一種具有ace抑制活性的核桃肽及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食源性蛋白深加工技術領域，涉及一種以核桃渣為原料制備具有ACE 抑制活性的核桃肽及其方法。
【背景技術】
[0002] 核桃又名胡桃、羌桃，與扁桃、腰果、榛子并列為世界著名的四大干果，具有很高的 食用價值，在國外，核桃被稱為健腦之果、長壽之果、美容之果。核桃的藥用價值也很高，中 醫應用廣泛。我國醫學認為核桃性溫、味甘、無毒，有健胃、補血、潤肺、養神等功效。核桃是 公認的優質植物蛋白資源，核桃蛋白的營養價值與動物蛋白相近。因此，為了很好地開發核 桃資源，對核桃蛋白功能性質的研究極為重要。核桃仁營養豐富，根據對核桃仁成分的分 析，核桃中除油脂占到65% -70%外，核桃優質蛋白質含量占到14% -17%，其可消化率達 85%。核桃蛋白質還含有18種氨基酸，除含有人體必需的8種氨基酸外，精氨酸、谷氨酸、 組氨酸和酪氨酸的含量也比較高，高的精氨酸攝入量和較低的賴氨酸與精氨酸比值均可有 效降低動脈粥樣硬化和冠心病的發生。制備生物活性肽的方法主要包括化學水解法和生物 酶解法。生物酶解法與化學水解法相比，具有反應條件溫和、氨基酸受損較少、可以獲得特 定肽段的優勢。研究表明：采用適當的蛋白酶對食源性蛋白進行水解，可獲得具有一定生物 活性的肽，其活性主要包括抗氧化、提高免疫力、降血壓活性等。降血壓肽其來源很廣泛，有 大豆、玉米、小麥、水產、乳清蛋白等等，目前已從牛乳蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、腐乳、絲蛋 白、豌豆蛋白、膠原蛋白、蜂王漿、蛋黃及魚貝類蛋白等食物蛋白的酶解產物或發酵制品中 分離得到了各種ACE抑制肽，然而以核桃仁為原料制備的低分子肽制品卻寥寥無幾。
[0003] 核桃一直被作為一種益智類食品深受消費者的青睞，開發核桃蛋白肽又可以增加 產品附加值。另外，我國是核桃生產最大的國家，核桃制油后廢棄了大量的核桃渣，采用核 桃渣為原料開發核桃蛋白肽，原料非常豐富，價格低廉，可滿足大規模工業化生產，同時減 少了資源的浪費，提高了核桃制品的附加值，有效地彌補了核桃深加工的欠缺。所以，研究 開發核桃生物活性肽具有廣闊的前景。
[0004] 目前已有發明專利涉及酶解核桃蛋白制備核桃降血壓肽的技術，但均從不同方面 體現出一定的不足：（1)這些技術制備的核桃活性肽進行純化后的氨基酸序列鑒定，這對 于研究者理解產品的生物學機制具有一定的限制；（2)有的產品活性較低、有的產品純度 較低，對于活性肽的深度開發應用具有一定的限制性；（3)有的技術并未涉及最終產品的 干燥技術，這對于實現產品的工業化生產具有一定的障礙；有的技術使用的干燥技術為傳 統的噴霧干燥技術，對于活性肽產品的活性可能具有一定的影響。

【發明內容】

[0005] 根據目前核桃蛋白肽開發利用中存在的技術問題，本發明提供了一種具有ACE抑 制活性的核桃肽及其制備方法。本發明對于核桃蛋白產品多樣化、核桃生物活性肽在功能 性食品、保健食品或者藥品中的開發利用具有重要的意義。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0007] -種具有ACE抑制活性的核桃肽的制備方法，以核桃渣為原料，選取合適的蛋白 酶、根據最佳酶解工藝制備核桃降血壓肽粗產品、采用膜技術耦合層析技術對核桃降血壓 肽進行精細化制備、并采用高效液相色譜法進一步純化制備、并采用真空冷凍干燥技術或 者低溫噴霧干燥技術進行最終產品的制備。具體制備步驟如下：
[0008] 一、核桃渣前處理：取壓榨油后的核桃渣（也稱為核桃柏）進行粉碎，過30~100 目篩子，得粉碎核桃渣樣品。
[0009] 二、核桃粗蛋白的制備：取粉碎后核桃渣與3~5倍重量的水混合，浸泡10~30 分鐘后制漿，然后用lmol/LNaOH將其pH調至7. 5~9. 0，在45~65°C水浴中攪拌0. 5~ 2h，3000~6000rpm離心lOmin，去除油層提取上清液，將上清液的pH調到4~5,靜置30~ 60min后，4000~8000rpm離心15~30min，采用適量去離子水洗滌至中性（pH7. 0)，獲得 核桃粗蛋白，用95 %的乙醇洗滌兩次，冷凍干燥備用。
[0010] 三、活性肽的酶解制備：⑴配制質量百分比為3~5%的核桃蛋白溶液，充分攪 拌，調節pH為1.2~2.0 ; (2)按照質量百分比為2~3%的添加量加入胃蛋白酶，35~ 40 °C水浴1~2h，反應過程中調控體系pH保持在1. 2~2. 0 ; (3)反應結束后，調pH至4. 5， 4000~8000rpm離心5~lOmin，取上清液，調pH至7. 0,經過3-5kD的再生纖維素膜過濾， 取穿透液保存在4°C環境中備用。
[0011] 四、核桃活性肽的初步純化制備：（1)首先采用凝膠過濾層析純化：取超濾后的核 桃多肽用超純水配成10~20mg/mL，經0? 1或者0? 22ym膜過濾，樣品經SephadexG-15凝 膠層析柱分離，裝載的樣品體積為柱體積的2~10% (根據樣品濃度調整），洗脫溶液采用 超純水，洗脫速度為2~5mL/min，洗脫液體積為柱體積的1~3倍，檢測波長為220nm。采 用高效液相色譜法進行活性檢測，對ACE具有較高抑制活性的即視為具有較高活性。收集 活性較高的組分并采用截留分子量為500D的再生纖維素膜進行濃縮。（2)再采用離子交 換層析進行純化：濃縮后的樣品進一步采用強陰離子交換層析HiTrapMonoQ進行純化。 該層析柱預先用pH為8. 0的Tris-HCl溶液平衡（緩沖溶液A)，緩沖溶液B為含有0. 5~ lmol/LNaCl的緩沖溶液A。裝載的樣品體積為柱體積的20%~50% (根據樣品濃度及填 料的飽和吸附量進行調整），采用兩步線性洗脫的方式進行洗脫，采用含有30~50%緩沖 溶液B的混合溶液線性洗脫10~20倍柱體積，再用100 %緩沖溶液B線性洗脫5~8倍柱 體積，洗脫流速0.5~2mL/min。檢測波長為220nm。采用高效液相色譜法進行活性檢測， 對ACE具有較高抑制活性的即視為具有較高活性。收集活性較高的組分并采用截留分子量 為500D的再生纖維素膜進行濃縮。
[0012] 五、核桃活性肽的精致純化制備：采用高效液相色譜法對核桃活性肽進行精致純 化：將由離子交換層析純化得到的具有較強活性的樣品按照重量體積比為1~5 : 1(W/V) 溶于含有〇. 1~〇. 2 %三氟乙酸（TFA)的超純水中，采用0. 1~0. 22ym濾膜過濾。流動相 A為0. 1~0. 2%TFA-H20,流動相B為0. 1~0. 2%TFA-CH3CN，所用洗脫溶劑需采用0. 1~ 0. 22ym濾膜過濾并超聲處理，防止色譜柱中產生氣泡。待基線平穩后開始上樣，上樣量為 50~100yL。色譜柱為硅膠烷基鍵合相C18柱（9. 4mmX250mm，膠粒大小5ym，孔徑大小 為300目）。采用二元流動相梯度洗脫系統，在30~50min內，流動相B在洗脫劑中的含量 從0%到100%按線性關系增長。系統流速0.5~3.5，檢測波長21511111，室溫檢測。 收集各組分進行活性檢測，其中活性最高組分經過多次制備收集。
[0013] 六、核桃活性肽的干燥：高活性組分收集后，采用截留分子量為500D的再生纖維 素膜進行濃縮并通過真空冷凍干燥法進行核桃活性肽的制備，控制冷阱溫度-73~-40°C， 真空度0. 01~0. 5mbar，時間3~24h，制得產品即為具有ACE抑制活性的核桃肽產品； 或者通過低溫噴霧干燥進行，活性多肽溶液的固形物含量范圍為15~40%，真空度達 到-0. 01~-0. 06MPa，進風溫度為95~145°C，進料速度根據機器情況進行調整，物料溫度 控制在30~60 °C。
[0014] 相關檢測方法：
[0015] ⑴多肽（蛋白質）含量測定：
[0016] 采用凱氏定氮法測定各類樣品中多肽（蛋白質）含量。
[0017] (2)蛋白質提取率計算：
[0018]
[0021] (4)樣品活性測定：
[0022] 高效液相色譜法測定肽活性：取不同濃度的溶液10yL，加入5yLACE溶液，在 37°C條件下保持5min后加入50yLHHL溶液開始反應，在37°C條件下反應30min后加入 85yLI. 0m〇L/LHC1中止反應，得到反應液。將該反應液用0. 45ym濾膜過濾后用于HPLC 分析。同時用10yLpH8. 3的硼酸緩沖液替代溶液制備反應液，作為空白對照組。色譜條 件：zORBAx300SB-C18分析用色譜柱（4. 6mmi.d.X150_，填料粒徑為5ym)，柱溫25°C， 流動相為乙腈-超純水（體積比為25 : 75,各含0.05% (體積分數）三氟乙酸及0.1% (體積分數）三乙胺），流速0. 5mL/min，檢測波長228nm，自動進樣，進樣量5yL。對應的實 驗結果見表1。
[0023] 不同濃度的經過純化的核桃降血壓肽對ACE酶的抑制率情況