本發明涉及具有抗纖維化效果的肽及含有其的組合物，更具體地，涉及抗纖維化組合物，該組合物包含端粒酶衍生肽，從而有效抑制各種類型組織細胞纖維化的發生。
背景技術：
：纖維化是由成纖維細胞導致的引起疾病的細胞外基質的異常形成、積累和沉淀的疾病，并且是指由損傷或炎癥引起的膠原基質的異常積累，其改變了各種類型組織的結構和功能。不管纖維化發生在何處，纖維化的大多數病因包括代替正常組織的膠原基質的過度積累。特別地，發生在腎、肝、肺、心臟、骨或骨髓以及皮膚中的纖維化誘導器官衰竭，并最壞情況下導致死亡。成纖維細胞通過在正常狀態下產生細胞外基質前體來形成纖維組織。細胞外基質是結締組織中的細胞之間的材料，以纖連蛋白、層粘連蛋白、軟骨素或膠原蛋白等蛋白質的形式存在。同時，TGF-β在由成纖維細胞、細胞增殖、炎癥和癌細胞轉移引起的細胞外基質的異常形成和積累中起到多種作用，并且已經鑒定了許多細胞信號傳導途徑和靶。因此，在許多疾病模型中，已經研究了TGF-β，并且其中關于TGF-β的研究和相關藥物的開發最活躍的領域可能就是纖維化疾病和癌癥。在TGF-β機制中，通常，TGF-β結合TGF-β受體以誘導細胞質中Smad蛋白的磷酸化，并通過與各種Smad蛋白的相互作用轉移信號。此處通常涉及Smad2和Smad3，而Smad1和Smad5參與骨形態發生蛋白(BMP)信號傳導。此外，Smad4已知是涉及激活素和BMP以及TGF-β的常見信號傳導物質(Heldin，CHetal.Nature，1997，390，465-471；MassagueJ.Annu.Rev.Biochem.1998，67，753-791)。由于通過抑制TGF-β信號傳導機制來調節腫瘤侵入和上皮-間充質轉化(EMT)的抑制，因此可以預期優異的抗癌治療效果。此外，考慮到TGF-β是細胞增殖和分化調節中的關鍵細胞因子，作為抗癌治療的主要副作用而提起的由輻射線引起的用于預防纖維化的治療方法也受到關注(Zhangetal.JRadiatRes.2013，54，630-636)。近來，由FDA批準(2014年10月15日)的作為特發性肺纖維化的治療劑的(吡非尼酮)是已知抑制TGF-β形成作為主要作用機制的TGF-β抑制劑。另外，據報道，TGF-β是細胞增殖調節因子，其誘導或抑制細胞增殖，因此在包括癌癥、心臟病和糖尿病的各種疾病的發病中起重要作用，并且其各種生理活性也已經報告。例如，(吡非尼酮)用作針對TGF-β合成的抑制劑(抑制形成細胞增殖調節因子)、TGF-β拮抗劑(干擾TGF受體，信號傳導障礙)、PDGF(血小板衍生的生長因子)拮抗劑(抑制血管生成誘導因子)、p38MAP激酶抑制劑(抑制細胞增殖信號傳導酶)和抗炎劑(抑制TNF-α和MAPK的形成)。因此，如果能夠開發出有效直接抑制TGF-β或阻斷TGF-β相關信號傳導過程并且甚至沒有副作用的新藥物組合物，這種藥物組合物可以預防和治療由纖維化引起的各種疾病和衰老。特別地，在癌癥環境中，存在各種纖維化引起因素，例如癌組織、抗癌劑和輻射治療，因此纖維化抑制在癌癥環境中具有更重要的意義。已知目前最流行的抗癌治療、輻射治療和化療會顯著削弱患者的生活質量，并且由于纖維化等引起的副作用而嚴重惡化抗癌治療的預后。因此，需要開發用于抑制癌相關的TGF-β信號傳導機制的治療劑，其不僅將用于開發抗癌疫苗，而且是用于將常規抗癌治療效果最大化的新治療劑和方法。例如，在抗癌治療中，由癌組織、抗癌劑或輻射線照射引起的纖維化通過阻斷抗癌免疫細胞向癌性區域的轉移從而干擾設計為當抗癌劑遞送至癌性區域時表現出抗癌效果的藥物的遞送和功效，并且阻止有效的抗癌治療。因此，如果新藥物組合物對人體沒有副作用并且能夠抑制由癌組織、化療劑或輻射線暴露引起的纖維化，那么可以更有效地進行抗癌治療。[現有技術文獻][專利文獻](專利文獻0001)KR15A(專利文獻0002)KR92A技術實現要素：技術問題在上述背景下，本發明人試圖開發具有優異效果而沒有副作用的抗纖維化組合物，從而完成了本發明。本發明的目的是提供有效的抗纖維化組合物。技術方案在一個方面，本發明提供了抗纖維化組合物，其包括選自由以下組成的組的至少一種：包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的肽(以下稱為“PEP1”)，與所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，以及它們的片段。在根據本發明的組合物中，肽的片段可以是由三個以上氨基酸組成的片段。在根據本發明的組合物中，纖維化可以是由選自由癌癥、抗癌劑的施用、輻射線照射組成的組中的至少一種誘發的纖維化。在根據本發明的組合物中，所述組合物可以抑制選自由胰腺癌、結腸直腸癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤和卵巢癌組成的組的癌細胞組織的纖維化。在根據本發明的組合物中，組合物可以與化療劑或輻射療法組合使用以抑制癌組織的纖維化。化療劑可以是選自脫氧核苷類似物和氟嘧啶中的至少一種，其中脫氧核苷類似物可以是吉西他濱，并且氟嘧啶可以是5-氟尿嘧啶或卡培他濱。在根據本發明的組合物中，組合物可以是還包含藥學上可接受的賦形劑和添加劑的藥物組合物。在根據本發明的組合物中，組合物可以是參與TGF-β信號傳導過程并因此抑制皮膚組織纖維化的抗纖維化組合物。在根據本發明的組合物中，組合物可以進一步包括可接受的賦形劑、潤滑劑和添加劑，并且可以是化妝品組合物。在另一方面，本發明提供了用于治療和預防纖維化疾病的方法，其包括向需要治療的受試者施用抗纖維化組合物。有益效果根據本發明，包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的肽，與所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它們的片段，包含這些的組合物，以及使用這些的方法具有優異的抗纖維化效果而沒有副作用。因此，可以有效地抑制由TGF-β信號傳導過程引起的組織纖維化，特別是由癌癥組織引起的纖維化或由抗癌劑或暴露于伴隨抗癌治療的輻射引起的纖維化等，并且非常有用于預防和/或治療纖維化疾病。附圖說明圖1是說明制備異種移植模型的整個實驗過程的圖，其中裸小鼠用AsPCI細胞接種，然后從10天后開始對小鼠施用PEP1和吉西他濱。圖2是顯示其中未接受任何處理的接種了AsPC1細胞的裸小鼠的對照的每只小鼠的重量，其中在接種后10天開始對接種了AsPC1細胞的裸小鼠施用PEP1和吉西他濱中每一種的組中每只小鼠的重量，以及在接種后10天至施用后24天對接種了AsPC1細胞的裸小鼠施用PEP1和吉西他濱的組合的組中每只小鼠的重量，以檢測PEP1和吉西他濱的體內抗癌作用。圖3顯示了其中未經任何處理的用AsPC1細胞接種的裸小鼠的對照的細胞圖像。圖4顯示了從接種后10天開始，每天一次對接種了AsPC1細胞的裸小鼠皮下施用PEP1的組的細胞圖像。圖5顯示了從接種后10天開始，每3天一次向接種了AsPC1細胞的裸小鼠腹膜內施用吉西他濱的組的細胞圖像。圖6顯示從接種后10天開始，對接種了AsPC1細胞的裸小鼠施用PEP1(每天一次，皮下)和吉西他濱(每三天一次，腹膜內)的組的細胞圖像。圖7是顯示在不對HepG2細胞系進行任何處理的對照中，和其中HepG2細胞系在TGF-β1處理之后未用任何物質處理的實驗組中，其中對HepG2細胞系中施用SB431542的陽性對照中，和其中以不同濃度(1、5和10μM)對HepG2細胞系施用PEP1的實驗組中，通過qRT-PCR評價的相對Sma2表達的圖。圖8是顯示其中HepG2細胞系用TGF-β1處理，然后用不同濃度(1、5和10μM)的PEP1處理的每個實驗組中Smad2抑制率(％)的圖。圖9是顯示在不對HepG2細胞系進行任何處理的對照中，和其中HepG2細胞系在TGF-β1處理之后未用任何物質處理的實驗組中，其中對HepG2細胞系中施用SB431542的陽性對照中，以及其中以不同濃度(1、5和10μM)對HepG2細胞系施用PEP1的實驗組中，通過qRT-PCR評價的相對Smad4表達的圖。圖10是顯示其中TGF-β1處理后，將PEP1以不同濃度(1、5和10μM)施用于HepG2細胞系的實驗組中的Smad4抑制率(％)的圖。圖11是顯示在不對HepG2細胞系進行任何處理的對照中，和其中HepG2細胞系在TGF-β1處理之后未用任何物質處理的實驗組，其中對HepG2細胞系施用SB431542的陽性對照中，和其中以不同濃度(1、5和10μM)對HepG2細胞系施用PEP1的實驗組中，通過qRT-PCR評價的相對纖連蛋白表達的圖。圖12是顯示在用SB431542處理HepG2細胞系的陽性對照中，和在TGF-β1處理后對HepG2細胞系施用不同濃度(1、5和10μM)的PEP1的實驗組中纖連蛋白抑制率(％)的圖。圖13顯示了在各組中一個暴露于輻射(6Gy，電離輻射(IR))而各組中另一個未經暴露10天之后，在其中用安慰劑(假手術)處理正常人表皮角化細胞(NHEK)的對照中和用1mMPEP1處理的實驗組中的細胞培養狀態。圖14是顯示了在各組中一個暴露于輻射(6Gy，電離輻射(IR))而各組中另一個未經暴露1天和10天之后，在其中用安慰劑(假手術)處理NHEK的對照的細胞中和用1mMPEP1處理的實驗組的細胞中GRHL2、p63、N-Cad和P-Akt表達的電泳圖像。圖15是顯示在暴露于輻射(6Gy，IR)后用安慰劑(假手術)處理的對照的細胞中和用1mMPEP1處理的實驗組的細胞中p-Smad2/3、Smad4、FN、Snai1和N-Cad表達的蛋白印跡圖像。具體實施方式在下文中，將參考示例性實施例更詳細地描述本發明。然而，本發明不限于具體公開內容，并且應當理解，本發明包括在本發明的技術思想和范圍內的所有修改、等同物和替代物。為了解釋本發明，當確定其可能模糊本發明的要點時，將省略對本領域中已知的相關技術的詳細描述。端粒，其是位于染色體的每個末端的重復遺傳材料，已知其防止對相應染色體的損傷或偶聯到不同染色體。端粒隨著細胞分裂而逐漸縮短，在細胞分裂一定次數之后變得非常短，并且細胞最終停止分裂并死亡。另一方面，已知端粒的延長可延長細胞的壽命。例如，已知在癌細胞中分泌稱為端粒酶的酶以防止端粒的縮短，導致癌細胞的穩定增殖而不死亡。本發明人鑒定了衍生自端粒酶的肽在抑制纖維化方面有效，從而完成了本發明。在本發明的一個方面，SEQIDNO：1的肽，其片段或與所述肽序列具有80％以上序列同源性的肽包括端粒酶，特別是衍生自智人(Homosapiens)端粒酶的肽。本說明書中公開的肽可以包括具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上，或99％以上的序列同源性的肽。此外，本說明書中公開的肽可以包括SEQIDNO：1的肽，其片段，和其中至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個氨基酸被修飾的肽。在本發明的一個方面，可以對使SEQIDNO：1的肽的物理化學特性發生變化的肽中的一些氨基酸在本發明的范圍內進行修飾。例如，可以修飾氨基酸以允許肽具有增強的熱穩定性、改變的底物特異性和改變的最佳pH。本文使用的術語“氨基酸”不僅包括天然整合到肽中的22種標準氨基酸，而且包括D-異構體和轉化的氨基酸。因此，在本發明的一個方面，本文的肽包括具有D-氨基酸的肽。另一方面，在本發明的另一方面，肽可以包括非標準氨基酸，例如已經進行翻譯后修飾的那些。翻譯后修飾的實例包括磷酸化、糖基化、酰化(包括乙酰化、肉豆蔻酰化和棕櫚酰化)、烷基化、羧化、羥基化、糖化、生物素化、泛素化、化學性質的轉化(例如β-去除脫酰亞胺化、脫酰胺)和結構轉化(例如二硫鍵的形成)。翻譯后修飾還包括當與交聯劑偶聯以形成肽綴合物時由于化學反應而發生的氨基酸的改變，例如發生在氨基、羧基或側鏈處的氨基酸的改變。本文公開的肽可以是從天然來源鑒定和分離的野生型肽。同時，本說明書中公開的肽可以是包含與SEQIDNO：1的肽的片段相比，取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列的人工變體。野生型多肽以及人工變體中氨基酸的改變包括保守氨基酸的取代，其對蛋白質的折疊和/或活性沒有顯著影響。保守性取代可以在由以下組成的組的范圍內進行：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)。通常，不改變比活性的氨基酸取代是本領域已知的。最常發生的交換發生在Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，反之亦然。保守性取代的其他實例示于下表1中。表1原始氨基酸示例性殘基取代優選殘基取代Ala(A)val；leu；ileValArg(R)lys；gln；asnLysAsn(N)gln；his；asp，lys；argGlnAsp(D)glu；asnGluCys(C)ser；alaSerGln(Q)asn；gluAsnGlu(E)asp；glnAspGly(G)AlaAlaHis(H)asn；gln；lys；argArgIle(I)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheIleLys(K)arg；gln；asnArgMet(M)leu；phe；ileLeuPhe(F)leu；val；ile；ala；tyrTyrPro(P)AlaAlaSer(S)thrThrThr(T)SerSerTrp(W)tyr；pheTyrTyr(Y)trp；phe；thr；serPheVal(V)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸Leu在肽的生物學性質方面，通過選擇在以下方面具有顯著不同效果的取代部分進行實質性修飾：(a)在取代區域中保持多肽的主鏈結構，例如折疊或螺旋狀三維結構，(b)在靶位點保持分子的電荷或疏水性，或(c)保持側鏈的體積。基于側鏈的一般性質，將天然殘基分類為以下組：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)基本：asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈構象的殘基：gly、pro；和(6)芳香族：trp、tyr、phe。非保守性取代可以通過將一個組的成員與另一個組的成員交換來進行。與維持肽的正確三維結構無關的任何半胱氨酸殘基通常可以被取代為絲氨酸，從而增加分子的氧化穩定性并防止不適當的交聯，并且相反地，可以通過向肽添加半胱氨酸鍵實現增強的穩定性。通過改變抗體的糖基化模式來制備肽的不同類型的氨基酸變體。本文使用的術語“變化”是指在肽上發現的一個或多個碳水化合物殘基的缺失和/或在肽中不存在的一個或多個糖基化位點的添加。肽中的糖基化通常是N-或O-連接的糖基化。本文所用的術語“N-連接的糖基化”是指碳水化合物殘基與天冬酰胺殘基的側鏈的連接。作為三肽序列，天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是任何氨基酸，不包括脯氨酸)是用于將碳水化合物殘基酶促連接到天冬酰胺側鏈的識別序列。因此，當這些三肽序列之一存在于多肽中時，產生潛在的糖基化位點。本文所用的“O-連接糖基化”是指將一種糖，例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖連接到羥基氨基酸，最典型地連接到絲氨酸或蘇氨酸，但是也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。通過改變氨基酸序列以含有上述三肽序列(對于N-連接的糖基化位點)，方便地進行將肽糖基化位點添加到肽中。這種改變可以通過向第一抗體序列中添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基或通過取代這些殘基之一(對于O-連接的糖基化位點)來進行。此外，根據本發明的一個方面的包含SEQIDNO：1的肽或其片段或與所述肽序列具有80％以上序列同源性的肽具有低細胞毒性和高體內穩定性。在本發明中，SEQIDNO：1代表端粒酶衍生肽，其由如下16個氨基酸組成。SEQIDNO：1所描述的肽顯示在表2中。給出以下表2中的“名稱”以區分一種肽與另一種肽。在本發明的一個方面，SEQIDNO：1所描述的肽代表人端粒酶的整個肽。在本發明的另一方面，包含SEQIDNO：1的肽或其片段或與所述肽序列具有80％以上序列同源性的肽包括由存在于選自端粒酶中包括的肽的相應位置的肽合成的“合成肽”。SEQIDNO：2表示端粒酶的全長氨基酸序列。表2在一個方面，本發明提供了藥物組合物，其包括作為活性成分的具有抗纖維化作用的肽，例如包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的肽，與所述氨基酸序列具有80％以上序列同源性的肽，或者它們的片段。根據本發明的一個方面的抗纖維化藥物組合物可以包括包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的肽，與所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它們的片段，其含量為0.01mg/kg至0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg，并且當根據含量存在效果差異時，可以適當地調節含量。當組合物包括在上述范圍或更小范圍內的肽時，它適合于顯示本發明的指定效果，并且能夠滿足組合物的穩定性和安全性要求。此外，上述范圍在成本效益方面可能是適當的。在一個方面，本發明提供了包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的肽，與所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它們的片段用以制備上述任一種用于抑制纖維化的組合物的用途。根據本發明的一個方面的組合物可以應用于所有類型的動物，包括人、狗、雞、豬、牛、羊、豚鼠和猴。在本發明的一個方面，組合物可以是包含具有抗纖維化作用的肽(例如，包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的肽，與所述氨基酸序列具有80％或更多序列同源性的肽，或者它們的片段)的藥物組合物。根據本發明的一個方面的藥物組合物可以口服、直腸、經皮、靜脈內、肌內、腹膜內、髓內、鞘內或皮下施用。用于口服施用的劑型可以是但不限于片劑、丸劑、軟或硬膠囊、顆粒、粉末、溶液或乳液。用于胃腸外施用的劑型可以是但不限于注射劑、滴劑、洗劑、軟膏、凝膠、霜劑、懸浮劑、乳劑、栓劑、貼劑或噴霧劑。根據需要，本發明的藥物組合物可以包括添加劑，如稀釋劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、分散劑、表面活性劑、著色劑、調味劑或甜味劑。根據本發明的一個方面的藥物組合物可以通過本領域中使用的常規方法制備。根據本發明的一個方面的藥物組合物的活性成分可根據患者的年齡、性別、體重、病理狀況和嚴重性、施用途徑或處方者的判斷而變化。本領域普通技術人員基于這些因素確定施用劑量，藥物組合物的日劑量可以是例如0.1μg/kg/天至1g/kg/天，具體地，1μg/kg/天至100mg/kg/天，更具體地，10μg/kg/天至10mg/kg/天，更具體地，50μg/kg/天至1mg/kg/天，但是當根據劑量存在效果差異時，可以適當地調節劑量。根據本發明的一個方面的藥物組合物可以每天施用一次至三次，但是本發明不限于此。在本發明的一個方面，組合物可以是抗纖維化組合物，其包括包含SEQIDNO：1的氨基酸序列的肽，與該氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它們的片段作為有效成分。在本發明的一個方面，組合物可以是用于抑制纖維化的組合物，所述纖維化由癌組織，特別是胰腺癌、胃癌、腎細胞癌、前列腺癌、喉癌、食管癌、甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、大小腸癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、泌尿生殖器癌、膀胱癌和皮膚癌組織引起。根據本發明的一個方面的組合物可以以片劑、顆粒、粉末、液體或固體的形式制備。對于每種形式，根據本領域普通技術人員的使用形式或目的，可以容易地混合在相應領域中常規使用的除活性成分以外的成分，并且當與不同的基材同時使用時可具有協同效應。活性成分的施用劑量由本領域普通技術人員確定，藥物組合物的日劑量可以是例如具體為1μg/kg/天至100mg/kg/天，更具體地為10μg/kg/天至10mg/kg/天，更具體地為50μg/kg/天至1mg/kg/天，并且當根據含量存在效果差異時，可以適當調節劑量，并可以根據各種因素而變化，包括受試者的年齡、健康狀況、并發癥等。說明書中使用的術語僅用于解釋具體示例，而不是用于限制本發明。在其前面沒有數字的名詞不限制數量，并且指示由名詞描述的至少一個物品存在。術語“包括”，“具有”和“含有”被解釋為開放術語(即，意味著“包括但不限于”)。數值范圍的提及僅僅只是因為它是一種簡單的方法來對包含在范圍內的每個值替換為另外的值。除非另外特別公開，每個值被并入本文，就好像它是本說明書中單獨提及。在所有范圍的端值包括在每個范圍的，并且可以獨立地組合。除非另外公開或與上下文明顯矛盾，否則本文提及的所有方法可以以合適的順序執行。任何或所有實施例或示例性語言(例如，“諸如”)的使用不僅更好地描述本發明，而且還限制本發明的范圍。說明書中的語言不應被解釋為指示未要求保護的組件對于實現本發明是必要的。除非另有定義，本文使用的技術或科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同的含義。本發明的示例性實施例包括發明人已知的用于實現本發明的最佳模式。通過閱讀以上描述，本領域普通技術人員可以清楚地理解示例性實施例的變型。本發明人期望本領域普通技術人員適當地利用這些變化，并進一步期望本發明以與說明書中描述的模式不同的模式來實現。因此，如專利法所允許的，本發明包括所附權利要求中提及的本發明的要旨的等同物和所有修改。此外，除非另有說明或與上下文明顯矛盾，否則所有可能變化中提到的組分的所有組合都包括在本發明中。參考示例性實施例詳細描述了本發明，但是本領域普通技術人員將很好地理解，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，本發明可以在形式和細節上進行各種改變如由所附權利要求限定。在下文中，將參考實施例和實驗實施例更詳細地描述本發明的構造和效果。盡管下面的實施例和實驗實施例僅用于幫助理解本發明，但是本發明的范圍和范圍不限于此。實施例實施例1：肽的合成1.肽的合成SEQIDNO：1的肽(以下稱為“PEP1”)根據常規已知的固體肽合成制備。具體地，通過使用ASP48S(Peptron，Inc.，Daejeon，Korea)通過Fmoc固相肽合成(SPPS)從C末端逐個偶聯氨基酸來合成肽。本文所用的連接肽C-末端的第一個氨基酸的樹脂如下：NH2-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂NH2-Ala-2-氯-三苯甲基樹脂NH2-Arg(Pbf)-2-氯-三苯甲基樹脂在肽合成中使用的所有氨基酸組分中，N末端被Fmoc保護，并且所有殘基都被Trt、Boc、叔丁基酯(t-Bu)或2，2，4，6，7-五甲基二氫-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，其從酸中除去。這種氨基酸組分如下：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ahx-OH、Trt-巰基乙酸。作為偶聯試劑，使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基銨六氟磷酸鹽(HBTU)/N-羥基苯并三唑(HOBt)/4-甲基嗎啉(NMM)。對于Fmoc脫保護，使用DMF中的20％哌啶。為了從樹脂分離合成的肽并除去殘基的保護基，使用切割混合物(cocktail)[TFA(三氟乙酸)/TIS(三異丙基硅烷)/EDT(乙二硫醇)/H2O＝92.5/2.5/2.5/2.5]。通過重復用偶聯至固相支架的氨基酸保護基偶聯的起始氨基酸保護相應的氨基酸、用溶劑洗滌和脫保護的方法合成每個肽。在從樹脂上切下合成的肽后，通過HPLC純化肽，通過MS評估以驗證合成，然后凍干。如通過高效液相色譜法評價的，實施例中使用的所有肽具有95％以上的純度。制備肽PEP1的詳細步驟如下。1)偶聯將溶解在DMF中的經保護的氨基酸(8當量)和偶聯劑HBTU(8當量)/HOBt(8當量)/NMM(16當量)加入到NH2-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂中，反應混合物在室溫下反應2小時，然后依次用DMF、MeOH和DMF洗滌。2)Fmoc脫保護在加入在DMF中20％哌啶后，將反應混合物在室溫下反應5分鐘，兩次，然后依次用DMF、MeOH和DMF洗滌。3)重復進行反應1和2以制備肽的堿性主鏈，例如NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基樹脂。4)切割：將切割混合物加入到之前合成的肽樹脂中以將肽與所述樹脂分離。5)向所得混合物中加入冷卻的二乙醚后，使通過離心得到的肽沉淀。6)通過制備型HPLC純化后，通過LC/MS分析肽以檢查分子量并凍干以獲得粉末。實施例2：在AsPC1細胞異種移植模型中PEP1抑制纖維化為了驗證PEP1和吉西他濱對胰腺癌的體內抗癌作用，使用AsPC1細胞系進行異種移植實驗。本文使用的異種移植方法如下。試劑和材料的制備用于實驗的試劑和材料如下。將粉末狀PEP1溶于0.2μm過濾的無菌水中后，將等分試樣儲存于-70℃，然后在使用前溶解，將吉西他濱溶于100％鹽水中。將5-氟尿嘧啶溶于DMSO中。細胞系的制備作為實驗中使用的細胞系的AsPC1細胞系(細胞#6×105細胞/100ml)是購自美國典型細胞培養物(ATCC，Rockville，MD)的人胰腺癌轉移細胞。將細胞系在37℃下培養，在含有10％胎牛血清(FBS)、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RoswellParkMemorialInstitute(RPMI1640)培養基中得到1×106～2×106的細胞密度。實驗方法將AsPC1細胞注射到各裸鼠實驗組①至④中。在實驗中使用的試劑和材料以及細胞系培養方法與實施例1中描述的相同。將培養的5×106AsPC1細胞皮下注射到裸鼠(BALB/c-nu/nu裸鼠，購自JoongangLaboratoryanimal，首爾，韓國)中。進行注射直到癌生長至100mm3的尺寸(約10天)。在癌移植后，將小鼠分成組，每組具有相似的平均重量，然后根據以下四個實驗組中的每一個的條件，將吉西他濱和Pep1中的任一個或兩者皮下和腹膜內注射到小鼠中(參考圖1)。用卡尺測量癌體積，并通過下式計算[寬度2×長度×0.52]。在移植后，將Pep1和吉西他濱中的任一個或兩者施用于四個實驗組中的每一個。①AsPC1移植對照②AsPC1移植+PEP12mg/kg(每日一次，s.c)施用組③2mg/kg移植+吉西他濱125mg/kg(每三天一次，i.p)施用組④2mg/kg移植+PEP12mg/kg(每天一次，s.c)+吉西他濱125mg/kg施用組(每三天一次，i.p)然后，每次定量每只小鼠的體重。此外，進行癌癥組織樣品制備和細胞增殖標志物(PCNA)/凋亡標志物(TUNEL)染色。對于實驗結果的分析，通過學生t檢驗評估幾個實驗組之間的平均值。統計學顯著性的標準設定為p＝0.0002。實驗結果根據各個實驗組的分析，可以看出，當施用吉西他濱和PEP1的組合和吉西他濱時，小鼠的體重在施用后第20天最小(參見圖2)。圖3-圖6顯示了各實驗組的細胞。在AsPC1細胞接種對照(組①；參照圖3)中，顯示染成藍色的膠原部分(對應于圖3中的深灰色部分))在染成紅色的癌細胞(對應于圖3中的淺灰色部分)之間增加。也就是說，可以看出由于癌癥，纖維化顯著發展。在用PEP1處理AsPC1細胞的組②(參照圖4)中，與圖3相比未示出染成藍色的部分(對應于圖4中的深灰色部分)。這表明膠原減少，因此，纖維化被PEP1顯著抑制。同時，在用吉西他濱處理AsPC1細胞的組③(參照圖5)中，可以看到染成紅色的部分(對應于圖5中的黑色部分)顯著減少，染成藍色的部分(對應于圖5中的淺灰色部分)增加。這表明癌細胞被吉西他濱殺死，但是纖維化顯著發展。這里，剩余的紅色細胞可能是針對CD133+癌癥干細胞的抗癌劑。在胰腺癌中，已知CD133+癌干細胞對作為抗癌劑的吉西他濱具有抗性，并且這些細胞周圍的纖維化的發展表明藥物遞送沒有良好地進行。然而，與圖5相比，在用PEP1和吉西他濱處理AsPC1細胞的組④中(參照圖6)，觀察到染成藍色的部分(對應于圖6中的淺灰色部分)減少。可以看出，PEP1顯著抑制了纖維化，因此由纖維化引起的藥物遞送的抑制顯著降低，這表明可以更容易發生作為抗癌劑的吉西他濱的細胞內遞送。實施例3：PEP1在HepG2細胞系中的TGF-β抑制作用為了驗證被認為是纖維化的主要原因的PEP1的TGF-β抑制作用，如下進行用于確認HepG2細胞系中的TGF-β信號傳導抑制作用的實驗。試劑和材料的制備實驗中使用的試劑和材料如下。將粉末狀PEP1溶于0.2μm過濾的無菌水中后，將等分試樣儲存于-70℃，然后在使用前溶解。作為細胞系，使用HepG2(ATCCHB-8065；美國典型培養物保藏中心)，將重組人TGF-β1溶解在4mMHCl中，制備10μg/mL原液。在10mM儲備液中制備用作陽性對照的SB431542(Sigma)。細胞系的制備將2x106HepG2細胞(ATCCHB-8065)接種到60mm陪替氏培養皿中并在CO2溫育箱中培養16小時。然后，將培養基轉移到無血清培養基(SEM)中，然后將細胞進一步培養24小時。隨后，向培養基中加入10ng/ml的TGF-β1，然后將各種濃度的PEP1(0.1、1、5、10μM)處理至培養基，隨后培養72小時。將各處理組在37℃于CO2培養箱中進一步培養1小時。分析TGF-β抑制相關基因表達的實驗根據制造商的方案使用PlusMiniKit(Qiagen)從肽處理的細胞中提取RNA。對提取的RNA進行定量，然后使用逆轉錄系統(Promega)從1μg總RNA合成cDNA。之后，使用CFX96實時系統(Bio-rad)進行qRT-PCR。作為TGF-β相關生物標志物，分析纖連蛋白(FN)、Smad2和Smad4的mRNA表達，并且使用GAPDH作為參照基因。對于PCR，如下構建各基因的引物。使用下表3的引物用40個循環(95℃，15秒；57℃，30秒；72℃，30秒)實時擴增基因。引物的核苷酸序列如下。表3實驗結果通過qRT-PCR評價PEP1的TGF-β抑制作用。在TGF-β存在下將PEP1培養48小時后，測量TGF-β相關基因如Smad2和Smad4的mRNA表達水平，并與參考基因GAPDH進行比較(參見圖7、8、9和10)。與未處理對照相比，在TGF-β處理組中Smad2和Smad4表達增加，并且在陽性對照SB431542中，與TGF-β處理組相比，隨著PEP1濃度的增加，作為TGF-β生物標志物的Smad2和Smad4被濃度依賴性地抑制。此外，通過比較纖連蛋白和GAPDH的mRNA表達水平，評價在TGF-β存在下PEP1培養48小時后顯示的作為TGF-β相關纖維化基因的纖連蛋白的表達降低(參照圖11)。與未處理的陰性對照相比，在TGF-β處理組中，纖連蛋白表達增加。同時，在陽性對照SB431542中，與TGF-β處理組相比，當PEP1的濃度增加時，PEP1處理組顯示纖連蛋白抑制。陽性對照(SB431542)顯示抑制率為60.7％，PEP1顯示抑制率為22.8％～47.5％(參照圖12)。這種結果可以表明PEP1具有抑制作為參與TGF-β信號傳導機制的下游基因的Smad2和Smad4的表達的直接效果，并且抑制由TGF-β誘導的纖連蛋白表達，因此具有作為用于預防和治療纖維化的試劑的可能性。實施例4：PEP1在暴露于輻射的NHEK細胞系中的TGF-4抑制作用為了證實PEP1對用于抗癌治療和其它腫瘤治療的輻射暴露誘導的纖維化的影響，進行了確認PEP1在輻射暴露的NHEK中的TGF-β抑制作用的實驗。試劑和細胞系的制備制備根據實施例1合成的PEP1和作為對照的安慰劑(假手術)。將正常人表皮角化細胞(NHEK)以單層培養以用于輻射暴露實驗。對于輻射暴露實驗，使用強度為6Gy的電離輻射。實驗方法為了根據輻射暴露檢查NHEK細胞系的細胞分化，各自用安慰劑和1mMPEP1處理NHEK，然后分為暴露于輻射的組和未暴露的組，然后培養10天(參考圖13)。此外，為了檢查由于輻射暴露的NHEK細胞系的生物標志物的表達水平的變化，各自用安慰劑和1mM的PEP1處理NHEK，并分為未暴露的組(-)和輻射暴露的組(+)，然后在輻射暴露后第1天和第10天檢查生物標志物的表達水平(參見圖14)。在測量生物標志物的表達水平時，使用GAPDH作為參照對照。此外，為了在輻射暴露后連續培養NHEK時精確觀察PEP1對TGF-β信號傳導的抑制，將細胞分成其中經輻射(6Gy，IR)暴露的NHEK用安慰劑(假手術)處理的組，和1μMPEP1治療組，然后培養10天。通過對TGF-β和纖維化相關生物標志物進行蛋白質印跡來觀察各標志物的表達水平(參考圖15)。蛋白質印跡方法如下。肽處理的細胞用PBS洗滌兩次，使用細胞刮刀收集到1.5mL離心管中，然后離心(1,000rpm，4℃，2分鐘)。除去得到的上清液后，向NHEK中加入100μLRIPA緩沖液。將細胞在冰上培養40分鐘，并每10分鐘進行渦旋(預先在4℃冷卻的微型離心機)，然后使用1ml注射器將樣品攪拌40至50次。最后，將樣品在13,000rpm下離心15分鐘，得到上清液。通過8％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將30g蛋白轉移至PVDF膜(Millipore)。PVDF膜用5％脫脂乳封閉，并與特異性一抗溫育。實驗中使用的抗體如下：纖連蛋白(285kDa，5％BSA1∶3000，ab2413，Abcam)，N-鈣粘蛋白(140kDa，5％BSA1∶1000，#4061，CellSignaling)，Smad4(70kDa，5％BSA1∶1000，#9515，CellSignaling)，Smad2/3(60，52kDa，5％BSA1∶1000，#3102，CellSignaling)，P-Akt(60kDa，5％BSA1∶1000，#9271，CellSignaling)，pSmad2/3(CellSignaling#3102)，GRHL2(Abcam#ab15532)，GAPDH(37kDa，5％BSA1∶1000，#2118，CellSignaling)。隨后，用含有0.1％Tween-20(TBST)的tris緩沖鹽水洗滌PVDF膜，并與HRP綴合的抗兔抗體(JacksonImmunoResearchLaboratories，INC。)反應。然后，進行ECL檢測(AmershamPharmaciaBiotech)，并使用圖像分析儀(GEHealthcare，ImageQuantLAS4000)分析獲得的圖像。實驗結果在根據輻射暴露的NHEK細胞系中的細胞分化的實驗中，在輻射暴露后，對照顯示分化(纖維化發展)，但是即使在輻射暴露后，PEP1處理組幾乎沒有顯示分化。這些結果表明，由輻射暴露引起的纖維化的進展可以通過PEP1施用來抑制。在觀察根據輻射暴露的NHEK細胞系中生物標志物的表達水平變化的實驗中，在每個實驗組中觀察到輻射暴露后10天生物標志物GRHL2、p63和N-Cad的增加的表達水平。這表明具有TGF-β信號傳導抑制作用的生物標志物GRHL2和p63的表達水平在安慰劑處理組中降低，在PEP1處理組中升高。這些結果表明，PEP1增加了GRHL2和p63的表達，所述GRHL2和p63在輻射暴露后對參與纖維化發展的TGF-β信號傳導具有抑制作用。同時，在纖維化組織中表達的生物標記物N-Cad的表達水平在安慰劑(假手術)處理組中增加，在PEP1處理組中降低。在PEP1處理組中，作為表示細胞存活程度的生物標志物的P-Akt的表達水平(Akt(蛋白激酶B)的磷酸化)增加。這些結果表明，PEP1不僅可以通過輻射暴露抑制纖維化發展，而且還可以參與細胞存活機制。從實驗的結果，PEP1提高GRHL2和p63的表達以抑制TGF-β信號傳導過程，因此纖維化能夠被由輻射暴露引起的TGF-β信號傳導抑制。因此，可以看出PEP1具有作為用于預防或治療由輻射暴露和組織細胞的纖維化引起的纖維化的藥物的可能性。實施例5：PEP1的體外和體內輻射防御效應和組織纖維化抑制作用的驗證試劑、細胞系和實驗動物的制備制備根據實施例1合成的PEP1和用作對照的安慰劑(假手術)。將NHEK以單層培養以制備體外輻射暴露實驗。對于體外、原位和體內輻射暴露實驗，在0至10Gy(0、2、4、6、8和10Gy)的各種強度下使用電離輻射。同時，將實驗動物分成兩個動物模型。第一個模型是口腔粘膜炎模型，其通過將頭部和頸部暴露于輻射(6Gy，IR)連續5天誘導每個C3H小鼠的舌頭的潰瘍來制備。第二模型是皮膚纖維化模型，其通過誘導局部硬皮病來制備，即通過皮下注射0.1cc的在0.9％NaCl水溶液中的博萊霉素(已知是肺纖維化原因)稀釋液，濃度為0.5mg/ml，每天一次，持續24至28天。實驗方法和結果在NHEK細胞系上進行體外和原位實驗以證實PEP1對輻射暴露損傷的防御效應，并且顯示當將NHEK分成組，每組用安慰劑或PEP1處理，然后暴露于范圍從0至10Gy(0、2、4、6、8和10Gy)的各種強度輻射時，確認了表現出由輻射誘導早衰(RIPS)、DNA損傷反應(DDR)蛋白以及衰老相關異染色質病灶(SAHF)的標志物表示的輻射暴露損傷的標記物的表達水平。使用qRT-PCR、蛋白質印跡和免疫熒光染色測量每個標記的表達水平。為了測量這些水平，使用衰老相關的β-半乳糖苷酶(SAβ-Gal)、p16INK4A、p-p53Ser15、p-ATM、γ-H2AX、53BP1、H3K9me3、HP1γ和HMGA2作為標記物。同時，為了通過體外實驗證實在NHEK細胞系中通過TGF-β或博來霉素處理誘導的組織纖維化的PEP1抑制作用，用安慰劑和PEP1中的每一種處理NHEK，使最終濃度為10μg/ml，培養，每48小時用TGF-β和博來霉素處理，然后使用qRT-PCR和蛋白質印跡測量纖連蛋白(FN)和1型膠原(Col1α1)的表達水平。對于體內實驗，首先，在第一口腔粘膜炎模型中，將C3H小鼠分組，每組用安慰劑或PEP1進行腹膜內處理，得到最終劑量為1mg/kg并暴露于輻射(6Gy，IR)連續五天以誘導對應于口腔粘膜炎的舌頭潰瘍。10天后，處死小鼠以收集舌組織，用甲苯胺藍染色并通過H&E染色，以進行活檢。此外，使用用雷帕霉素以5mg/kg/天的劑量處理5天的比較對照，進行了相對檢查PEP1作用的實驗。同時，在第二皮膚纖維化模型中，將C3H小鼠分組，每組用安慰劑或PEP1進行腹膜內處理，以得到50mg/kg的最終劑量，并以在實驗動物制備中提及的博萊霉素濃度進行皮下處理24至28天。28天后，處死小鼠以檢測硬皮病，隨后進行使用Masson三色染色檢查纖維化擴散的實驗。根據體外和體內動物模型實驗，可以看出PEP1處理對輻射暴露損傷表現出防御效應。具體而言，根據體外實驗，可以看出通過標記表達的抑制表明，PEP1具有RIPS抑制作用，并且根據體內實驗，可以看出通過活檢表明，PEP1針對暴露于輻射和誘導組織纖維化具有防御效應。根據實驗實施例，可以看出，根據本發明的PEP1和包含PEP1的組合物具有預防或治療由于各種原因(包括TGF-β信號傳導、由癌癥引起的組織纖維化、用抗癌劑治療和輻射暴露)在各種區域中發生的與細胞纖維化有關的衰老和疾病的作用。因此，可以得出結論，能夠使用根據本發明的PEP1和包含PEP1的組合物開發用于預防或治療纖維化相關衰老和疾病的治療劑或治療方法。當前第1頁1 2 3