用于增加的重組蛋白產生的制劑和方法
【專利說明】用于增加的重組蛋白產生的制劑和方法
[0001]相關申請
本申請要求2013年2月 26 日提交的題為“FORMULAT1NS AND METHODS FOR INCREASEDRECOMBINANT PROTEIN PRODUCT1N”(代理人案卷號 BHC125022US (BH-023/L))的美國臨時專利申請序列號61/769，402的優先權，所述申請在此出于所有目的以其整體通過引用并入本文。
[0002]背景
細胞培養系統可用于在包括營養物以促進細胞生長的細胞培養基制劑中產生重組蛋白。實例細胞培養基制劑包括DMEM/F12、RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細胞基礎培養基、L-15、頂DM、McCoy氏5A培養基和VeroPlus SFM。
[0003]在重組蛋白的生產，包括商業生產中，期望增加重組蛋白生產的水平，同時保持產物質量。
[0004]因此，需要增加重組蛋白生產而不降低產物的質量的細胞培養基制劑和方法。
[0005]概述
在一些實施方案中，提供哺乳動物細胞培養基制劑。所述制劑具有約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者。
[0006]在一個或多個實施方案中，提供在細胞培養物中產生重組蛋白的方法。所述方法包括在細胞培養基中培養表達重組蛋白的細胞，所述細胞培養基具有約3.5 g/L或更多的甘露糖和重組蛋白的穩定劑諸如約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者。在某些實施方案中，所述方法導致重組蛋白的產生的增加。在某些實施方案中，所述方法導致重組蛋白的產生的增加，而不妥協產生的重組蛋白的質量。
[0007]根據這些和其他實施方案提供許多其他方面。本文記載本教導的這些和其他特征。
[0008]附圖
技術人員會理解下文描述的附圖是僅用于說明目的。附圖不是意在以任何方式限制本教導的范圍。
[0009]圖1是說明根據多個實施方案增加細胞培養系統中的重組蛋白產生的方法的流程圖。
[0010]圖2圖示顯示根據多個實施方案甘露糖濃度從3克/升(“g/L”)增加至5 g/L使1L灌注生物反應器細胞培養中的重組人因子VIII ( “rhFVIII”)滴度增加25%。
[0011]圖3圖示顯示根據多個實施方案甘露糖濃度從3 g/L增加至5 g/L使15L灌注生物反應器細胞培養中的rhFVIII滴度增加~37%。
[0012]圖4圖示顯示表明根據多個實施方案對滾管(重復分批)實驗中5毫摩爾(“mM”)氯化鈣的測試條件的rhFVIII滴度(~19%增加)的最高影響的結果。
[0013]圖5圖示顯示根據多個實施方案鈣濃度從1 mM增加至5 mM使1L灌注生物反應器細胞培養中的rhFVIII滴度增加~27%。
[0014]圖6圖示顯示根據多個實施方案鈣濃度從1 mM增加至5 mM使15L灌注生物反應器細胞培養中的rhFVIII滴度增加~29%。
[0015]圖7A-B圖示顯示根據多個實施方案從對照培養基(含有ImM氯化鈣和3 g/L甘露糖)切換至針對兩種組分富集的培養基(含有5mM氯化鈣和5 g/L甘露糖)使rhFVIII滴度增加29%且效果是可逆的結果。
[0016]圖8A-B顯示根據多個實施方案15L灌注生物反應器活動(A)和所得效價數據(B)的設計。
[0017]圖9圖示顯示根據多個實施方案操縱細胞培養制劑的糖含量對rhFVIII的生產水平的結果，顯示使用含有甘露糖的培養基和不含甘露糖的培養基的效價的平均值。
[0018]多個實施方案的描述
如所述，增加細胞培養基制劑中培養的表達蛋白的細胞的生產水平、而不會不利影響蛋白產物質量是一種挑戰。根據本文描述的一個或多個實施方案，通過向細胞培養基提供額外的營養物諸如甘露糖和/或穩定劑諸如鈣，可以生成改善的細胞培養基制劑。在一些實施方案中，改善的細胞培養基制劑可以增加使用細胞培養基制劑培養的表達蛋白的細胞的生產水平，而對產物質量具有很少影響或沒有可檢測的影響。還提供形成和/或使用此類細胞培養基制劑的方法。
[0019]實例細胞培養基制劑
如上所述，在多個實施方案中，可以通過增加制劑中甘露糖的濃度和/或重組蛋白的穩定劑諸如鈣的濃度或兩者而實現細胞培養基制劑中重組蛋白產生的增加。
[0020]在一個方面，提供細胞培養基制劑(例如，細胞培養基組合物)，其包括約3.5 g/L或更多(或者，在某些實施方案中，約4 g/L、約5 g/L、約6 g/L或約7 g/L或更多)的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM或更多(或者，在某些實施方案中，以約2 mM、約3 mM、約4mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM或約9.5 mM或更多)范圍內的I丐中的至少一者。可以采用其他細胞培養基制劑。
[0021]在添加約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者之前，細胞培養基制劑可以是任何細胞培養基制劑。例如，在某些實施方案中，細胞培養基制劑可以包括合適比率諸如1:1的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基和Ham氏F-12營養混合物(DMEM/F12)，和約5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者。
[0022]可以采用其他細胞培養基制劑代替DMEM/F12諸如RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細胞基礎培養基、L-15JMDM、McCoy氏5A培養基和VeroPlus SFM。在某些實施方案中，所述細胞培養基制劑用于培養哺乳動物細胞。
[0023]本文提供的實例細胞培養基制劑包括但不限于:
(a)約3.5 g/L或更多的甘露糖和小于約1.5 mM或大于約9.5 mM的|丐；
(b)小于約3.5 g/L的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣；
(c)約4g/L至約5 g/L范圍內的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者；
(d)約5g/L的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者；
(e)約4g/L至約5 g/L范圍內的甘露糖和小于約1.5 mM或大于約9.5 mM的|丐；
(f)約5g/L的甘露糖和小于約1.5 mM或大于約9.5 mM的|丐；
(g)約3.5 g/L或更多的甘露糖和約2 mM至約5 mM范圍內的鈣中的至少一者； (h)約3.5 g/L或更多的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者；
(i)小于約3.5 g/L的甘露糖和約2 mM至約5 mM范圍內的鈣；
(j)小于約3.5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣；和/或
(k) 1:1比率的DMEM/F12，和約5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者。
[0024]可以采用其他制劑。
[0025]形成/使用細胞培養基制劑的方法
現在將參考下面圖1-8描述在細胞培養中產生重組蛋白的方法。
[0026]圖1說明根據本文提供的某些實施方案在細胞培養中產生重組蛋白的方法100的流程圖。參考圖1，方法100開始于方框101，其中提供表達重組蛋白的細胞。
[0027]實例表達重組蛋白的細胞可以包括，例如，任何真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、細菌細胞等。在某些實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞。實例哺乳動物細胞包括幼倉鼠腎(BHK)細胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、腎和B細胞的雜交物(HBK)細胞、人胚腎(HEK)細胞和NS0細胞。
[0028]表達重組蛋白的細胞可以是產生任何生物蛋白產物的任何細胞。例如，所述細胞可以是經工程改造以表達一種或多種重組蛋白產物的重組細胞；和/或表達抗體分子的重組細胞。
[0029]表達重組蛋白的細胞的產物可以是任何蛋白產物，包括重組蛋白產物諸如凝血因子(凝血途徑中的蛋白)，包括例如因子VI1、因子VII1、因子IX和因子X。例如，表達重組蛋白的細胞可以是表達因子VIII的哺乳動物細胞。
[0030]因子VIII可以是因子VIII的變體，諸如遺傳變體，其可以通過對rFVIII基因構建體進行遺傳變異而生成，導致，例如，B結構域缺失的因子VIII和突變的因子VIII。因子VIII變體包括，例如，表達后修飾的因子VIII的變體，諸如，例如，聚乙二醇化的FVIII和具有共價連接的聚乙二醇(PEG)的FVIII。因子VIII變體也可以包括具有共表達結合元件的融合蛋白。
[0031 ] 在某些實施方案中，表達重組蛋白的細胞的重組蛋白產物可以是糖蛋白。在一些實施方案中，重組蛋白是分泌的。可以采用用于形成表達重組蛋白的重組細胞的任何合適的來源和/或方法。
[0032]在方框102中，在細胞培養基制劑(即，組合物)中培養表達重組蛋白的細胞，所述細胞培養基制劑(即，組合物)包括約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者。如本文所使用，細胞培養基可以包括組織或細胞培養液，一種或多種組織或細胞培養基，等。
[0033]在添加約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者之前，細胞培養基制劑可以是任何細胞培養基制劑。例如，在某些實施方案中，細胞培養基制劑可以包括合適比率諸如1:1的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基和Ham氏F-12營養混合物(DMEM/F12)，和約5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者。
[0034]可以采用其他細胞培養基制劑代替DMEM/F12諸如RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細胞基礎培養基、L-15JMDM、McCoy氏5A培養基和VeroPlus SFM。在某些實施方案中，所述細胞培養基制劑用于培養哺乳動物細胞。
[0035]在多個實施方案中，細胞培養基制劑可以是基于Sigma-Aldrich Fine Chemicals(SAFC, Lenexa, Kansas)或Life Technologies (Grand Island, N.Y.)制造的市售DMEM/F12制劑且補充其他補充劑諸如鐵、普朗尼克(Pluronic) F-68或胰島素的培養基組合物，并且可以基本上不含其他蛋白。可以采用其他基礎培養基組合物。
[0036]可