一種重組促胰島素分泌素融合蛋白、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種重組融合蛋白的制備工藝，尤其設及一種重組促膜島素分泌素融 合蛋白、制備方法及其應用，該重組促膜島素分泌素融合蛋白為促膜島素分泌素與人血清 白蛋白的融合蛋白，該重組促膜島素分泌素融合蛋白作為糖尿病和肥胖癥的長效藥物。
【背景技術】
[000引促膜島素分泌素（英文名稱為Exendin-4)是從南美大毒姍Gila monsterGlelodermasuspectum) 口腔分泌物中分離出的一種含有39個氨基酸的多膚 巧ng，J.等，J.Biol.Chem.，265 :20259-62,1990 出ng，J.等，J.Biol.Chem.，267 :7402-05, 1992)。其氨基酸序列與類膜高血糖素（glucagon-likepeptide，GLP-l)有53%的同源性 (Coke等，J.Biol.Chem.，268 :19650-55,1993)。Chen和Drucker克隆了該基因，并得出它 是不同于膜高血糖素基因（GLP-1是由膜高血糖素原加工而成）的另外一個基因的表達產 物（J.Biol.Chem.，272 :4108-15,1997)。
[0003]GLP作為膜高血糖素基因的產物，表達于膜島α細胞和腸道粘膜L細胞。翻譯 產物膜高血糖素原通過翻譯后蛋白加工形成多個活性膚，Ν端為膜高血糖素，從C端分切 成61口-1和61口-2，二者與膜高血糖素序列50%同源值^1。1?5'0.1，01油6163，1998,47: 159)。GLΡ-1含有30個氨基酸，葡萄糖和脂肪可刺激其釋放。GLP-1具有促膜島素分泌作 用，刺激膜腺β細胞分泌膜島素。GLP-1抑制膜腺α細胞分泌膜高血糖素。GLP-1還可W 抑制胃排空（Wettergren等，Dig.Dis.Sci.，1993, 38 (4) :655-73)，抑制膜高血糖素分泌 (Creutzfel化等，Di油etesCare，1996，19(6) :58〇-6)，GLP-l有食欲控制作用（Turton等， 化化re, 1996, 379 (6560) :69-72)，還有報道GLP-1可恢復老年大鼠膜島細胞對葡萄糖的敏 感性，使其葡萄糖的耐受性恢復到年輕大鼠的水平巧gan等，Di油etologia，1997,40(增刊 1) :A130)。
[0004]GLP-1的半衰期僅數分鐘，可被二膚基膚酶IV(dipeptidylpeptidaseIV， DPP-IV)快速降解，去除Ν端二膚，從而失去促膜島素分泌的活性，DPP-IV分布廣泛，在調控 GLP-1 活性中發揮重要作用化ieffer等，Endocrinology, 1995,136 :3585)。GLP-1 的體內 生物作用時間短是其特征之一，運妨礙它開發為治療藥物。
[0005]Exendin-4的簇基端（即C端）含有GLP-1所沒有的9個氨基酸，不容易被膚鏈 內切酶降解；與化P-1的氨基端（即N端）序列化is-Ala-Glu)不同，Exendin-4的N端 倒數第2個氨基酸是甘氨酸化is-Gly-Glu)，不被二膚基膚酶IV分解，對DPP-IV的清除有 抵抗作用，故血漿半衰期更長，具有良好的臨床應用前景，是一種更有效而作用時間更長的 GLP-1受體激動劑。
[0006] 藥理學研究證實了Exendin-4和GLP-1之間的相似與不同。據報道Exendin-4作 用于分泌膜島素的β-TCl細胞上的GLP-1受體，豚鼠膜腺分散的腺泡細胞和胃壁細胞。還 報道所述膚刺激促生長素抑制素的釋放和抑制立體胃中的胃泌素釋放（Goke等，J.Biol. Qiem.，1993, 268 :19650-55 ;Sche卵等，化1·.J.Pharmacol.，1994,69 :183-91;Eissele等， LifeSci.，1994, 55 :629-34)。報道發現Exendin-3和Exendin-4刺激膜腺腺泡細胞產生cAMP和釋放淀粉酶（Ma化otra，R.等，RegulatoiT化ptides，41 :149-56，1992;Raufman等， J.Biol.Qiem. 267 :21432-37,1992;Sing等，Regul.化pt. 53 :47-59,1994)。Exendin-4 的 作用時間較GLP-1明顯延長。例如在一個實驗中，據報道Exendin-4降低糖尿病小鼠葡 萄糖的作用持續數小時，而且根據計量最長長達24小時巧ng.J.，Di油etes，1996,45 (增 刊2) :152A)。根據Exendin-3和Exendin-4的促膜島素活性，提出將其用于治療糖尿病W 及防止高血糖巧ng，美國專利號5, 424, 286)，該專利公開了Exendin-4與GLP-1促膜島素 分泌的對比實驗，與GLP-1相比，產生促膜島素分泌作用所需的Exendin-4濃度更低，而且 Exendin-4在人體內的半衰期更長。大量動物模型實驗顯示，Exendin-4表現出了與GLP-1 類似的抗糖尿病藥的作用。
[0007]Exendin-4作為GLP-1類似物，能夠模擬人體內天然的胃腸激素促進膜島素分泌 及調控血糖等，在多種動物模型中表現出了與GLP-1類似的抗糖尿病藥的作用。其作用主 要包括：（1)顯著增加葡萄糖依賴性促膜島素分泌，Exendin-4在血糖水平正常或低血糖時 并不刺激膜島素的分泌，僅在血糖水平較高時刺激膜島素分泌；（2)抑制2型糖尿病患者膜 高血糖素的分泌，在高血糖時降低血清中膜高血糖素濃度，但不減弱正常膜高血糖素對低 血糖的反應；（3)刺激膜島β細胞增生或胚胎膜島素分泌細胞分化成熟，抑制膜島β細胞 調亡從而增加膜島β細胞的數量；（4)抑制餐后胃腸動力及分泌功能，延遲胃排空從而有 利于餐后血糖的控制；（5)降低食欲，減少食物的攝入。與同類藥物相比，它除了療效確切、 副作用更低外，還有目前市場上其它糖尿病治療藥物所不具備的兩大優勢：不產生低血糖 和有減肥效果。
[0008] 與現有的降糖藥相比，促膜島素分泌素最大的優勢在于其獨特的作用機制，它可 W在高血糖時刺激膜島素的分泌，而低血糖時不刺激膜島素的分泌，運樣就有效防止了低 血糖的發生，大大提高了用藥的安全性，減少了膜島素的用量，有效改善了患者的生活質量 及用藥危險性。
[0009] 多膚類藥物由于受體內蛋白酶降解和腎臟快速清除作用，體內半衰期較短，用藥 周期短。雖然Exendin-4相比于GLP-1在體內具有更長的半衰期，但臨床上仍需要每天注 射兩針，給病患帶來極大的不便和痛苦。因此，開發長效的Exendin-4制劑，就具有十分重 要的意義。
[0010] 白蛋白（又稱清蛋白，a化umin，A化）系由肝實質細胞合成，在血漿中的半衰期約 為15-19天，是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的40%-60%。它的主要作用是擴 充血容量和維持血漿的滲透壓。人血清白蛋白（簡稱HSA)是一種含有585個氨基酸的單 鏈無糖基化的蛋白質，分子量化為66000~69000道爾頓，等電點pI4. 7~4. 9。HSA本身 就是許多內源因子和外源藥物的載體，藥物和血清白蛋白結合后，可W減少其生物利用度 同時增加在體內的半衰期（Lucas等JAmChemSoc，2004,126 (43) :14258-14266.)。大多 數治療用的蛋白和多膚半衰期一般較短，而HSA有將近長達19天（PetesTP.AllAbout A化umin.SanDiego:AcademicPress，1996.)的血清半衰期，并且HSA的基因在畢赤酵母 中可W高效分泌表達（ChuangVT等，PharmRes，2002，19(5) :569-577),上清液雜質含量 較少，純化方便，因此將蛋白質藥物基因與HSA基因融合，在畢赤酵母或釀酒酵母中表達， 獲得HSA的融合蛋白，延長蛋白質藥物的半衰期。
[0011] 美國馬里蘭州人類基因組科學化G巧公司已經進行一系列與HSA融合延長蛋白質 藥物半衰期的研究，其蛋白質藥物HSA/IFN-a融合蛋白（A化uferon-a)研究結果表明， Albuferon- α平均半衰期148小時，比PEG化干擾素化gasys平均半衰期80小時巧0-140 小時）和PEGIntron平均半衰期40小時（22-60小時）更長。它有很好的抗病毒活性，安全 性和耐受性。病人用藥后產生對HSA抗體為1.7%，但未用藥者存在HSA抗體達3. 4%，并 且在抗體產生副反應，抗病毒反應和藥代動力學之間沒有明顯的相關性（Osborn B L等，J Pharmacol Exp Ther?2002?303 (2) :540-548 ；Human Genome Sciences民eports Positive Results of Phase 1/2 Clinical Trial of Albuferon in Chronic Hepatitis C. HGSI Press，2004，Nov. 2 ;Human Genome Sciences民eports Positive Results of Phase 2 Clinical Trial of Albuferon in Treatment Naive Patients with Chronic Hepatitis C. HGSI Press，2005, Apr. 14)0
[0012] 天然腸激酶（英文名稱為Enterokinase)由一條結構亞基（重鏈）和一條催化弧 基（輕鏈）構成，腸激酶在體內激活膜蛋白酶原轉化為膜蛋白酶。由于腸激酶的輕鏈結構 在人、牛和豬中保守，其識別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎動物中也有很強的保守性， 且幾乎所有被定序的膜蛋白酶原都具有4個天冬酷胺相連的特征，此序列在其他的天然 蛋白質上又非常罕見，而腸激酶的活性中屯、有一個特殊的陽離子位點，使得有強大負電的 Asp-sp-Asp-Asp-Lys可W與此陽離子位點結合。因此，牛腸激酶的底物酶切位點序列具有 高度的特異性。運種特點使得天然腸激酶成為基因工程融合蛋白表達后修飾過程中一個極 其有用的工具而被廣泛應用。
[0013]

【發明內容】

[0014] 鑒于現有技術所存在的問題，本發明提供一種重組促膜島素分泌素融合蛋白，在 該融合蛋白中，兩個促膜島素分泌素巧xendin-4)分別位于人血清白蛋白化SA)的兩端， 便于各自發揮對受體的結合作用；同時，在促膜島素分泌素巧xendin-4)與人血清白蛋白 化SA)之間引入連接膚，增加促膜島素分泌素的空間繞性，既避免了空間位阻效應，又有效 防止了免疫原性的產生。同時，通過將Exendin-4多膚與HSA形成融合蛋白來延長其體內 半衰期，從而大大減少每個治療周期的藥物注射次數。
[0015] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0016] 一種重組促膜島素分泌素融合蛋白，其多膚區包括促膜島素分泌素和人血清白蛋 白，所述促膜島素分泌素W單體或者多個單體的形式通過連接膚與人血清白蛋白串聯在一 起，所述促膜島素分泌素序列的氨基端和/或簇基端通過連接膚與人