大豆Glyma.04G253500抗病基因的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及大豆Glyma. 04G253500抗病基因及其編 碼的蛋白質MEKK1與合成方法。
【背景技術】
[0002] 大豆原產于中國，在我國已有5000多年的栽培歷史。然而自1996年至2010年 間，大豆進口量從110萬噸驟然飆升至5480萬噸，已嚴重影響到我國的糧食安全。大豆在 高溫、高濕的環境中，易遭受多種病原物如病毒、真菌及線蟲等的侵染。在我國，危害大豆生 產的主要病原物有大豆花葉病毒、亞洲銹病、霜霉病及大豆孢囊線蟲病。這些高發的大豆真 菌病，病毒病致使我國每年的大豆產量減產高達10-30%。以大豆花葉病毒病為例，全國各 地均有發生，侵染區的發生在70-95%以上。植株被病毒侵染后重病年損失10-20%，個別 年份或少數地區產量損失可高達50%。病株不但減產而且降低種子質量（如萌發率、蛋白 質含量及含油量的降低），從而影響種子商品價值。因此，提高大豆品種的抗病能力是目前 大豆育種工作急需解決的關鍵問題之一。
[0003] MAPK通路的基本組成是一種從酵母到人類都保守的三級激酶模式，包括MAPK激 酶激酶（MAPkinasekinasekinase，MKKK)、MAPK激酶（MAPkinasekinase，MKK)和MAPK， 這三種激酶能依次激活，共同調節著細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多 種重要的細胞生理/病理過程。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種大豆Glyma. 04G253500抗病基因的用途。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種大豆Glyma. 04G253500抗病基因的用 途，用于提高大豆的抗病性能；所述大豆Glyma. 04G253500抗病基因cDNA核苷酸的序列如 SEQIDN0 :1 所述。
[0006] 作為本發明的大豆Glyma. 04G253500抗病基因的用途的改進：所述抗病包括抗大 ?花葉病毒（SMV)、抗大?霜霉囷。
[0007] 在本發明中，提供了大豆Glyma. 04G253500抗病基因及其編碼的蛋白質ΜΕΚΚ1與 合成方法。
[0008] 大豆Glyma. 04G253500抗病基因的cDNA核苷酸的序列如SEQIDN0 :1所述。
[0009] 大豆Glyma. 04G253500抗病基因編碼的蛋白質MEKK1的氨基酸序列如SEQIDN0 : 2所述。
[0010] 大豆Glyma. 04G253500抗病基因的合成方法為：提取基因沉默型大豆的 RNA，將RNA反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板，以下述序列為引物，通過RT-PCR獲得 Glyma. 04G253500的基因序列，所述引物的序列為：
[0011] Glyma. 04G253500-F:5' -CCCGAATTCATGCATTACCTATCTCGGATTTT-3' ；
[0012] Glyma. 04G253500-R:5' -CCCGGATCCTTAACCCTTACGGCCGTGA-3'。
[0013] 本發明還提供了一種MEKK1沉默植株。
[0014] 本發明利用基因沉默及基因誘導技術，沉默大豆Glyma. 04G253500基因，驗證其 增強大豆抗病的能力；并轉入誘導型啟動子，增強大豆抗病能力，改良抗病性狀。
[0015] 本發明的有?效果：大?Glyma. 04G253500抗病基因提尚了大?抗病性能；大? Glyma. 04G253500抗病基因的合成方法簡單，合成效率高，可以實現工業化生產。
【附圖說明】
[0016] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0017] 圖1為Glyma. 04G253500抗病基因全長cDNA序列的擴增結果。
[0018] 圖2為沉默GmMEKKl導致大豆植株局部和系統的超敏性細胞的死亡。
[0019]圖2中：
[0020]A為未沉默GmMEKKl的對照組；
[0021]B為沉默GmMEKKl的實驗組；B中的箭頭代表沉默GmMEKKl產生的超敏性細胞壞死 斑點；
[0022] C為未沉默GmMEKKl的對照組；
[0023] D為沉默GmMEKKl的實驗組；
[0024]E為放大的沉默GmMEKKl的實驗組；E中的箭頭代表超敏性細胞壞死斑點；
[0025] F為放大的未沉默GmMEKKl的對照組；
[0026]G為臺盼藍染色的沉默GmMEKKl的實驗組植株的系統葉片；G中的箭頭代表超敏性 細胞壞死斑點；
[0027]Η為臺盼藍染色的未沉默GmMEKKl的實驗組植株的系統葉片；
[0028] 圖3為沉默型大豆植株的MEKK1在轉錄水平上降低，PR基因誘導沉默植物MEKK1 的表達。
[0029] 圖4為沉默GmMEKKls的大豆植株提高了對大豆花葉病毒（SMV)的抗性。
[0030]圖 4 中，
[0031]A為BPMV-OandGmMEKKlGUS染色結果；
[0032] 備注說明：下圖為上圖的局部放大示意圖，箭頭所指為GUS染色斑點；
[0033]B為BPMV-OandGmMEKKl⑶S染色斑點直徑統計。
[0034] 圖5為沉默GmMEKKls的大豆植物提高了對霜霉病的抗性。
[0035]圖 5 中：
[0036]A為在BPMV-0植株葉片上檢測出大豆霜霉病斑（圖A左）。在GmMEKKl植株葉片 上未檢測出大顯霜霉病斑（圖A右）；
[0037]B為在BPMV-0植株葉肉細胞中觀測到大豆霜霉病菌絲；
[0038]C為在GmMEKKl植株葉肉細胞中未觀測到大豆霜霉病菌絲；
[0039]D為在GmMEKKl植株上附著胞和萌發管無法穿透葉表皮細胞；1、2、3代表附著胞， GT分別代表萌發管。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合圖1至圖5對本發明的優選實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和 特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護范圍做出更為清楚明確的界 定。
[0041]實施例1.、Glyma. 04G253500抗病基因序列合成
[0042]1、總RNA的提取，采用Trizol法提取總RNA :
[0043] (1)取大豆幼苗植株葉片，并將植株葉片剪碎，去掉葉柄和較粗的葉脈，放入到 液氮中預冷的研缽內，向研缽內加液氮并研磨至粉末，將粉末轉移至液氮中冷卻處理過的 1. 5ml的離心管內。
[0044] (2)向1. 5ml的離心管中加1mlTRIZ0L，并使離心管漩渦震蕩，每震蕩一會兒對離 心管進行開蓋放氣處理，防止離心管內的氣壓變大而使液體迸濺，從而制備得到研磨液。
[0045] (3)將制備得到的研磨液裝入新的離心管內，將裝好研磨液的離心管放在離心機 上進行離心處理，該離心機的溫度為4°C，轉速為12000rpm，離心時間為lOmin。
[0046] (4)吸取離心處理后的離心管的上清液到一個新的離心管中，并將裝有上清液的 離心管室溫放置5min。
[0047] (5)向裝有上清液的離心管內加0.2ml氯仿，并對離心管蓋緊蓋子，強力震蕩15秒 后，室溫放置2-3min。
[0048] (6)將上述離心管進行離心處理；離心溫度為4°C，轉速為12000rpm，離心時間為 15min〇
[0049](7)離心后，離心管有液相和有機相，中間分層，將離心管傾斜45°，用100μ1槍 頭向離心管內輕輕吸出最上面液相裝入到新管中；不要吸到中間層和有機層。
[0050](8)加0. 5ml異丙醇于新管中，室溫放置lOmin，離心溫度為4°C，轉速為 12000rpm，離心時間lOmin。
[0051](9)去除新管內的上清液，留沉淀于新管內。
[0052] (10)再向新管內加1ml75%乙醇，將新管震蕩，再將新管進行離心處理，離心溫 度為4°C，轉速為7500rpm，離心時間為5min。
[0053] (11)再去除上清液，室溫放置2-3min。
[0054] (12)用 20-30μ1Rnase-free water重懸，取 1μ1 測濃度。
[0055] (13)提取出總RNA。
[0056] 2、cRNA的合成
[0057] 具體步驟：
[0058] (l)RNA的變性
[0059] 把RNA放在65°C溫度下熱變性5min后，立即放于冰上冷卻。
[0060](2)反應液配制
[0061]
[0062]補水至10 μ1。
[0063] (3)逆轉錄反應
[0064] 37°C條件下進行15min的逆轉錄，然后在98°C條件下進行5min的酶失活反應，最 后在4°C下保存。
[0065] 3、以cRNA為模板合成目的片段
[0066] 具體步驟：
[0067] (1)高保真PCR50μ1 體系
[0070] 最后加滅菌ddH20至50μ1。
[0071] (2)高保真PCR反應體系
[0072] 將上述體系混勻，放入PCR儀中，進行反應。
[0073]① 95°C，3min。
[0074]② 98°C，10s
[0075]③ 55°C-60°C, 15s
[0076]④ 72°C，lmin/kb ;
[0077]⑤ 72°C，10min〇
[0078] ⑥4 °C，永久保存。
[0079] 注意：②，③，④反應循環35次左右。
[0080] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。結果如圖1所示。圖左表示目的片段大小為 1701bp，圖右表示 2000bp的DNAMaker。
[0081] 所得大豆Glyma. 04G253500抗病基因cDNA核苷酸的序列如SEQIDNO:1所述。該 大豆Glyma. 04G253500抗病基因編碼的蛋白質MEKK1的氨基酸序列如SEQIDN0 :2所述。
[0082]實施例 2、BPMV-Glyma. 04G253500 載體的構建：
[0083]1、載體BPMV-RNA1 的酶切
[0084]
[0085] 將離心管放置于37°C下酶切3小時，純化，S卩，為在PCR、酶切、酶標、或測序反應液 中，加3個體積的BufferPCR-A(若BufferPCR-A不足100μ1，加至100μ1);混勻后，轉 移到DNA制備管中，將DNA制備管置于2ml離心管中，12,000Xg離心lmin，棄濾液。將制 備管置回2ml離心管，加0. 7mlBufferW2,12, 000Xg離心lmin，棄濾液。將制備管置于潔 凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加20μ1ddH20,室溫靜置lmin。12,000Xg離 心lmin洗脫DNA。
[0086] 2、基因片段Glyma. 04G253500 的酶切
[0089] 將離心管放置于37°C下酶切3小時，純化（純化條件同上），加20μ1ddH20。
[0090] 3、載體和基因片段的連接
[0091]
[0092] 4、熱激轉化、鑒定
[0093] 將20 μ 1重組質粒DNA制劑（步驟3所得）與200 μ 1的感受態DH5 α懸液溫和 混合，置轉化管于冰浴30min，再經42°C水浴90s，然后移置冰水中2min。轉化管內加入 800μ1 LB培養基后，置37°C的搖床45min。從轉化管內提取100ul轉化細胞，均勻涂布于 LB平板（含相應質粒抗性的抗生素，具體是濃度為50mg/ml的氨芐青霉素抗生素），將LB 平板放于37°C過夜培養；生長的菌落基本確定為轉化成功的菌株；之后進行質粒的提取鑒 定，從而獲得質粒BPMV-RNAl-Glyma. 04G253500。
[0094] 備注說明：質粒的提取鑒定按照常規的試劑盒離心提取法進行。具體方法可如 下：
[0095] ①取步驟4中