專利名稱：靶向csnk2a2抗ev71、乙腦及流感病毒寡核苷酸的結構和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程藥物領域，具體地說是一種靶向酪蛋白激酶2，α原肽(CSNK2A2, casein kinase 2， alpha prime polyp印tide)治療 EV71(腸道病毒 71 型)病毒(Human enterovirus 71)。感染的反義寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、結構及其治療藥物。
背景技術：
病毒性疾病感染危害嚴重，尤其是EV71病毒、腦炎病毒、流感病毒。EV71為目前腸病毒群中最晚發現的病毒，其感染性強且致病率高，尤其是神經系統方面的并發癥。其它同屬于腸病毒群之病毒尚包括小兒麻痹病毒(Polioviruses ；具3種型別)、柯薩奇病毒(Coxsackieviruses ；A型具23種型別、B型具6種型別)、伊科病毒(Echoviruses ；具 31種型別)及腸病毒(Enteroviruses 68 72型)。腸道病毒71型(英文名為Human enterovirus 71)。簡稱EV71。1957年，新西蘭首次爆發大規模疫情并報道。1958年，首次 ^1 ^!^ '^! (Coxsackieviruses)。 1959 $，(hand—foot and mouth disease ；HFMD)的命名。人類腸病毒71型于1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的。人是腸道病毒唯一的傳染來源，人群對腸道病毒EV71 普遍易感，感染后可獲得免疫力。由于不同病原型別感染后抗體缺乏交叉保護力，因此，人群可反復感染發病。而且，該病易于傳播，容易發生流行，預防控制難度大。20世紀70年代中期，保加利亞、匈牙利等國家相繼暴發以中樞神經系統疾病為主要臨床特征的EV71型手足口病流行，并導致較高的病死率和致殘率。1997年以來，EV71感染為主的手足口病在馬來西亞、中國臺灣、新加坡等地大規模暴發流行。1998年中國臺灣發生迄今最大的一次主要為EV71型手足口病流行，共報告129106例手足口病或皰疹性咽峽炎病例，其中重癥患1405 例，死亡78例。中國內地自1981年在上海始見本病，此后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北及廣東等十幾個省市均有EV71型手足口病的發生和流行。特別值得注意的是近年來本病流行有蔓延增多趨勢。2008年3月10日至5月31日短短時間內安徽阜陽共報告手足口病7470例，共發現111例重癥病例，其中死亡23例，病死率0. 31%。目前腸病毒感染除了小兒麻痹病毒有疫苗外，其余腸病毒感染并無特殊治療藥物，故臨床上對無并發癥患者之治療只能采取支持性療法，而對有并發癥的患者也只能對癥治療，采取一些降顱壓、降溫、輔助抗病毒等的治療。目前為止抗EV71病毒的治療藥物只有利巴韋林等廣譜抗病毒藥物，但抗病毒療效一般。所以，有效的預防和控制EV71病毒的方法已成當務之急。因此研究特異性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒的藥物對治療與預防手足口病具有重要的顯示意義。流行性乙型腦炎是亞洲一種最常見的經蟲媒傳播的人畜共患的病毒性腦炎，據統計，乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)每年至少造成至少50000例臨床病例，其中多數為十歲以下兒童，導致約10000人死亡，有15000人左右留有神經精神性后遺癥。但是目前還沒有針對乙腦的特異性治療方法，接種疫苗仍是唯一最重要的控制措施， 目前臨床尚無特效的治療藥物。流感病毒感染可引起急性呼吸道傳染病。該病潛伏期短，傳染性強，傳播迅速。 甲型流感威脅最大，且易發生變異，易引起暴發流行。1918年至1920年，著名的"西班牙流感〃在全球范圍內造成了 2000萬-4000萬人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2) 所致的"亞洲流感"、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的"香港流感"、1977年由甲型流感病毒(HlNl)所致的"俄羅斯流感"、1997年以來出現的高致病性禽流感病毒(AIV， avian influenza virus)，以及2009年出現的甲型流感病毒感染，都嚴重威脅了人們的健康和正常生活。流感作為急性呼吸道傳染病嚴重威脅著人們的健康，對于兒童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其嚴重，而且也已成為社會勞動力損失、醫療負擔加重乃至社會不安定的主要原因之一。由于流感病毒變異，常規疫苗不能有效預防流感的發生和流行。過去用于治療流感的兩種較低廉的抗病毒藥物三環癸胺(amantadine)和金剛乙胺 (remantadine)對人體內流感病毒幾乎不起作用，且耐藥較為普遍。新近上市的神經氨酸酶抑制劑(例如達菲和帕納米韋)雖效果較好，但隨著臨床廣泛應用，耐藥毒株分離的報道也相繼出現。目前仍缺乏可靠的方法對流感的發生和流行進行有效的控制，有效的預防和控制流感病毒的方法已成當務之急。根據以上分析，研究特異性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒、乙腦病毒及流感病毒感染的藥物對治療與預防這些病毒感染及其相關性疾病具有重要現實意義。病毒是一種嚴格的細胞內寄生物。病毒感染致病涉及病毒與機體兩個復雜生物系統及其二者間的相互作用。一方面，宿主表現出對病毒感染的主動限制；另一方面，病毒會主動地通過對宿主細胞的生物大分子進行修飾，以使宿主細胞為它的復制、轉錄等提供必需的細胞機器。在短時間內不影響細胞存活且能為宿主細胞所能容忍的前提下，增強抗病毒信號或者阻斷病毒復制所需的宿主細胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐藥毒株產生的頻率。經研究已經證實，酪蛋白激酶2，α原肽(CSNK2A2)是抗腫瘤藥物的重要靶點之一。CSNK2A2表達過多可以促使凋亡的發生，抑制CSNK2A2的表達可以減少細胞的凋亡。目前，有報道發現CSNK2A2抑制劑有影響雄性生殖細胞的功能和抗白血病的作用，但還沒有抗EV71病毒、乙腦病毒及流感病毒感染的報道。EV71病毒、登革病毒、乙腦病毒及流感病毒感染都能夠引起細胞病變凋亡，抑制CSNK2A2的表達可以減少細胞的凋亡，因此，設想研究出抑制CSNK2A2蛋白表達的核酸藥物可能具有抗EV71病毒、乙腦病毒及流感病毒感染的作用，從而對EV71病毒、乙腦病毒及流感病毒等感染相關疾病的治療起到良好的效果。核酸藥物是一類全新的基因靶向創新藥物，長期以來一直是國際研究的熱點，特別是近幾年小核酸的發現進一步將核酸藥物的研究推向一個前所未有的發展高潮。反義寡核苷酸是一類經過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15 30個核苷酸。 通過堿基互補的原理，干擾相關基因的轉錄和翻譯，或者整個基因組的復制，其優點在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于反義寡核苷酸作用的高度特異性，因此被認為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業已將反義藥物作為其新藥研究開發的重點方向之一。

發明內容
本發明的目的在于提供一種靶向CSNK2A2阻斷EV71病毒、乙腦病毒及流感病毒復制、抑制這些病毒致病的寡核苷酸序列、結構及其藥物。本研究的內容是結合抗EV71的人的基因表達譜(表達譜編號GSE16358)和 HPRD(人蛋白相互作用網絡)，利用子網辨識的方法設計了一個含100多個節點的核心子網，然后選擇拓撲上的重要節點篩選出基因CSNK2A2。利用網上服務器Soligo設計了 5條針對CSNK2A2的反義寡核苷酸，從設計的這5條20個堿基長度的反義寡核苷酸序列中進行初步篩選。結果顯示CSNK2A2-3抑制病毒所致細胞病變作用最佳。在RD細胞系中以CSNK2A2-3 為代表進一步評價了抑制EV71病毒復制和致細胞病變的特性。而且，對CSNK2A2-3抑制乙腦病毒及流感病毒感染的作用評價結果顯示CSNK2A2-3也能劑量依賴且序列特異性地抑制乙腦病毒及流感病毒的致細胞病變作用，提示CSNK2A2-3也可發展成為治療乙腦病毒或流感病毒的新型藥物。表1反義寡核苷酸的分子設計
權利要求
1.與csnk2a2mrna互補的寡核苷酸，分布在5’非編碼區、編碼區和3’非編碼區，其長度是10-30個堿基。
2.根據權利要求1所述寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結構選自下列之1)actctctcattgttggtgat2)ttccaccacgaaggttctcc3)gtgtctttgacacggggtcc4)gtggatctaggtctatgtga5)tcggaagtgaggtttgatat6)aaggaccccgtgtcaaagacac7)aggaccccgtgtcaaagacacc8)gtctttgacacggggtcc9)gtgtctttgacacggggt10)tgtctttgacacggggtcι Dgtgtctttgacacggg12)ctttgacacggggtcc13)gtctttgacacggggt14)tgtctttgacacgggg15)tctttgacacggggtc16)gtgtctttgacacg17)ttgacacggggtcc18)tctttgacacgggg19)gtctttgacacggg20)ctttgacacggggt21)tgtctttgacacgg22)tttgacacggggtc
3.根據權利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結構選自下列之一1)gtgtctttgacacggggtcc2)gtctttgacacggggtcc3)gtgtctttgacacggggt4)tgtctttgacacggggtc5)gtctttgacacggggt
4.根據權利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結構如下 gtgtctttgacacggggtcc。
5.根據權利要3所述的寡核苷酸，其特征為所述的反義寡核苷酸包含了與 gtgtctttgacacggggtcc具有60%及其以上連續相同序列的任何長度寡核苷酸。
6.根據權利要求1-5所述寡核苷酸，其特征是該反義寡核苷酸經過不同化學修飾。
7.根據權利要求6所述寡核苷酸，其化學修飾為硫代修飾、脂肪鏈修飾。
8.權利要求1-7中所述的任一寡核苷酸或其組合在制備治療和預防EV71病毒、乙腦病毒及流感病毒感染及其相關性疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種反義寡核苷酸藥物的結構和用途。具體說是發現靶向酪蛋白激酶2，α原肽，同時具有抗腸道病毒71型、乙型腦炎病毒及流感病毒的反義寡核苷酸的結構以及這些反義寡核苷酸在制備治療EV71、乙腦病毒及流感病毒感染及其相關性疾病的藥物中的用途。
文檔編號A61P31/16GK102296066SQ20111018864
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月7日 優先權日2011年7月7日
發明者伯曉晨, 何麗娜, 劉娟, 張莉, 李康, 楊靜, 王升啟 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所