本(ben)發(fa)明涉及一種(zhong)羧(suo)肽(tai)酶a固定(ding)化(hua)的制備方法(fa)，屬于固定(ding)化(hua)酶技術，適用(yong)于醫藥、食品等工業領域。

背景技術：

羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)是(shi)(shi)一(yi)種專一(yi)性地從肽(tai)(tai)(tai)(tai)鏈的(de)(de)(de)(de)(de)c端逐(zhu)個(ge)降解(jie)(jie)(jie)、釋(shi)放游離(li)(li)氨(an)基(ji)(ji)酸的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)類肽(tai)(tai)(tai)(tai)鏈外切酶(mei)(mei)(mei)。在(zai)動(dong)物(wu)、植物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)組織器官中(zhong)(zhong)，羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)發(fa)揮著重要的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)理功能，被廣泛應(ying)用(yong)(yong)(yong)于醫藥、食(shi)品等工(gong)業領域(yu)。羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)a是(shi)(shi)一(yi)類存在(zai)于細(xi)胞外的(de)(de)(de)(de)(de)金屬羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)，在(zai)中(zhong)(zhong)性或弱堿性條(tiao)件(jian)下(xia)具有(you)極大(da)活性能釋(shi)放c末端氨(an)基(ji)(ji)酸(除脯氨(an)酸、羥脯氨(an)酸、精氨(an)酸和(he)賴氨(an)酸)，對具有(you)芳香族側鏈和(he)大(da)脂肪側鏈的(de)(de)(de)(de)(de)羧(suo)(suo)基(ji)(ji)端氨(an)基(ji)(ji)酸具有(you)很強水解(jie)(jie)(jie)能力(li)。在(zai)醫藥領域(yu)，由于羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)廣泛參(can)與(yu)機體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)化(hua)反應(ying)，可(ke)通過體(ti)(ti)內羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)檢測(ce)達到(dao)診(zhen)斷和(he)治(zhi)療疾病(bing)的(de)(de)(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)，可(ke)用(yong)(yong)(yong)于體(ti)(ti)內不(bu)良物(wu)質(毒素等)的(de)(de)(de)(de)(de)降解(jie)(jie)(jie)。在(zai)食(shi)品工(gong)業，可(ke)用(yong)(yong)(yong)于食(shi)品和(he)飼(si)料中(zhong)(zhong)赭曲霉素(ota)的(de)(de)(de)(de)(de)去(qu)除、制(zhi)備(bei)高f值寡肽(tai)(tai)(tai)(tai)、用(yong)(yong)(yong)作脫苦(ku)味劑等。羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)a是(shi)(shi)最早被發(fa)現能夠降解(jie)(jie)(jie)ota的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)種酶(mei)(mei)(mei)，其(qi)降解(jie)(jie)(jie)產物(wu)為(wei)(wei)赭曲霉毒素α和(he)l-β-苯基(ji)(ji)丙(bing)氨(an)酸，且無(wu)進一(yi)步的(de)(de)(de)(de)(de)降解(jie)(jie)(jie)，產物(wu)對機體(ti)(ti)基(ji)(ji)本(ben)無(wu)毒性。因此(ci)羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)a常被用(yong)(yong)(yong)于食(shi)品工(gong)業中(zhong)(zhong)去(qu)除ota。然而游離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)a穩定性差、易失活、不(bu)能重復使用(yong)(yong)(yong)，并(bing)且反應(ying)后分(fen)離(li)(li)純(chun)化(hua)困(kun)難，使其(qi)難以(yi)更為(wei)(wei)廣泛的(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)際(ji)應(ying)用(yong)(yong)(yong)。此(ci)外，分(fen)離(li)(li)和(he)提純(chun)酶(mei)(mei)(mei)以(yi)及(ji)重復使用(yong)(yong)(yong)性差又大(da)大(da)增加了(le)其(qi)作為(wei)(wei)催化(hua)劑的(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)本(ben)。因此(ci)，固定化(hua)羧(suo)(suo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)酶(mei)(mei)(mei)a是(shi)(shi)實(shi)現其(qi)在(zai)實(shi)際(ji)中(zhong)(zhong)應(ying)用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)關鍵。

目前羧肽(tai)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)固定(ding)化(hua)(hua)(hua)研究除了(le)(le)傳(chuan)統的(de)(de)(de)固定(ding)化(hua)(hua)(hua)方(fang)法(fa)外主要(yao)集中(zhong)在定(ding)點固定(ding)化(hua)(hua)(hua)方(fang)面，但這種(zhong)固定(ding)化(hua)(hua)(hua)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)方(fang)式成本(ben)較(jiao)高(gao)，不適宜應(ying)(ying)用(yong)于醫藥(yao)、食品領域應(ying)(ying)用(yong)；而目前傳(chuan)統的(de)(de)(de)物(wu)(wu)理(li)化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)固定(ding)化(hua)(hua)(hua)方(fang)法(fa)應(ying)(ying)用(yong)存在諸(zhu)多問題。如物(wu)(wu)理(li)吸(xi)附法(fa)中(zhong)酶(mei)(mei)與(yu)載(zai)體相(xiang)互作(zuo)用(yong)力(li)弱、酶(mei)(mei)易(yi)脫落，反(fan)復(fu)利用(yong)性差；包埋法(fa)容易(yi)發生化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)聚合反(fan)應(ying)(ying)，導致酶(mei)(mei)活(huo)(huo)力(li)損失，并且該方(fang)法(fa)要(yao)求底(di)物(wu)(wu)和產物(wu)(wu)是可以自由通過(guo)高(gao)分子凝膠(jiao)的(de)(de)(de)網(wang)格擴(kuo)散的(de)(de)(de)小(xiao)分子，限制了(le)(le)大分子的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)和底(di)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)應(ying)(ying)用(yong)等。而化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)法(fa)固定(ding)化(hua)(hua)(hua)方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)缺(que)點是載(zai)體需(xu)要(yao)活(huo)(huo)化(hua)(hua)(hua)及提前處理(li)；固定(ding)化(hua)(hua)(hua)操作(zuo)比較(jiao)復(fu)雜；反(fan)應(ying)(ying)條件比較(jiao)強烈；化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)修飾(shi)時易(yi)造成酶(mei)(mei)失活(huo)(huo)；蛋白質(zhi)通過(guo)氨基酸側鏈功能(neng)基團(tuan)參加(jia)共價連接往(wang)往(wang)會引起酶(mei)(mei)分子的(de)(de)(de)結構變(bian)化(hua)(hua)(hua)從而導致活(huo)(huo)力(li)降低(di)，需(xu)要(yao)嚴格控制條件才能(neng)獲(huo)得活(huo)(huo)力(li)較(jiao)高(gao)的(de)(de)(de)固定(ding)化(hua)(hua)(hua)酶(mei)(mei)。

技術實現要素：

本發(fa)明的(de)目的(de)在于克服現(xian)有技術的(de)缺陷(xian)，提供一(yi)種簡(jian)(jian)單(dan)可(ke)實(shi)際(ji)應用的(de)羧肽(tai)酶固定(ding)化(hua)(hua)方(fang)法，該(gai)方(fang)法具有工藝簡(jian)(jian)單(dan)、成(cheng)本低，固定(ding)化(hua)(hua)酶性質穩定(ding)、固定(ding)化(hua)(hua)效率(lv)高和酶活回(hui)收率(lv)高等特點。

本發(fa)明通過羧肽酶a吸附(fu)-交(jiao)聯(lian)復(fu)合的(de)固(gu)定(ding)化方案實(shi)現，其步驟如下：

(1)酒精浸泡活化ab-8樹脂作為固定化材料(liao)；

(2)將(1)中活化的材(cai)料加入磷酸緩沖液，調ph為6.0至8.0，在一定溫度(du)條件下，將羧肽酶與固定化載體(ti)進行吸附；

(3)將(jiang)吸附酶后的載體(ti)在一定溫度(du)下采用戊二醛交聯(lian)；

(4)將(2)中所得的(de)固定化酶冷(leng)凍干燥后即可(ke)。

所述步驟(zou)(2)中(zhong)活化的材料加(jia)入的磷酸緩沖液(ye)體系，ph為7.5。

所(suo)述步(bu)驟(2)中(zhong)羧(suo)肽(tai)酶與固(gu)定(ding)化材(cai)料進行吸附的溫度為20～45℃；吸附時間(jian)為3～18h

所述(shu)步(bu)驟(3)中羧(suo)肽(tai)酶與(yu)固定化材料進行交(jiao)聯的戊二醛濃(nong)度為(wei)0.05～0.55％、交(jiao)聯時間(jian)1～6h、交(jiao)聯溫度為(wei)4～37℃。

所述羧肽(tai)酶為(wei)(wei)黑曲霉羧肽(tai)酶a，羧肽(tai)酶a生(sheng)產菌為(wei)(wei)大腸(chang)桿菌基因工程菌。

上(shang)述方法制備的酶制劑其最(zui)適ph為3.5～11.0，最(zui)適溫度25～80℃。

優選的，制備的酶制劑其最適ph為6.0～8.0，最適溫(wen)度35～45℃。

本發明(ming)相對(dui)現有技術具(ju)有以下優點：

(1)發明使用吸附-交聯復合固定(ding)化技術，成本較(jiao)低，反應溫和，酶活回收率高。

(2)固定(ding)化(hua)酶其溫度穩定(ding)性提高5℃。固定(ding)化(hua)后(hou)，酶促反(fan)應vmax無顯(xian)著下降，催化(hua)效(xiao)率略高于游離酶。

(3)吸(xi)附-交(jiao)聯復(fu)合(he)固(gu)定化方式有效改(gai)善了載體對蛋白的(de)(de)粘附能力(li)，酶(mei)的(de)(de)固(gu)定化效果更(geng)好。

附圖說明

圖(tu)1酶固定(ding)化吸附樹(shu)脂的選擇

圖2ab-8樹脂原(yuan)樣(a)、乙醇處理后(hou)(hou)(b)以及酶(mei)吸附后(hou)(hou)(c)的電(dian)鏡觀(guan)察結果

圖3酶固定化(hua)最佳吸附(fu)時間的確定

圖4酶(mei)固定化吸附溫度的選擇(ze)

圖5酶固(gu)定化(hua)戊二醛濃度的確(que)定

圖6酶固定(ding)化(hua)交聯時間的確定(ding)

圖7酶固(gu)定化(hua)交聯溫度的確定

圖8固(gu)定(ding)化酶(mei)的最適ph

圖9固定化酶的溫度穩定性

圖10固定化酶(mei)的最適反應溫(wen)度

圖(tu)11固定化酶(mei)的溫(wen)度穩定性

圖(tu)12金屬離子及螯合(he)劑對固定化(hua)酶活性的(de)影響

圖13固(gu)定化酶酶催(cui)動(dong)力(li)學

具體實施方式

本(ben)發明以下結合具體實例作進一步(bu)說明，但并不是(shi)限制本(ben)發明。下面結合附圖對本(ben)發明進一步(bu)說明。實施例中(zhong)未注明具體條件(jian)的實驗(yan)方(fang)法，通常(chang)可按(an)常(chang)規條件(jian)，或按(an)照試(shi)劑(ji)盒生產商(shang)所建(jian)議的條件(jian)進行(xing)。本(ben)領域相關的技術人(ren)員可以借助實施例更好地理解(jie)和(he)掌握本(ben)發明。

試劑材料：赭曲霉毒素(su)a(ota)購(gou)自北京(jing)泰樂祺，甲醇(色譜(pu)純)、乙(yi)腈(色譜(pu)純)及(ji)乙(yi)酸(suan)(色譜(pu)純)購(gou)自merk公(gong)司(si)，s-8、ab-8、d4020、d201gf、d152大(da)孔樹脂(勤(qin)實科技)，重組羧肽酶(實驗室保存)

實施例1：固定化酶(mei)對ota解毒能力優(you)化其(qi)固定化條件

1.1固(gu)定化酶解毒能力測定

ota測(ce)(ce)定(ding)主要通過(guo)高效液相(xiang)(xiang)色(se)譜進(jin)行，反應(ying)體系(xi)與(yu)甲醇水(色(se)譜純(chun)甲醇∶純(chun)凈(jing)水＝7∶3)按體積(ji)比1∶1混(hun)合，過(guo)0.22μm有機濾膜后即(ji)完成樣(yang)品制備。hplc測(ce)(ce)定(ding)ota條件：進(jin)樣(yang)量20μl，流(liu)量0.5ml/min，流(liu)動相(xiang)(xiang)乙(yi)腈∶水∶乙(yi)酸＝99∶99∶2，熒光檢(jian)測(ce)(ce)器(qi)激(ji)發(fa)波長(chang)333nm，發(fa)射(she)波長(chang)460nm。

固(gu)定(ding)(ding)化酶2ml降(jiang)解反(fan)應體(ti)系(xi)：ota終濃(nong)度為1μg/ml，加入0.5g固(gu)定(ding)(ding)化的(de)酶，其(qi)余(yu)用ph7.5磷酸鹽緩沖液(ye)補齊。將反(fan)應體(ti)系(xi)在37℃下保溫1h，采用bradford蛋(dan)白(bai)濃(nong)度測定(ding)(ding)試劑盒檢測蛋(dan)白(bai)濃(nong)度。計(ji)算固(gu)定(ding)(ding)化酶的(de)蛋(dan)白(bai)含量，計(ji)算脫毒能力(式1)。

1.2吸(xi)附(fu)載體(ti)的選擇

選(xuan)擇五種具有代(dai)表性的(de)大孔樹脂(zhi)分別經(jing)過酸堿(jian)浸泡和(he)乙醇活化(hua)(hua)，選(xuan)擇100μl上(shang)樣量，37℃、180r/min吸(xi)附(fu)8h，0.25％戊二醛37℃交聯4h為(wei)(wei)初始固定化(hua)(hua)條件，依(yi)照(zhao)1.1中方(fang)法測(ce)定吸(xi)附(fu)前后(hou)游離蛋(dan)白的(de)含(han)量，計算出載體上(shang)吸(xi)附(fu)酶蛋(dan)白的(de)含(han)量，之(zhi)后(hou)根(gen)據1.1中方(fang)法測(ce)定固定化(hua)(hua)酶的(de)解毒(du)能力，以此(ci)計算酶活回收(shou)率(式2)作為(wei)(wei)驗證指標(biao)。

表1大孔樹脂種類

實驗選擇的(de)(de)五(wu)種大孔(kong)(kong)樹脂具有典型(xing)的(de)(de)性(xing)質(zhi)差(cha)異(yi)，酸堿洗滌及(ji)酒(jiu)精浸(jin)泡(pao)是兩種常用的(de)(de)大孔(kong)(kong)樹脂活(huo)化(hua)(hua)方法，經活(huo)化(hua)(hua)后(hou)的(de)(de)大孔(kong)(kong)樹脂吸(xi)附(fu)交聯重組(zu)酶(mei)(mei)之后(hou)，測定(ding)解毒(du)能(neng)力并計算(suan)酶(mei)(mei)活(huo)回(hui)收率，結果如圖1所示。經spss顯著性(xing)分(fen)析，證(zheng)明(ming)兩種活(huo)化(hua)(hua)方法大體上差(cha)異(yi)性(xing)不(bu)明(ming)顯，不(bu)同(tong)樹脂的(de)(de)吸(xi)附(fu)對(dui)固定(ding)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)活(huo)性(xing)影響較大，從(cong)實際操作方向來看，酒(jiu)精浸(jin)泡(pao)法的(de)(de)操作方便，因此(ci)選擇酒(jiu)精浸(jin)泡(pao)活(huo)化(hua)(hua)的(de)(de)ab-8樹脂作為固定(ding)化(hua)(hua)吸(xi)附(fu)材料。

利用掃描電鏡觀(guan)察吸附前后載(zai)(zai)體(ti)(ti)表(biao)面(mian)的(de)(de)變化(hua)，結果(guo)如圖2所(suo)示。可以(yi)看(kan)(kan)出與(yu)原樣相比，乙醇處理之(zhi)后，載(zai)(zai)體(ti)(ti)表(biao)面(mian)的(de)(de)孔隙(xi)更多并且表(biao)面(mian)更為粗糙，更有(you)利于(yu)酶的(de)(de)吸附；而(er)經固定化(hua)之(zhi)后，載(zai)(zai)體(ti)(ti)表(biao)面(mian)的(de)(de)空(kong)隙(xi)基本(ben)被(bei)填平，可以(yi)很明顯的(de)(de)看(kan)(kan)出酶在(zai)載(zai)(zai)體(ti)(ti)表(biao)面(mian)附著，表(biao)明吸附成功。

1.3固(gu)定(ding)化條件的優化

1.3.1最佳吸附時(shi)間

以確(que)定的(de)(de)(de)ab-8樹(shu)脂(zhi)作為(wei)實驗材(cai)料(liao)，將吸(xi)附(fu)(fu)(fu)時(shi)間(jian)(jian)作為(wei)單(dan)一變化因素，選(xuan)(xuan)擇3、6、9、12、15及18h作為(wei)吸(xi)附(fu)(fu)(fu)時(shi)間(jian)(jian)，計(ji)算(suan)不(bu)同吸(xi)附(fu)(fu)(fu)時(shi)間(jian)(jian)下的(de)(de)(de)酶活(huo)回收率，選(xuan)(xuan)擇最佳吸(xi)附(fu)(fu)(fu)條(tiao)件。結(jie)果(guo)(guo)如圖3所示。經(jing)spss顯(xian)著(zhu)性(xing)分析可知，吸(xi)附(fu)(fu)(fu)時(shi)間(jian)(jian)對固定化效果(guo)(guo)的(de)(de)(de)影響較明顯(xian)，吸(xi)附(fu)(fu)(fu)時(shi)間(jian)(jian)為(wei)12h時(shi)酶活(huo)回收率最高，可達(da)到99.07％，12h后各結(jie)果(guo)(guo)之間(jian)(jian)差異不(bu)顯(xian)著(zhu)，這(zhe)可能(neng)由于已經(jing)達(da)到載體最大載量，考慮到節約與環保，選(xuan)(xuan)擇12h為(wei)最佳吸(xi)附(fu)(fu)(fu)時(shi)間(jian)(jian)。

1.3.2最佳(jia)吸(xi)附溫(wen)度(du)

以12h為吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)時(shi)間，吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)為單一變量，選(xuan)擇20、25、30、35、40及45℃作為吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)，計算不同吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)下(xia)的(de)酶(mei)活(huo)回收率，選(xuan)擇最(zui)(zui)佳吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)條件。結果如圖(tu)4所示，經spss顯(xian)著性分(fen)析可知，各(ge)結果之間差(cha)異(yi)性顯(xian)著，其中當吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)達(da)35℃時(shi)吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)效(xiao)果最(zui)(zui)好，可達(da)到(dao)98.11％。這與酶(mei)本身(shen)的(de)最(zui)(zui)適反應(ying)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)接近，因(yin)此(ci)選(xuan)擇35℃為最(zui)(zui)佳吸(xi)(xi)(xi)(xi)附(fu)(fu)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)。

1.3.3戊二醛(quan)濃度的(de)確定

酶(mei)(mei)在35℃條(tiao)件下(xia)，經固定(ding)化材料(liao)吸附12h后，將戊(wu)(wu)二醛濃(nong)度(du)(du)(du)作為(wei)(wei)(wei)單一變化因(yin)(yin)素(su)，選擇(ze)0.05、0.15、0.25、0.35、0.45及0.55％作為(wei)(wei)(wei)戊(wu)(wu)二醛濃(nong)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)，計算不(bu)同交(jiao)(jiao)聯(lian)劑(ji)濃(nong)度(du)(du)(du)下(xia)的酶(mei)(mei)活回收率(lv)，選擇(ze)最佳(jia)吸附條(tiao)件。結果如圖5，經spss顯著性分析(xi)確(que)定(ding)結果之間差異(yi)性顯著。戊(wu)(wu)二醛作為(wei)(wei)(wei)交(jiao)(jiao)聯(lian)劑(ji)用(yong)固定(ding)化酶(mei)(mei)，但是高濃(nong)度(du)(du)(du)戊(wu)(wu)二醛會導致酶(mei)(mei)活力下(xia)降，因(yin)(yin)此(ci)(ci)選擇(ze)較低濃(nong)度(du)(du)(du)戊(wu)(wu)二醛設置溫(wen)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)進行優化。由結果可知，當(dang)交(jiao)(jiao)聯(lian)劑(ji)濃(nong)度(du)(du)(du)達到0.35％時，固定(ding)化效(xiao)果最好達到84.97％，因(yin)(yin)此(ci)(ci)選擇(ze)0.35％為(wei)(wei)(wei)最佳(jia)戊(wu)(wu)二醛濃(nong)度(du)(du)(du)。

1.3.4最(zui)佳交聯時間

酶在35℃條件下，經(jing)固定化(hua)材料吸附(fu)12h后(hou)以0.35％的(de)戊二(er)(er)醛(quan)進(jin)行(xing)交(jiao)聯。將(jiang)交(jiao)聯時(shi)間作為(wei)(wei)單一(yi)變化(hua)因素，選擇1、2、3、4、5及(ji)6h作為(wei)(wei)戊二(er)(er)醛(quan)濃度梯(ti)度，計算(suan)不同(tong)交(jiao)聯時(shi)間下的(de)酶活(huo)回(hui)收率，選擇最佳吸附(fu)條件。結果如圖6所(suo)示，經(jing)spss顯著性(xing)分析，各結果之(zhi)間差異不顯著，證明交(jiao)聯時(shi)間對重組酶固定化(hua)的(de)影響較(jiao)小(xiao)，考慮到(dao)實際操作中的(de)效率及(ji)節約性(xing)，選擇交(jiao)聯時(shi)間為(wei)(wei)1h。

1.3.5最佳(jia)交聯溫度

酶(mei)在35℃條件下，經固定(ding)化材料吸附12h后以(yi)0.35％的(de)戊二醛交聯(lian)1h。將(jiang)交聯(lian)溫(wen)(wen)(wen)度(du)設計為單一變化因素，選擇(ze)4、16、25及(ji)37℃作為交聯(lian)溫(wen)(wen)(wen)度(du)，計算不同交聯(lian)時間下的(de)酶(mei)活回(hui)收率，選擇(ze)最(zui)佳吸附條件。結果(guo)如圖7所示，經spss顯(xian)著性(xing)分析可知，各結果(guo)之間差異不明顯(xian)，表明交聯(lian)溫(wen)(wen)(wen)度(du)對固定(ding)化效果(guo)的(de)影響不明顯(xian)，按照(zhao)實際(ji)操作中的(de)方(fang)便以(yi)及(ji)環保(bao)節約的(de)態度(du)，選擇(ze)室溫(wen)(wen)(wen)25℃為交聯(lian)溫(wen)(wen)(wen)度(du)。

選擇ab-8樹脂作為(wei)固定(ding)化(hua)材料(liao)。將酶在(zai)35℃條件下，經(jing)固定(ding)化(hua)材料(liao)吸附12h后以0.35％的戊二醛(quan)在(zai)25℃下交聯1h的最優條件下對(dui)固定(ding)化(hua)酶連續進行5次ota降(jiang)解(jie)(jie)反應，結果驗證其解(jie)(jie)毒(du)能(neng)力基本一致(zhi)，表明(ming)該固定(ding)方法得到的固定(ding)化(hua)酶具(ju)有穩定(ding)性較好，固定(ding)化(hua)效率高，酶活回收率(大(da)于84％)高等特點(dian)。

實施例2：固(gu)定(ding)化羧肽酶性質(zhi)

2.1酶反(fan)應(ying)最(zui)適ph及ph穩定性

最適(shi)ph：配(pei)制8種(zhong)(zhong)0.2m緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)使其(qi)ph范圍覆蓋3.5-11.0，各段ph范圍分別(bie)是醋(cu)酸(suan)(suan)-醋(cu)酸(suan)(suan)鈉(na)緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ph3.5-5.5)；檸檬酸(suan)(suan)-檸檬酸(suan)(suan)鈉(na)緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ph5.0-6.5)；pbs緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ph6.0-8.5)；mops緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ph6.5-8.0)；tris-hcl緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ph8.0-9.0)；ches緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ph8.5-10.5)；甘(gan)氨酸(suan)(suan)-naoh緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(9.0-10.0)；caps緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ph9.0-11.0)。每(mei)種(zhong)(zhong)緩(huan)沖(chong)(chong)體系有3-6個點不等(deng)，共33個點。固定(ding)化前后的(de)羧肽酶解(jie)毒能力的(de)測(ce)定(ding)均在37℃下進(jin)行，將常規方法中的(de)緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)替換(huan)為上述不同ph體系的(de)緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)，測(ce)定(ding)其(qi)解(jie)毒能力。

ph穩定(ding)性：用(yong)上述不同ph體系(xi)的緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)對酶液(ye)以一定(ding)比(bi)例稀(xi)釋，使酶處于不同的緩(huan)沖(chong)(chong)條件，37℃下保溫2h后1∶1加入甲醇水終止反應，之后參考1.1中(zhong)方(fang)法對固定(ding)化羧肽酶進行解毒(du)能(neng)力測(ce)定(ding)，得到的結果(guo)如圖(tu)8所(suo)示，pbs緩(huan)沖(chong)(chong)體系(xi)與其它緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)體系(xi)相比(bi)優勢較大，在ph7.0的pbs緩(huan)沖(chong)(chong)體系(xi)中(zhong)重組(zu)羧肽酶的解毒(du)能(neng)力達到最(zui)大值，并(bing)且結果(guo)差異性顯著，這與未固定(ding)的酶相比(bi)，最(zui)適ph增大0.5。

固定(ding)化羧肽(tai)酶在(zai)(zai)同樣(yang)范圍內的(de)(de)(de)ph緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)中(zhong)保(bao)溫4h后測定(ding)解毒能力，結(jie)果如圖9所示，在(zai)(zai)pbs緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)下重(zhong)組(zu)羧肽(tai)酶的(de)(de)(de)解毒能力仍舊(jiu)具有較強(qiang)的(de)(de)(de)優勢，在(zai)(zai)ph7.0的(de)(de)(de)pbs緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)中(zhong)解毒能力依舊(jiu)最高，與最適ph相(xiang)似，未固定(ding)的(de)(de)(de)酶相(xiang)比(bi)同樣(yang)增(zeng)大0.5。

2.2固定(ding)化(hua)酶反應最(zui)適(shi)溫度(du)(du)及溫度(du)(du)穩定(ding)性

最適(shi)溫度(du)：用(yong)最適(shi)ph緩沖(chong)液(ye)將酶液(ye)以一定比(bi)例稀釋，然后分別在25～80℃的不同溫度(du)下，反應(ying)1h，測定羧(suo)肽酶的解毒能力。

溫(wen)度穩定性(xing)：用最適(shi)ph緩沖(chong)液將酶液以一定比(bi)例(li)稀釋(shi)，選取(qu)不同溫(wen)度處(chu)理4h后1∶1加入甲(jia)醇(chun)水終止反應，測定羧肽酶的解毒能力。

固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)化羧(suo)肽(tai)酶(mei)在(zai)ph7.5的(de)pbs緩沖體系中(zhong)參(can)考1.1中(zhong)方(fang)法(fa)分別在(zai)各溫度梯度下反(fan)應1h，測定(ding)(ding)(ding)解毒(du)能(neng)力，結(jie)果如圖(tu)10所示。固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)化羧(suo)肽(tai)酶(mei)在(zai)40℃時(shi)的(de)解毒(du)能(neng)力達到最大(da)值(zhi)，這未(wei)固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)的(de)酶(mei)基本相同(tong)，但固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)化酶(mei)的(de)最適溫度范圍(wei)在(zai)35-45℃。當固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)化酶(mei)在(zai)80℃下反(fan)應時(shi)，基本沒有降解能(neng)力，推(tui)測固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)化酶(mei)的(de)失活(huo)溫度低于未(wei)固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)的(de)酶(mei)。

在(zai)同樣的(de)(de)溫度梯度下，分別對固(gu)(gu)定(ding)化羧肽(tai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)保(bao)溫4h后，參照1.1中(zhong)方(fang)法測定(ding)解毒能力(li)，結果如圖11所(suo)示。在(zai)25℃-65℃的(de)(de)條件下，固(gu)(gu)定(ding)化酶(mei)(mei)(mei)(mei)活(huo)力(li)基本太大(da)變化，這個(ge)范圍比未固(gu)(gu)定(ding)的(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)提高了(le)5℃，70℃保(bao)溫4h后，固(gu)(gu)定(ding)化酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)解毒能力(li)不(bu)足原先的(de)(de)10％，因此驗證之前(qian)的(de)(de)推測，70℃基本上為固(gu)(gu)定(ding)化酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)失活(huo)溫度低于(yu)未固(gu)(gu)定(ding)的(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)。

2.3固定化(hua)酶(mei)反應金屬離子及螯合劑的作用

酶活力在不同的金屬離子的作用下，酶活力也會顯示有所不同，分別將na2⁺、k⁺、mg²⁺、sn⁴⁺、mn²⁺、fe²⁺、fe³⁺、al³⁺、ca²⁺、cu²⁺、li⁺、zn²⁺以及(ji)螯合劑(ji)edta加(jia)入(ru)0.2m、ph7.5的pbs緩沖(chong)液(ye)中，使金屬(shu)離子(zi)終濃度(du)(du)達到0.1mm/l、1mm/l、5mm/l以及(ji)10mm/l，以此(ci)金屬(shu)離子(zi)緩沖(chong)液(ye)配制(zhi)ota降解反(fan)應(ying)體系，37℃反(fan)應(ying)2h，以未加(jia)金屬(shu)離子(zi)和(he)螯合劑(ji)的pbs反(fan)應(ying)體系下的解毒能力為100％，計算(suan)不(bu)同濃度(du)(du)金屬(shu)離子(zi)和(he)螯合劑(ji)對解毒能力的影(ying)響(xiang)。

金屬離子對固定化酶活性的影響具有激活和抑制作用。同樣將固定化酶分別置于12種金屬離子及edta螯合劑作用下的緩沖體系中測定解毒能力，結果如圖12所示。k⁺，na⁺對固定化酶有一定的促進作用，但zn²⁺對固定化酶同的作用不明顯。其余的金屬離子以及edta螯合劑則沒有促進作用，cu²⁺離子(zi)的抑制作用較為明顯。

2.4固定化(hua)前后(hou)酶促動力學參數(shu)的變化(hua)

將固定(ding)(ding)化(hua)(hua)羧肽酶(mei)(mei)a置(zhi)于不同(tong)ota濃度(du)下(xia)反(fan)應并(bing)測定(ding)(ding)其解(jie)毒能力(li)，根(gen)(gen)據米氏方程v＝vmax×[s]/(km+[s])，用雙倒數(shu)(shu)法作(zuo)圖，即以酶(mei)(mei)促(cu)反(fan)應的(de)倒數(shu)(shu)1/v對(dui)底物(wu)濃度(du)的(de)倒數(shu)(shu)1/[s]作(zuo)一直線，根(gen)(gen)據其斜率及截距(ju)求km及vmax，同(tong)時計算kcat值，研究酶(mei)(mei)的(de)催(cui)(cui)化(hua)(hua)效(xiao)(xiao)率。結(jie)果如圖13所示：固定(ding)(ding)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)km值為(wei)(wei)11.50μg/ml，vmax為(wei)(wei)97.09μg/mg，kcat值為(wei)(wei)324，固定(ding)(ding)化(hua)(hua)之(zhi)后(hou)酶(mei)(mei)的(de)催(cui)(cui)化(hua)(hua)效(xiao)(xiao)率為(wei)(wei)28.17。而未(wei)固定(ding)(ding)的(de)酶(mei)(mei)酶(mei)(mei)促(cu)動(dong)力(li)學參數(shu)(shu)km值為(wei)(wei)0.67μg/ml，vmax為(wei)(wei)111.1μg/mg，kcat值為(wei)(wei)18.52，催(cui)(cui)化(hua)(hua)效(xiao)(xiao)率為(wei)(wei)27.64。固定(ding)(ding)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)與未(wei)固定(ding)(ding)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)的(de)酶(mei)(mei)促(cu)動(dong)力(li)學參數(shu)(shu)結(jie)果相比表明(ming)：重組酶(mei)(mei)經固定(ding)(ding)化(hua)(hua)之(zhi)后(hou)，酶(mei)(mei)對(dui)底物(wu)的(de)親和力(li)有所下(xia)降，酶(mei)(mei)促(cu)反(fan)應的(de)vmax無顯(xian)著下(xia)降，固定(ding)(ding)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)的(de)催(cui)(cui)化(hua)(hua)效(xiao)(xiao)率較未(wei)固定(ding)(ding)前提高，這(zhe)說明(ming)對(dui)羧肽酶(mei)(mei)a進(jin)行吸附-交(jiao)聯的(de)復合(he)固定(ding)(ding)化(hua)(hua)方法效(xiao)(xiao)果良(liang)好。