物(如FN1-7和FN1-9U；圖11)。此結果表明，FN1-5和FN1-8是抑制GLI轉錄活性的特異性小分子抑制劑。
作為本發明小分子化合物的第四個特異性檢測，檢測了化合物FN1-5和FN1-8調節非Gli激活下游靶點的另一基因表達的能力。選擇BMP和TGF-β信號轉導的抑制劑Gremlin進行此實驗。Gremlin表達不受Gli和/或Wnt激活的控制。因此，用化合物FN1-5、FN1-8或DMSO(對照)或空載體(對照)處理HEK293T細胞后，檢測了人Gremlin啟動子-熒光素酶報道物的活性。30μM處理18-24小時后，發現FN1-5和FN1-8都不能調節Gremlin啟動子活性(數據未顯示)。此結果也表明，FN1-5和FN1-8是抑制GLI轉錄活性的特異性小分子抑制劑。人Gremlin在Jablons博士實驗室(加州大學舊金山分校；數據未顯示)進行克隆。
實施例33GLI信號轉導的小分子化合物抑制劑能抑制結腸癌細胞、NSCLC細胞和黑色素瘤細胞中的經典Wnt信號轉導 為了檢測本發明小分子化合物能否用作GLI3激活域的小分子抑制劑并抑制經典的Wnt信號轉導，用30μM的小分子化合物FN-15和FN1-8以及DMSO(對照)處理2天后，用Western印跡法分析結腸癌細胞SW480、HT29和CaCO2中經典Wnt信號轉導關鍵組件(如Dvl-3和胞漿β-聯蛋白)，β-肌動蛋白用作加樣對照。與凋亡誘導結果一致，用化合物處理后觀察到這些細胞中Dvl-3和胞漿β聯蛋白顯著下調(圖12)。存活素、凋亡抑制蛋白和Wnt下游靶基因(Kim等，2003)也下調(圖12)。令人感興趣的是，注意到在HT29細胞中，FN1-8處理后沒有觀察到Dvl-3和胞漿β-聯蛋白的下調，這與HT29細胞活力不受FN1-8化合物影響的結果相一致。
為了檢測本發明小分子化合物能否用作GLI3激活域的小分子抑制劑并抑制經典Wnt信號轉導，用30μM的小分子化合物FN-15和FN1-8以及DMSO(對照)處理2天后，用Western印跡法分析NSCLC細胞H460、A549和H838中經典Wnt信號轉導關鍵組件(如Dvl-3和胞漿β-聯蛋白)，β-肌動蛋白用作加樣對照。與凋亡誘導結果一致，用化合物處理后觀察到這些細胞中Dvl-3和胞漿β聯蛋白顯著下調(圖13)。存活素，一種凋亡抑制蛋白和Wnt下游靶基因(Kim等，2003)也下調(圖13)。
在另一實驗中，我們使用Western印跡分析檢測小分子化合物FN1-8能否通過抑制Wnt經典途徑抑制黑色素瘤細胞生長(見上)。用DMSO(對照)、10μM或20μM FN1-8處理后，由兩種黑色素瘤細胞系A375和SK-Mel-5以及人正常皮膚成纖維細胞(Malme-3)分離胞漿蛋白。β-肌動蛋白用作對照。這些實驗證明，用FN1-8處理后，黑色素瘤細胞中經典Wnt激活途徑的關鍵指標之一，即胞漿β-聯蛋白水平下調(數據未顯示)。然而，沒有觀察到人正常皮膚成纖維細胞中胞漿β-聯蛋白水平的顯著改變(數據未顯示)。這些結果表明，本發明小分子化合物如FN1-8能特異性抑制黑色素瘤細胞生長并通過抑制經典Wnt途徑誘導這些癌細胞凋亡。如本文所述，這些結果進一步提示，FN1-8是Hh和Wnt信號傳導途徑的雙抑制劑。
實施例34GLI2的過度表達能拯救用小分子化合物抑制劑FN1-5和FN1-8處理的結腸癌細胞系SW480 如本文所述，GLI3似乎能激活Gli1和Gli2基因的轉錄。因此，本發明小分子化合物抑制GLI3活性也應抑制GLI1和/或GLI2的信號轉導。如果是這樣，那么將GLI1和/或GLI2表達構建物轉染到用本發明小分子化合物處理的細胞中應能夠至少部分地拯救該小分子化合物介導的凋亡作用。因此，為了進一步檢測小分子化合物FN1-5的特異性以及其抑制機制，檢測了過度表達GLI2蛋白可否減輕FN1-5的細胞殺傷作用。在此實驗中，用空pCDNA3載體或Gli2 cDNA表達構建物轉染結腸癌細胞系SW480。選擇后，將相同數量的轉染細胞再次接種于6孔板，然后將FN1-5加入培養基中，終濃度為50μM。5天后，發現FN1-5殺傷的Gli2轉染細胞少于空載體轉染細胞(數據未顯示)。這一結果表明，FN1-5通過抑制GLI3轉錄激活功殺傷癌細胞。
為了進一步研究小分子化合物FN1-8的特異性以及其抑制機制，我們檢測了過度表達GLI2蛋白可否減輕FN1-8的細胞殺傷作用。如上所述進行轉染實驗。5天后，用流式細胞術進行凋亡分析以定量測定該實驗。發現與用Gli2表達構建物轉染的SW480細胞(27.7％)相比，用空載體轉染的SW480細胞(48.1％)中凋亡細胞明顯更多。此結果也表明，FN1-8通過抑制GLI3轉錄激活功誘導癌細胞凋亡。
為了驗證GLI2過度表達能降低FN1-5和FN1-8在結腸癌細胞SW480中的凋亡誘導能力的結果，進行Western印跡分析以檢測經典Wnt信號轉導關鍵組件(胞漿β-聯蛋白)、其下游靶點(存活素)和凋亡途徑中一些關鍵因子(用作凋亡正向調節物的細胞色素c和活性PARP(切割形式)；用作凋亡抑制物的存活素)的表達。β-肌動蛋白用作加樣對照。所得結果與上述凋亡的流式細胞術分析相一致(數據未顯示)。這些數據進一步支持了FN1-5和FN1-8均可通過抑制GLI3轉錄激活功能誘導一些癌細胞凋亡的其它數據。
為了驗證Gli2過度表達能通過再次激活Hh信號傳導途徑降低FN1-5和FN1-8在結腸癌細胞中的凋亡誘導能力的結果，利用半定量RT-PCR分析Hh信號轉導關鍵組件和其下游靶點(Shh、Ptch1、Gli1、Gli3)。GAPDH用作對照。已發現該結果與上述凋亡的流式細胞術分析相一致(數據未顯示)。
實施例35小分子化合物抑制GLI多肽和TAF蛋白之間的蛋白質相互作用導致抑制GLI-TAF誘導的轉錄活性 另外，如上所述，檢測了本發明化合物抑制GLI活性的特異性，并測定這些化合物能否阻斷GLI和TAFII31之間的相互作用。具體說，在此分析中，用化合物FN1-8處理NSCLC A549細胞后，利用將6個GLI-結合位點重復(6xGLI BS)連接于熒光素酶報道基因作為GLI依賴性轉錄替代測定的表達構建物來檢測6xGLI BS-熒光素酶活性。該實驗結果表明，單獨GLI1或GLI2過度表達能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(圖16)。共同表達TAFII31與GLI1或GLI2能將6xGLI BS-熒光素酶活性進一步提高，其水平顯著高于單獨的GLI1或GLI2，而單獨TAFII31的過度表達沒有任何影響(圖16)。此發現再次確認，GLI1和GLI2均能特異性結合GLI-結合位點，在轉錄中有功能活性。此結果還說明，TAFII31可能作為輔助激活物與GLI蛋白相互作用。用20μM FN1-8處理A549細胞16-20小時后，單獨GLI和GLI/TAFII31誘導的6xGLI BS-熒光素酶轉錄降低。感興趣的是，雖然單獨GLI的轉錄活性降低約30％，用TAFII31與GLI2共同轉染時A549細胞的轉錄活性降低約50％，用TAFII31與GLI1共同轉染時轉錄活性降低約70％。此結果表明，FN1-8可能是GLI蛋白和TAFII31相互作用的特異性抑制劑。
在共免疫沉淀實驗中，已證明小分子化合物FN1-8能阻斷GLI蛋白的TAF結合域與TAFII31蛋白之間的蛋白質相互作用(圖23)。具體到此實驗來說，由基因美得合成公司(Genemed Synthesis，Inc)定制合成GLI蛋白GLI1、GLI2和GLI3的生物素化TAF結合域(見下)。GLI-TAF結合域(GLI-TAFbd)肽序列如下 GLI1-TAFbd(NH2)-LDSLDLDNTQLDFVAILDEPQG-(COOH)； GLI2-TAFbd(NH2)-VDSQLLEAPQIDFDAIMDDGDH-(COOH)；和 G1LI-TAFbd(NH2)-LDSHDLEGVQIDFDAIIDDGDH-(COOH) 按照生產商方案利用TNT快速偶聯轉錄/翻譯系統(普洛麥格公司(Promega))制備TAFII31蛋白。克隆到(c-myc-標簽)pCDNA3.1表達載體中的全長TAFII31 cDNA插入物用作此體外翻譯系統的模板。空(c-myc標簽)pCDNA3.1表達載體用作對照。在存在或不存在小分子化合物FN1-8(20μM和50μM)的情況下用TAFII31蛋白培育生物素化GLI肽(即三種不同GLI蛋白的TAF結合域)。然后，用鏈霉親和素瓊脂糖沉淀生物素化GLI-肽-TAFII31復合物，然后用抗c-myc抗體(A-14；圣克魯斯生物技術公司(SantaCruz Biotech，Inc.)；Cao等，2001，Science 293115-120)進行免疫印跡。在此實驗中發現，加入50μM FN1-8能減少GLI-肽-TAFII31復合物的形成(圖23)。具體說，似乎FN1-8阻斷TAFII31與GLI3和GLI1的TAF結合域的蛋白質相互作用的效力高于阻斷TAFII31與GLI2的TAF結合域的蛋白質相互作用的效力(圖23)。作為對照，(c-myc-標簽)pCDNA3.1空表達載體用于體外翻譯系統時，所有三種GLI肽都沒有拉下(pull-down)TAFII31(圖23)。
總之，這些數據表明小分子化合物FN1-8能阻斷GLI蛋白(更優選GLI1和GLI3)的TAF結合域與TAFII31蛋白之間的蛋白質相互作用，與上述GLI/TAFII31依賴性轉錄報道實驗相一致。也可利用此種GLI-肽/TAFII31蛋白-蛋白相互作用實驗篩選抑制GLI蛋白(或上述GLI肽)之間的蛋白質相互作用的物質。在這一方法中，如上所述，用GLI蛋白(或GLI肽)和TAFII31蛋白培育準備確認或篩選的物質。
實施例36小分子化合物FN1-8抑制腫瘤體內生長(小鼠異種移植瘤模型NSCLC H460) 用小鼠異種移植瘤模型(NSCLC H460)進行小分子化合物FN1-8的體內效力研究。在小鼠背部區域皮下注射體積100μl的3 x 106個細胞。(圖17，箭頭)。接種7天后，小鼠開始接受每日劑量50毫克/千克體重的FN1-8治療，共2 x 6天(n＝6)。單獨的DMSO用作對照(n＝7)。將FN1-8和DMSO調整為40μl體積，向小鼠腹腔進行腹膜內注射。圖18A的箭頭表明每次注射的時間點。用游標卡尺每三天測定一次腫瘤大小(根據其形狀確定的長度和寬度)。用等式x2y計算腫瘤體積(其中x<y)。如圖17和18所示，用小分子化合物FN1-8治療后腫瘤生長被顯著抑制。
初次接種腫瘤并進行上述治療3周后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。用FN1-8化合物治療后瘤重顯著降低(圖18B和18C)。
實施例37小分子化合物FN1-8抑制腫瘤體內生長(小鼠異種移植瘤模型；黑色素瘤LOX) 利用小鼠異種移植瘤模型(黑色素瘤Lox)進行小分子化合物FN1-8的體內功效研究。在小鼠背部區域皮下注射體積100μl的3 x 106個細胞。圖17，箭頭)。接種7天后，小鼠開始接受每日劑量50毫克/千克體重的FN1-8治療，共2 x 6天(n＝9)。單獨的DMSO用作對照(n＝10)。將FN1-8和DMSO調整為40μl體積，向小鼠腹腔進行腹膜內注射。圖19A的箭頭表明每次注射的時間點。如上所述計算腫瘤大小和腫瘤體積。如圖17和19所示，用小分子化合物FN1-8治療后腫瘤生長被顯著抑制。
初次接種腫瘤并進行上述治療3周后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。用FN1-8化合物治療后瘤重顯著降低(圖19B和19C)。
在小鼠異種移植瘤模型(NSCLC H460)中，利用較低劑量的化合物重復小分子化合物FN1-5和FN1-8的體內功效研究。如上所述對小鼠進行注射。接種9天后，小鼠開始接受每日劑量15毫克/千克體重的化合物治療，共2x 6天(n＝7)。單獨的DMSO用作對照(n＝7)。將FN1-8和DMSO調整為50μl體積，向小鼠腹腔進行腹膜內注射。初次接種腫瘤24天后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。用小分子化合物FN1-8治療后瘤重降低(數據未顯示)。然而，用低劑量化合物FN1-5治療的小鼠的瘤重與DMSO對照組相似。此低劑量體內結果與本文所示的體外數據相一致。
實施例38小分子化合物FN1-8不影響腫瘤體內生長(小鼠異種移植瘤模型結腸癌HT29) 也利用陰性小鼠異種移植瘤模型(結腸癌HT29)進行小分子化合物FN1-8的體內功效研究。在小鼠背部區域皮下注射體積100μl的3 x 106個細胞。接種7天后，小鼠開始接受每日劑量50毫克/千克體重的FN1-8治療，共2 x 6天(n＝2)。單獨的DMSO用作對照(n＝4)。將FN1-8和DMSO調整為40μl體積，向小鼠腹腔進行腹膜內注射。圖20A的箭頭表明每次注射的時間點。每三天用游標卡尺測定腫瘤大小。用等式x2y計算腫瘤體積(其中x<y)。如圖16A所示，小分子化合物FN1-8治療后沒有影響腫瘤生長。此結果與顯示FN1-8對HT29細胞的GLI3活化無影響且沒有Gli3 RT-PCR產物的體外數據(參見如圖12，數據未顯示)相一致。FN1-8治療后的瘤重類似于DMSO對照組(圖20B)。結果表示為平均值±SD(誤差線)。
在單獨實驗中，接種7天后，小鼠開始接受每日劑量15毫克/千克體重的FN1-8或FN1-5治療，共2 x 6天(n＝7)，然后進行另一輪每日劑量30毫克/千克體重的治療，共1 x 6天。單獨的DMSO用作對照(n＝7)。將化合物和DMSO調整為50μl體積，向小鼠腹腔進行腹膜內注射。初次接種腫瘤43天后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。發現FN1-8治療后HT29瘤重與DMSO對照組相似(數據未顯示)。還發現FN1-5治療略微降低了瘤重(數據未顯示)。這些結果與FN1-5、而非FN1-8能在結腸癌細胞系HT29中誘導細胞殺傷作用和凋亡的HT29細胞體外數據(見實施例7)相一致。
實施例39小分子化合物FN1-8能抑制腫瘤體內生長(小鼠異種移植瘤模型NSCLC A549 利用小鼠異種移植瘤模型(NSCLC A549)進行小分子化合物FN1-8的體內功效研究。在小鼠背部區域皮下注射體積100μl的3 x 106個細胞。接種10天后，小鼠開始接受每日劑量15毫克/千克體重的小分子化合物FN1-8治療，共2 x 6天(n＝5)，然后進行另一輪每日劑量30毫克/千克體重的治療，共1x6天。單獨的DMSO用作對照(n＝5)。將FN1-8和DMSO調整為50μl體積，向小鼠腹腔進行腹膜內注射。初次接種腫瘤43天后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。與DMSO對照組相比，FN1-8化合物治療后瘤重降低(數據未顯示)。此低劑量體內結果與本文所示的體外數據相一致。
實施例40小分子化合物FN1-8在體內對腫瘤Hedgehog途徑的影響 為了檢測前導化合物FN1-8是否通過抑制Hedgehog信號傳導途徑在體內抑制腫瘤生長，用分離自異種移植瘤的總RNA通過半定量RT-PCR分析Hh途徑的關鍵組件和直接靶基因(如Shh、Ptch1、Gli1、Gli2、Gli3、Dvl-3)的表達。GAPDH用作對照。用各組中帶有適當大小腫瘤的兩只隨機選擇的小鼠的腫瘤“集合”進行此RT-PCR分析。發現在NSCLC腫瘤(H460)中Hh信號轉導被FN1-8抑制(數據未顯示)。然而，觀察到FN1-8體內治療后陰性對照HT29腫瘤中Hh信號轉導未發生顯著改變。這些結果與體外結果相一致(參見例如表2和3，誘導H460和HT29細胞凋亡)，這表明小分子化合物FN1-8可通過抑制Hh途徑特異性抑制體內腫瘤生長。
實施例41小分子化合物FN1-8在體內對腫瘤的經典Wnt途徑的影響 為了檢測前導化合物FN1-8能否通過抑制Wnt信號傳導途徑在體內抑制腫瘤生長，用Western印跡分析了分離自H460和HT29異種移植瘤的胞漿蛋白。GAPDH用作對照。用各組中帶有適當大小腫瘤的兩只隨機選擇的小鼠的腫瘤“集合”進行此Western印跡分析。發現與DMSO治療組相比，FN1-8治療的H460腫瘤中經典Wnt激活、Dvl-3和胞漿β-聯蛋白關鍵指標 的表達下調(數據未顯示)。然而，在體內用FN1-8治療后，沒有觀察到陰性對照HT29腫瘤中Dvl-3和胞漿β-聯蛋白水平發生顯著改變(數據未顯示)。
實施例42體內治療后小分子化合物FN1-8對小鼠體重的影響 作為一個FN1-8的初步體內毒性研究，檢測了FN1-8治療后小鼠體重是否降低。如前述實施例所述初次接種腫瘤并進行治療3周后，用天平稱量DMSO對照組(n＝11)和FN1-8治療組(n＝8)的體重。FN1-8治療后沒有觀察到顯著的體重損失(數據未顯示)。
實施例43小分子化合物FN1-5和FN1-8在小鼠中的藥代動力學分析 向三只小鼠的腹腔腹膜內注射30毫克/千克體重的小分子化合物FN1-5。在注射FN1-5后10分鐘、2小時，6小時和24小時，由各小鼠的尾靜脈采集血漿。用質譜測定各血漿樣品中的FN1-5濃度，見圖21A。此分析顯示，注射化合物后FN1-5在10分鐘內快速攝入到血漿中。在24小時內血清中的FN1-5濃度消失，這表明FN1-5可體內吸收。
相似地，分析了小分子化合物FN1-8的藥動學特性(圖21B)。將FN1-8與FN1-5的攝入相比，腹膜內注射后FN1-5的攝入似乎更好，提高約2倍。
在另一藥代動力學研究中，三只小鼠口服給予劑量為30毫克/千克體重的小分子化合物FN1-5。然后，如上所述，由各小鼠的尾靜脈采集血漿，用質譜測定各血漿樣品中的FN1-5濃度。結果見圖22A。此分析的結果表明，FN1-5快速攝入到血漿中(注射化合物后10分鐘內)，24小時內消失。此結果再一次表明，可將FN1-5制備成適合口服給藥以治療癌癥。
相似地，分析了口服給藥的小分子化合物FN1-8的藥代動力學特性(圖22B)。將FN1-8與FN1-5的攝入相比，口服給藥后FN1-5的攝入似乎更好，提高約7倍。
權利要求
1.一種具有下式的小分子化合物，及其鹽、水合物、溶劑合物、異構體和前藥
式中X1和X2各自獨立地是N或C，式中X1和X2之一是N，X1和X2之一是C，因此環N與X1和X2中是C的那個形成雙鍵；
R1、R2和R3各自獨立地選自用0-3個R6基團任選取代的C1-C6烷基、芳基、雜芳基、環烷基和雜環烷基，所述R6基團各自獨立地選自氫、鹵素、C1-C6烷基、-OR7、-C(O)R7、-OC(O)R7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、-N(R7)C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標m是0、1或2；
Y是直接鍵或C1-C4烷基；
Z選自C1-C4烷基、芳基和雜芳基；
R4是氫、鹵素、-OR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、NR7C(O)R7和S(O)mR7，式中下標m是0、1或2；
R5是H、C1-C6烷基，或任選與Y組合形成5-6元雜環；
R7各自獨立地是H或C1-C6烷基。
2.如權利要求1所述的小分子化合物，其特征在于，R1、R2和R3各自是芳基。
3.如權利要求2所述的小分子化合物，其特征在于，R1、R2和R3各自是苯基。
4.如權利要求2所述的小分子化合物，其特征在于，R4是羥基。
5.如權利要求4所述的小分子化合物，其特征在于，Z是C1-C4烷基。
6.如權利要求4所述的小分子化合物，其特征在于，Z是芳基。
7.如權利要求6所述的小分子化合物，其特征在于，Z是苯基。
8.如權利要求1所述的小分子化合物，其特征在于，
R1、R2和R3各自是苯基；
Y是C1-C4烷基；
Z是C1-C4烷基或苯基；和
R4是羥基。
9.如權利要求8所述的小分子化合物，其特征在于，X1是C，X2是N。
10.如權利要求9所述的小分子化合物，具有以下結構
11.如權利要求9所述的小分子化合物，具有以下結構
12.如權利要求8所述的小分子化合物，其特征在于，X1是N，X2是C。
13.如權利要求12所述的小分子化合物，具有以下結構
14.如權利要求12所述的小分子化合物，具有以下結構
15.一種藥物組合物，其包含(i)權利要求1所述的小分子化合物；和(ii)藥學上可接受的運載體。
16.一種誘導表達GLI蛋白的腫瘤細胞發生凋亡的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使所述腫瘤細胞與足量的權利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中所述接觸能誘導所述腫瘤細胞凋亡。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細胞選自結腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質瘤細胞。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述GLI蛋白是GLI1、GLI2或GLI3。
19.如權利要求16所述的方法，所述方法在體外實施。
20.如權利要求16所述的方法，所述方法在體內實施。
21.如權利要求16所述的方法，其特征在于，給予所述小分子化合物作為癌癥治療方案的一部分。
22.一種抑制細胞的不良生長、過度增殖或存活中至少一種行為的方法，所述方法包括以下步驟
(a)確定細胞是否表達Gli基因；和
(b)使所述細胞與有效量的權利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中步驟(b)導致細胞的不良生長、過度增殖或存活中的至少一種行為受到抑制。
23.一種治療存在癌性病癥的對象的方法，所述方法包括以下步驟
(a)給予所述對象治療有效量的權利要求1所述的小分子化合物；
其中所述癌性病癥的特征是表達GLI蛋白；其中步驟(a)導致所述對象得到治療。
24.一種抑制細胞中GLI蛋白活性的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使所述細胞與權利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中所述接觸導致所述細胞中GLI蛋白的活性受到抑制。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述GLI活性是GLI蛋白和TAF蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用。
26.一種抑制GLI蛋白DNA結合位點操作性連接于該基因啟動子的基因表達的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使表達所述基因的細胞與權利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中所述接觸導致所述基因的表達受到抑制。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因是Wnt2基因。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述Wnt2基因是人基因。
29.如權利要求1所述小分子化合物在制備抑制細胞的不良生長、過度增殖或存活中至少一種行為的藥物中的應用。
30.權利要求1所述小分子化合物在制備治療癌癥的藥物中的應用。
31.權利要求1所述小分子化合物在制備誘導細胞凋亡的藥物中的應用。
32.權利要求1所述小分子化合物在制備抑制細胞的GLI蛋白信號轉導的藥物中的應用。
33.一種鑒定能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白之間蛋白-蛋白相互作用的候選化合物的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使候選化合物與含有GLI蛋白和TAFII31蛋白的樣品相接觸；和
(b)確定GLI蛋白與TAFII31蛋白的結合，
其中，與不存在候選化合物時GLI蛋白與TAFII31的結合相比，在候選化合物存在下GLI蛋白與TAFII31的結合水平降低表明該候選化合物能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白之間的相互作用。
34.一種鑒定能夠調節GLI-蛋白依賴性轉錄活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使樣品與候選化合物相接觸，其中所述樣品包含具有操作性連接于報道基因的一個或多個GLI DNA結合位點的表達報道構建物；和
(b)如果有，則測定所述候選化合物對GLI蛋白依賴性轉錄活性水平的影響。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述樣品包括細胞。
全文摘要
本發明提供了診斷和治療表達GLI多肽，特別是GLI1、GLI2或GLI3多肽的癌癥的組合物、方法和試劑盒。本發明提供了模擬GLI多肽的轉錄激活域的小分子化合物。本發明的小分子抑制劑能特異性阻斷GLI多態的激活功能，而不是GLI3的阻抑功能。
文檔編號A61K31/415GK101370498SQ200680052630
公開日2009年2月18日 申請日期2006年12月8日 優先權日2005年12月9日
發明者飚 何, 藤井直明, 亮 尤, 徐志東, D·M·雅布隆斯 申請人:加利福尼亞大學董事會