葡萄糖氧化酶基因god、利用其編碼的蛋白、轉化的巴斯德畢赤酵母及其制備
【技術領域】
[0001] 本發明屬于新基因的制備，特別是指一種葡萄糖氧化酶基因G0D、利用其編碼的蛋 白以及轉化的巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶（EC1. 1. 3. 4)是一種能夠專一的催化β-D-葡萄糖氧化為δ-D-葡 萄糖酸，并且利用分子氧作為受體產生過氧化氫的需氧脫氫酶。葡萄糖氧化酶是國家允許 使用的酶制劑之一，對人體無毒、無副用作，具有去除葡萄糖、脫氫、殺菌等功效，已被廣泛 應用于食品、紡織、化工、飼料、醫藥等行業中。
[0003] 葡萄糖氧化酶廣泛分布于動植物及微生物體內，目前用于研究及生產葡萄糖氧化 酶的主要菌株為黑曲霉（Abperrillusniger)和點青霉（Penicilliumnotatum)，這是因為 霉菌產酶能力強，易于規模化生成；但黑曲霉和青霉菌發酵生產G0D過程中，過氧化氫酶、 纖維素酶及淀粉酶等大量雜酶的存在給純化帶來相當的困難。近幾年市場對葡萄糖氧化酶 的需求量逐年增長。但我國葡萄糖氧化酶技術水平尚處于研究發展的初級階段，存在產量 低、酶活低、提純繁瑣、酶活檢測方法操作復雜等問題，使國內葡萄糖氧化酶仍以進口為主。 并且傳統以優化發酵條件提高葡萄糖氧化產量和酶活的方法，存在著精確度低、實驗次數 多、周期長、不能快速有效地提高葡萄糖氧化酶的產量和酶活的技術缺陷。
[0004] 重組葡萄糖氧化酶基因進行異源表達可有效地解決這些問題，尤其是畢赤酵母表 達外源蛋白具有表達量高、穩定性好、培養成本低和產物易分離純化等優點，適于大體積高 密度連續發酵，具有強且易控的醇氧化酶（Alcohol〇xidaSe，A0X)啟動子等優點，可嚴格控 制外源基因的表達。
[0005] 通過基因工程手段改造葡萄糖氧化酶生產菌株，獲得萄糖氧化酶準確高效的生產 和提取方法，提高產酶量，為后期的工業化生產提供了導向基礎，提高其經濟效益。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的之一在于提供一種葡萄糖氧化酶基因G0D。
[0007] 本發明的目的之二在于提供一種葡萄糖氧化酶基因GOD的制備方法。
[0008] 本發明的目的之三在于提供一種利用葡萄糖氧化酶基因G0D編碼的蛋白。
[0009] 本發明的目的之四在于提供一種利用葡萄糖氧化酶基因G0D轉化巴斯德畢赤酵 母Pichia pastoris的方法。
[0010] 本發明的整體技術構思是：
[0011] 葡萄糖氧化酶基因G0D，其基因序列為SEQIDNo. 1。
[0012] 葡萄糖氧化酶基因GOD的制備方法，是以Y端ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和 3 ^端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA為特異引物，以點青霉DNA為模板，采用PCR擴增方法 獲得。
[0013] 利用萄萄糖氧化酶基因GOD編碼的蛋白，其序列為SEQIDNo. 2。
[0014] 利用葡萄糖氧化酶基因GOD轉化的巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris，其保藏編 號為CGMCCNo. 11626。
[0015] 本發明中的巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris申請人已于2015年11月6日提交 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo. 11626,該保 藏機構的地址位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，該保藏機 構的簡稱為CGMCC。
[0016] 利用葡萄糖氧化酶基因GOD轉化的巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris的制備方 法，其制備方法中的步驟如下：
[0017]A、通過PCR方法設計引物將點青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信號肽編碼 序列去除，引物序列如下：GodF: 5 'GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCG AC3'，序列中下劃線部分為上游引物添加限制性內切酶EcoRI識別位點；G〇dR:5<GAGATG AGTTTTTGTTCTAGAGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC3 '，序列中下劃線部分為下游添加 限制性內切酶Notl識別位點；
[0018]B、PCR產物經純化回收采GIBSON連接到表達載體pMD-AOX的EcoRI和Notl位點 上，轉化到E.coliDH5a，酶切驗證篩選陽性克隆，并送測序；
[0019]C、測序正確重組質粒pMD-A0X-G0D經Pmel酶切后線性化。用2μg線性化 pMD-AOX-GOD質粒電擊轉化80μ1畢赤酵母PichiapastorisX33感受態細胞，然后將 轉化細胞涂于含100μg/mlG418的YPD平板上，30°C培養96h;隨機挑選陽性菌落轉接含 100μg/mLG418的液體YPCS培養基，在溫度30°C、轉速200r/min條件下振蕩培養3d，期間 每隔24h加1%的甲醇，測定發酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性。
[0020] 本發明的具體技術內容還有：
[0021] 所述的葡萄糖氧化酶基因G0D的制備方法中是利用所設計的特異性引物，以點 青霉DNA為模板，在擴增儀上按照98°C預變性5分鐘；30個PCR循環：98°C變性30秒， 65°C退火30秒，72°C延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的程序進行PCR擴增；PCR反應均按 如下成份及用量進行：反應體系為50μ1:基因組DNA100ng，引物各0. 2ymol/L，dNTPs 250μmol/L, 5XQ5High-FidelityDNAPolymeraseBuffer10μ1,Q5High-Fidelity DNAPolymerase0. 5μ1。PCR產物跑1 %的瓊脂糖電泳觀察結果；PCR產物通過T4DNA連 接酶連接到質粒PMD18-T載體上，并轉化大腸桿菌DH5α，然后涂布到具有氨芐青霉素的LB 平板上，37°C過夜培養直至菌落長出，隨機挑取2個克隆進行測序，序列分析獲得G0D基因 序列。
[0022] 本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于：
[0023]1、本發明通過PCR技術獲得了一個全長的G0D基因序列，該基因全長為1815bp，GC 含量為55. 4%。同源分析該基因與以往的報道的GOD的基因序列具有一定的差異，證明該 基因是一個新的G0D基因。
[0024] 2、本發明中所制備的巴斯德畢赤酵母PichiapastorisCGMCCNo. 11626突破了 傳統黑曲霉和青霉菌發酵生產GOD過程中，夾雜大量過氧化氫酶、纖維素酶及淀粉酶等雜 酶，難純化的問題。利用本發明所獲得的轉基因畢赤酵母工程菌，在10L發酵罐水平檢測條 件下，甲醇誘導144小時，發酵液中的酶活達到594U/ml，顯著提高了發酵酶活；并且通過基 因工程手段改造葡萄糖氧化酶生產菌株，還可以獲得萄糖氧化酶準確高效的生產，提高產 酶量（9g/L)，為后期的工業化生產提供了導向基礎，提高經濟效益。
[0025]本發明中的巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris申請人已提交中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.11626,該保藏機構的地址位于北 京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，該保藏機構的簡稱為CGMCC。
【附圖說明】
[0026] 本發明的附圖有：
[0027] 圖1是本發明中葡萄糖氧化酶基因G0D及利用其編碼的蛋白的序列表。
[0028] 圖2點青霉G0D基因全長結果。
[0029] 以點青霉基因組DNA為模板，引物P1和P2進行PCR擴增，擴增出現一條約1800bp 的特異帶，。序列分析結果表明，其基因組DNA長1815bp，GC含量為55. 4%，含有全長的GOD 基因片段。Μ為DNAMarker，分子量從大到小依次為10000,8000,6000, 5000,4000, 3000bp， 2000bp，1000bp;1和2為GOD基因擴增產物。
[0030] 圖3是表達質粒pMD-A0X-G0D雙酶切檢測結果。
[0031] 將經引物GodF和GodF進行PCR擴增并純化回收的點青霉G0D基因和經過EcoRI 和Notl雙酶切的載體pMD-AOX進行Gibson連接以構建重組質粒。用重組質粒轉化感受態 大腸桿菌DH5α，并在含Amp的LB平板上篩選陽性菌落。陽性菌落質粒經EcoRI和Notl 雙酶切后，得到約6.5.Okb和1.8kb的兩個DNA片段，亦與預期大小相符。圖中Μ為DNA Marker，分子量從大到小依次為 10000,8000,6000, 5000,4000, 3000bp，2000bp，1000bp，1-6 是表達質粒PMD-A0X-G0D雙酶切產物。
[0032] 圖4是葡萄糖氧化酶在YPCS的表達的SDS-PAGE檢測結果。
[0033] 將重組的表達質粒pMD-A0X-G0D經Pmel酶切后線性化后，電轉化畢赤酵母X33感 受態，在Yro平板生長3d后，隨機挑選陽性菌落轉接液體YPCS，經甲醇誘導72h后，測定發 酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性，從32個轉化子中挑選出6株有葡萄糖氧化酶活性的轉化 子，表達率為16. 7%。同時發酵液上清液做蛋白質SDS-PAGE電泳，可見一條濃染的約90kD 的蛋白條帶。圖中Μ為是蛋白Marker，1-8篩選的不同畢赤酵母菌株，其中5號菌株酶活最 尚，24U/ml。
[0034] 圖5是葡萄糖氧化酶在10L發酵罐的表達SDS-PAGE檢測結果。
[0035] 在10L發酵罐中，在甲醇未誘導之前，處于菌株培養和碳源飼喂階段，在這兩個階 段內，菌體大量增長，此時無葡萄糖氧化酶蛋白的表達。隨著甲醇的誘導，發酵液中的葡 萄糖氧化酶活性逐漸增加，誘導144h后發酵液中葡萄糖氧化酶活性為496U/ml，蛋白質表 達量達到9. 4g，SDS-PAGE同時表明發酵液中葡萄糖氧化酶蛋白表達量也在不斷積累。圖 中Μ為是蛋白Marker，1-12 為經甲醇誘導 0h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，108h，120h， 132h，144h葡萄糖氧化酶表達量。