本發明涉及(ji)藥物化(hua)學領域，特別是指一種激(ji)肽釋放(fang)酶7小分子抑制劑及(ji)其(qi)制備方(fang)法、用途。

背景技術：

特(te)應性(xing)皮(pi)(pi)炎(yan)(AD)是(shi)一種廣泛(fan)傳播的(de)(de)(de)慢性(xing)炎(yan)癥(zheng)性(xing)皮(pi)(pi)膚病(bing)(bing)，特(te)點是(shi)干燥(zao)、鱗狀皮(pi)(pi)膚、炎(yan)癥(zheng)、皮(pi)(pi)膚滲透性(xing)增加，AD病(bing)(bing)人的(de)(de)(de)皮(pi)(pi)膚對環境中(zhong)常見(jian)的(de)(de)(de)而對正常人無(wu)害的(de)(de)(de)因(yin)素也(ye)會很敏感(gan)從(cong)而易(yi)于(yu)受到表面感(gan)染。在(zai)過(guo)去的(de)(de)(de)30年間工業化國家的(de)(de)(de)特(te)應性(xing)皮(pi)(pi)炎(yan)的(de)(de)(de)發病(bing)(bing)率(lv)增長了(le)2到3倍，據估計兒童的(de)(de)(de)特(te)應性(xing)皮(pi)(pi)炎(yan)患病(bing)(bing)率(lv)達到了(le)15-30％，成人的(de)(de)(de)特(te)應性(xing)皮(pi)(pi)炎(yan)患病(bing)(bing)率(lv)達到了(le)2-10％。由于(yu)發病(bing)(bing)機制的(de)(de)(de)復(fu)雜性(xing)，對AD的(de)(de)(de)發病(bing)(bing)機制了(le)解得不多，但(dan)皮(pi)(pi)膚屏障功能(neng)紊(wen)亂已經被證(zheng)實是(shi)AD發展過(guo)程(cheng)中(zhong)的(de)(de)(de)關鍵因(yin)素之一。

皮(pi)膚(fu)屏障的(de)穩(wen)定依賴(lai)于顆(ke)粒(li)(li)層的(de)角質形(xing)成細胞分化為(wei)角質細胞和(he)皮(pi)膚(fu)表層角質細胞脫落(即脫屑(xie))之(zhi)間(jian)的(de)平(ping)衡(heng)，皮(pi)膚(fu)的(de)脫屑(xie)過程包括(kuo)由(激(ji)肽釋放(fang)酶)KLKs參與的(de)橋粒(li)(li)的(de)降解，由于橋粒(li)(li)是角質細胞的(de)粘連蛋白，橋粒(li)(li)的(de)降解則會導致角質細胞脫落而致皮(pi)膚(fu)脫屑(xie)。證據顯示(shi)，局部或暫時性(xing)的(de)KLKs活性(xing)控(kong)制(zhi)的(de)失(shi)調(diao)，是AD病人皮(pi)膚(fu)屏障穩(wen)定缺失(shi)的(de)主要原因之(zhi)一。

KLKs(Kallikreins，激肽釋放酶(mei)(mei))是具(ju)有(you)胰蛋白酶(mei)(mei)或胰凝乳蛋白酶(mei)(mei)特異性的(de)絲氨酸蛋白酶(mei)(mei)，其編(bian)碼基因定位于(yu)19q13.4，編(bian)碼15個分泌型絲氨酸蛋白酶(mei)(mei)KLK 1-KLK 15。已經證明，KLKs存(cun)(cun)在于(yu)正常人的(de)角質(zhi)層細胞中(zhong)(zhong)，目前發現，至少(shao)有(you)8種KLK(KLK 5，KLK 6，KLK 7，KLK 8，KLK 10，KLK 11，KLK13和KLK 14)存(cun)(cun)在于(yu)人的(de)角質(zhi)層和汗液(ye)中(zhong)(zhong)。

其中，KLK7占總量的40％。KLK7可(ke)能(neng)是皮膚損(sun)傷的一個(ge)關(guan)鍵酶，而且在AD病人中它可(ke)能(neng)參與(yu)一個(ge)系統性炎(yan)癥反應(ying)，在AD的角質層KLK7升高最為(wei)突出，這提示KLK7在AD的發病機制上可(ke)能(neng)是至關(guan)重(zhong)要(yao)的，因此(ci)，抑制KLK7的活性對于AD的治(zhi)療顯得(de)最為(wei)重(zhong)要(yao)。

LEKTI(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor,淋(lin)巴上皮(pi)組織Kazal型相關(guan)蛋(dan)白(bai)(bai)抑(yi)制(zhi)劑)是由(you)SPINK5基因編碼(ma)的絲氨酸蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)劑家族的成員，LEKTI前體包含(han)一個(ge)(ge)信號(hao)肽和彼此隔(ge)開(kai)的15個(ge)(ge)絲氨酸蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)域(D1-D15)，表(biao)達(da)后(hou)迅速被弗林蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)水解為幾(ji)個(ge)(ge)蛋(dan)白(bai)(bai)片段，其中包含(han)D6-D9抑(yi)制(zhi)域的LEKTI能抑(yi)制(zhi)胰(yi)蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)、胰(yi)凝乳蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)、KLK5和KLK7等酶(mei)(mei)(mei)的活(huo)性。LEKTI的內源靶至少(shao)包括(kuo)KLK5、KLK7和KLK14，它(ta)們(men)共同參與皮(pi)膚的脫屑過程。在(zai)AD病人，LEKTI表(biao)達(da)水平嚴重降低，導致了KLK7活(huo)性的異常升高。

盡(jin)管LEKTI是(shi)表皮(pi)內KLK7的天然抑制劑，但(dan)作(zuo)為治療AD的外(wai)用(yong)藥(yao)，其(qi)不能透過皮(pi)膚(fu)角質(zhi)層，同時由于其(qi)大分子蛋白質(zhi)的特性(xing)也會(hui)導(dao)致其(qi)降(jiang)解(jie)速度過快，因而將LEKTI作(zuo)為外(wai)用(yong)藥(yao)作(zuo)用(yong)非常有(you)限。并且，到(dao)目前為止，還沒有(you)一種有(you)效的KLK7小分子抑制劑應用(yong)于臨床。因此(ci)，如果能得(de)到(dao)作(zuo)為皮(pi)膚(fu)外(wai)用(yong)藥(yao)的KLK7的小分子抑制劑，將有(you)助于AD的治療。

技術實現要素：

有(you)鑒(jian)于(yu)此(ci)，本發(fa)明的(de)(de)目的(de)(de)在于(yu)提出(chu)一種激肽釋放酶7小分子(zi)抑(yi)制劑及其制備方(fang)法(fa)、用途，其作為小分子(zi)抑(yi)制劑能有(you)效抑(yi)制KLK7，具有(you)應(ying)用于(yu)制備特應(ying)性皮炎的(de)(de)治療藥物的(de)(de)前景。

本發明(ming)通過以(yi)KLK7作(zuo)為(wei)靶分子，根(gen)據KLK7的晶體結構，以(yi)及藥效團模型進行分析與篩選，合成出具有KLK7抑(yi)制作(zuo)用(yong)的小(xiao)分子化(hua)合物，經實驗(yan)驗(yan)證，該(gai)化(hua)合物具有顯著的抑(yi)制KLK7作(zuo)用(yong)。

基于上述目的本發(fa)明提供的激肽釋(shi)放酶7小分子抑制劑的化合物(wu)結構由式(I)表示：

基于相(xiang)同的(de)發明構(gou)思，本發明還提供了激肽釋放酶(mei)7小分子(zi)抑制劑的(de)制備方法(fa)，包(bao)括以(yi)下步驟：

步驟1)化合物(Ⅱ)溶解于70％-98％(質量分數)H₂SO₄中，滴加70％-98％(質量分數)H₂SO₄與50％-98％(質量分數)HNO₃形成的混酸(suan)，控溫30℃以下，反應4-6小時，得化(hua)合物(Ⅲ)，倒入冰水中，過濾得化(hua)合物(Ⅲ)粗品，過柱分離(li)得化(hua)合物(Ⅲ)；

步驟2)向反應瓶(ping)中(zhong)(zhong)加入(ru)水，鐵粉，5％-37％(質量分數)鹽酸，控溫80-100℃，分批(pi)加入(ru)化(hua)合物(Ⅲ)，反應2-3小(xiao)時，以碳酸鈉中(zhong)(zhong)和，過柱分離(li)得化(hua)合物(Ⅳ)；

步驟3)向反(fan)(fan)應瓶中加入(ru)化合物(Ⅳ)、乙醚(mi)、三乙胺，再滴(di)加丁(ding)二酰氯，室(shi)溫反(fan)(fan)應1-3小時，過(guo)柱(zhu)分(fen)離(li)得化合物(Ⅴ)；

步(bu)驟(zou)4)向反應瓶中加入化(hua)合物(wu)(Ⅴ)，四氫(qing)呋喃，在0℃下加入硼氫(qing)化(hua)鈉，加畢，室溫(wen)下反應4-5小時(shi)，過(guo)柱(zhu)分離(li)得化(hua)合物(wu)(Ⅵ)；

步驟5)向反應瓶中加(jia)入化(hua)(hua)(hua)合物(wu)(Ⅵ)和85％(質量(liang)分(fen)數(shu)(shu))磷酸，在140-180℃反應1-3小時，加(jia)入1％-20％(質量(liang)分(fen)數(shu)(shu))氫氧化(hua)(hua)(hua)鈉溶液游離出(chu)化(hua)(hua)(hua)合物(wu)(Ⅶ)，過(guo)柱分(fen)離得化(hua)(hua)(hua)合物(wu)(Ⅶ)；

步驟6)中(zhong)間體化(hua)合物(wu)(Ⅷ)的合成：向反應(ying)瓶中(zhong)加入(ru)2,4-二甲基苯胺、乙(yi)醚(mi)、三乙(yi)胺，再滴加4-氯代丁酰氯，室溫反應(ying)1-3小時(shi)，過柱分(fen)離(li)得化(hua)合物(wu)(Ⅷ)；

步驟7)反應瓶中加入化(hua)合物(Ⅶ)、化(hua)合物(Ⅷ)、甲苯、碳酸鉀，回流反應3-4小時(shi)，過(guo)柱分離得化(hua)合物(I)。

優選地，在步驟1)中，所述的混酸中H₂SO₄(折100％)與HNO₃(折100％)的摩爾比為1:1。

可(ke)選(xuan)地，在(zai)步驟2)中(zhong)，所述(shu)水(不(bu)含鹽酸中(zhong)的水)、鐵粉(fen)、HCl(折100％)的摩(mo)爾(er)比為20～30:2～5:0.1～0.5。

可選地(di)，在步驟3)中，所述化合物(Ⅳ)、乙醚、三乙胺、丁二酰氯的摩爾比為0.5～2:3～6:1.5～3.5:0.5～2。

可選地，在步驟4)中，所(suo)述化合物(Ⅴ)、硼(peng)氫化鈉(na)、四氫呋喃(nan)的摩爾(er)(er)比為1:0.1～1.0:50～300(摩爾(er)(er)比)，過柱分(fen)離得化合物(Ⅵ)。

可(ke)選地，在步驟5)中，所述化合(he)物(Ⅵ)、磷酸(折100％)的摩爾(er)比是0.5～2:1～3。

可選地，在步驟6)中，2,4-二甲基(ji)苯胺、乙醚、三(san)乙胺、4-氯(lv)代丁(ding)酰氯(lv)的摩爾比為0.5～2:3～5:1～3:0.5～2。

可選地，在步驟7)中，所述(shu)化(hua)合物(wu)(Ⅶ)、化(hua)合物(wu)(Ⅷ)、碳酸鉀(jia)、甲(jia)苯的摩(mo)爾比為0.5～2:1～1.5:0.5～2:8～12。

基于相同的發明(ming)(ming)構思，本發明(ming)(ming)還提(ti)供(gong)了上述(shu)激(ji)肽釋(shi)放(fang)(fang)酶7小(xiao)分(fen)子抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑的應(ying)用，即將所述(shu)激(ji)肽釋(shi)放(fang)(fang)酶7小(xiao)分(fen)子抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑用于抑制(zhi)(zhi)(zhi)激(ji)肽釋(shi)放(fang)(fang)酶7的活(huo)性(xing)，制(zhi)(zhi)(zhi)備治療特應(ying)性(xing)皮(pi)炎的藥物(wu)。

基于相同的發明構思，本發明還提供(gong)了一(yi)種治療特應性皮(pi)炎的藥物(wu)組合(he)物(wu)，其中含有(you)所述(shu)的激(ji)肽(tai)釋放酶7小分子抑制劑(ji)作為有(you)效成(cheng)分。

優選地，上述藥物組合(he)物為外用膏劑或外用噴霧(wu)制劑。

從上面(mian)所述可以看出，本發(fa)明提供的激(ji)肽釋(shi)放酶7小(xiao)(xiao)分(fen)子(zi)抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)及其制(zhi)備方(fang)法(fa)、用途，該抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)為小(xiao)(xiao)分(fen)子(zi)抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)，避免了(le)傳統(tong)KLK7的天然抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)作為治療(liao)AD的外(wai)用藥(yao)時由于分(fen)子(zi)大(da)而(er)不能透(tou)過皮膚角質層、吸收慢降解快等(deng)問題，該小(xiao)(xiao)分(fen)子(zi)抑(yi)制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)合成方(fang)法(fa)簡單，操作方(fang)便，吸收快，有效抑(yi)制(zhi)KLK7，具有應用于臨床(chuang)特應性皮炎的治療(liao)藥(yao)物的制(zhi)備前景(jing)。

附圖說明

圖1為本發明的實施例所涉及的激肽釋放酶7小分子抑制劑的IC₅₀曲線擬合圖；

圖(tu)2為本發(fa)明(ming)的(de)(de)實施例所涉及(ji)的(de)(de)激肽釋放酶7小(xiao)分子抑(yi)制劑的(de)(de)核磁圖(tu)。

具體實施方式

為使本(ben)發明(ming)的(de)目(mu)的(de)、技術方案和優點(dian)更加清(qing)楚明(ming)白，以下結合具體實施例，并參照附(fu)圖，對本(ben)發明(ming)進一(yi)步詳細說明(ming)。

實施(shi)例1：激肽釋放酶7小分子抑制劑(ji)的制備

1.0mol化合物(Ⅱ)溶解于2.0mol濃H₂SO₄中，滴加1.0mol濃H₂SO₄與1.0mol濃HNO₃形成的混酸(suan)，控溫30℃以下，反應4小時(shi)，得化(hua)合(he)(he)物(wu)(Ⅲ)，倒(dao)入冰(bing)水(shui)中，過濾(lv)得化(hua)合(he)(he)物(wu)(Ⅲ)粗(cu)品，過柱分(fen)離得化(hua)合(he)(he)物(wu)(Ⅲ)。

向反應瓶(ping)中加入(ru)25mol水，3.0mol鐵粉，0.3molHCl(氯化(hua)(hua)氫(qing)折100％，濃度37％)，控溫90℃，分批加入(ru)化(hua)(hua)合(he)物(Ⅲ)，反應3小(xiao)時，以碳酸鈉中和，過(guo)柱(zhu)分離得(de)化(hua)(hua)合(he)物(Ⅳ)。

向反(fan)應瓶中加入化(hua)合物(Ⅳ)，乙(yi)醚(mi)，三(san)乙(yi)胺(an)，再滴加丁二酰(xian)氯(lv)，室(shi)溫反(fan)應2小時，化(hua)合物(Ⅳ)：乙(yi)醚(mi)：三(san)乙(yi)胺(an)：丁二酰(xian)氯(lv)＝1:5:2.5:1(摩爾比)，過柱(zhu)分離得化(hua)合物(Ⅴ)。

向反應瓶中(zhong)加(jia)入化(hua)合(he)(he)物(wu)(wu)(Ⅴ)，四氫呋(fu)喃，在(zai)0℃下加(jia)入硼氫化(hua)鈉(na)，加(jia)畢，室溫(wen)下反應4小時，化(hua)合(he)(he)物(wu)(wu)(Ⅴ)：硼氫化(hua)鈉(na)：四氫呋(fu)喃＝1:0.3:200(摩爾比)，過(guo)柱分(fen)離得化(hua)合(he)(he)物(wu)(wu)(Ⅵ)。

向反應(ying)瓶中加入化(hua)合物(wu)(Ⅵ)，磷(lin)酸(suan)(含量85％)，化(hua)合物(wu)(6)：磷(lin)酸(suan)(折(zhe)100％)＝1：2.5(摩爾(er)比(bi))，加畢(bi)，在160℃反應(ying)2小時，加入氫氧化(hua)鈉(na)溶(rong)液(ye)游離出(chu)堿性化(hua)合物(wu)(Ⅶ)，過柱分離得化(hua)合物(wu)(Ⅶ)。

向反(fan)應瓶中加入(ru)2,4-二(er)甲基苯(ben)(ben)胺，乙醚，三乙胺，再(zai)滴加4-氯代(dai)丁酰(xian)氯，室溫反(fan)應2小時，2,4-二(er)甲基苯(ben)(ben)胺：乙醚：三乙胺：4-氯代(dai)丁酰(xian)氯＝1:5:1.5:1(摩爾比(bi))，過(guo)柱分(fen)離得化合(he)物(Ⅷ)。

向(xiang)反(fan)應瓶中加(jia)入(ru)化(hua)合(he)物(wu)(Ⅶ)，化(hua)合(he)物(wu)(Ⅷ)，甲苯(ben)，碳(tan)酸(suan)鉀(jia)，回流反(fan)應3小時，化(hua)合(he)物(wu)(Ⅶ)：化(hua)合(he)物(wu)(Ⅷ)：碳(tan)酸(suan)鉀(jia)：甲苯(ben)＝1.0:1.2:1.0:10.0(摩爾(er)比)，過(guo)柱分離得化(hua)合(he)物(wu)(I)。

圖(tu)2本(ben)發明(ming)的實施例所涉及的激肽(tai)釋放酶7小分子抑制劑的核磁(ci)圖(tu)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：9.19(s，RNHR)，6.29-7.20(m，8H，Ar-H)，4.48(t，2H，CCH₂N)，2.56，2.25(s，3H，3H，Py-CH₃)，2.23，2.12(s，3H，3H，Ph-CH₃)，2.36(t，2H，OCCH₂R)，2.18(m，2H，CH₂CH₂CH₂)。

實施例(li)2：激肽釋放酶7小分(fen)子抑制劑的制備

1.0mol化合物(Ⅱ)溶解于2.0mol濃H₂SO₄中，滴加1.0mol濃H₂SO₄與1.0mol濃HNO₃形成(cheng)的混酸，控溫(wen)30℃以(yi)下，反應6小時，得(de)化(hua)合(he)(he)物(Ⅲ)，倒入冰(bing)水中，過(guo)濾得(de)化(hua)合(he)(he)物(Ⅲ)粗品(pin)，過(guo)柱分離(li)得(de)化(hua)合(he)(he)物(Ⅲ)。

向反(fan)應瓶中(zhong)加入(ru)20mol水，2.0mol鐵粉，0.1molHCl(氯化(hua)氫折100％，濃度37％)，控溫(wen)90℃，分(fen)批加入(ru)化(hua)合(he)物(Ⅲ)，反(fan)應2小時，以碳酸鈉(na)中(zhong)和(he)，過柱分(fen)離得化(hua)合(he)物(Ⅳ)。

向(xiang)反應(ying)(ying)瓶(ping)中加入(ru)化(hua)合物(Ⅳ)，乙(yi)醚，三(san)乙(yi)胺，再滴加丁二酰氯，室溫(wen)反應(ying)(ying)2小(xiao)時，化(hua)合物(Ⅳ)：乙(yi)醚：三(san)乙(yi)胺：丁二酰氯＝0.5:3:1.5:0.5(摩(mo)爾比)，過柱(zhu)分離得化(hua)合物(Ⅴ)。

向反(fan)應(ying)瓶中加入化(hua)合(he)物(Ⅴ)，四氫(qing)呋喃(nan)，在(zai)0℃下加入硼氫(qing)化(hua)鈉(na)，加畢，室溫(wen)下反(fan)應(ying)5小(xiao)時，化(hua)合(he)物(Ⅴ)：硼氫(qing)化(hua)鈉(na)：四氫(qing)呋喃(nan)＝1:0.3:200(摩(mo)爾比(bi))，過柱分離得(de)化(hua)合(he)物(Ⅵ)。

向反應(ying)瓶中(zhong)加(jia)入化(hua)(hua)合(he)物(wu)(Ⅵ)，磷酸(含量85％)，化(hua)(hua)合(he)物(wu)(6)：磷酸(折(zhe)100％)＝0.5:1(摩爾比)，加(jia)畢，在160℃反應(ying)2小時，加(jia)入氫氧化(hua)(hua)鈉(na)溶液游離(li)(li)出堿性化(hua)(hua)合(he)物(wu)(Ⅶ)，過柱(zhu)分離(li)(li)得化(hua)(hua)合(he)物(wu)(Ⅶ)。

向(xiang)反應瓶中加入2,4-二甲基苯胺，乙(yi)醚(mi)，三(san)乙(yi)胺，再滴(di)加4-氯(lv)代丁(ding)酰氯(lv)，室溫反應2小時(shi)，2,4-二甲基苯胺：乙(yi)醚(mi)：三(san)乙(yi)胺：4-氯(lv)代丁(ding)酰氯(lv)＝0.5:3:1:0.5(摩爾(er)比)，過柱(zhu)分離得(de)化合物(Ⅷ)。

向反應瓶中加入化合(he)物(wu)(wu)(wu)(Ⅶ)，化合(he)物(wu)(wu)(wu)(Ⅷ)，甲(jia)苯，碳酸鉀，回流反應4小時，化合(he)物(wu)(wu)(wu)(Ⅶ)：化合(he)物(wu)(wu)(wu)(Ⅷ)：碳酸鉀：甲(jia)苯＝0.5:1:0.5:8(摩爾比)，過柱(zhu)分(fen)離(li)得化合(he)物(wu)(wu)(wu)(I)。

圖2本發(fa)明的實(shi)施例(li)所涉及的激肽釋放酶(mei)7小分子抑制劑的核(he)磁圖。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：9.19(s，RNHR)，6.29-7.20(m，8H，Ar-H)，4.48(t，2H，CCH₂N)，2.56，2.25(s，3H，3H，Py-CH₃)，2.23，2.12(s，3H，3H，Ph-CH₃)，2.36(t，2H，OCCH₂R)，2.18(m，2H，CH₂CH₂CH₂)。

實施例3：激(ji)肽釋放酶(mei)7小分子抑制(zhi)劑的制(zhi)備

1.0mol化合物(Ⅱ)溶解于2.0mol濃H₂SO₄中，滴加1.0mol濃H₂SO₄與1.0mol濃HNO₃形成的混酸(suan)，控(kong)溫30℃以下，反應6小時，得化合物(wu)(Ⅲ)，倒(dao)入冰(bing)水中，過(guo)濾(lv)得化合物(wu)(Ⅲ)粗品(pin)，過(guo)柱分離得化合物(wu)(Ⅲ)。

向(xiang)反應瓶中(zhong)加(jia)(jia)入30mol水，5mol鐵(tie)粉，0.5molHCl(氯化(hua)氫折100％，濃度(du)37％)，控溫90℃，分批加(jia)(jia)入化(hua)合物(Ⅲ)，反應3小時，以(yi)碳酸鈉(na)中(zhong)和，過柱分離得化(hua)合物(Ⅳ)。

向(xiang)反(fan)應瓶中加入化(hua)合(he)(he)物(Ⅳ)，乙醚(mi)，三乙胺(an)，再(zai)滴加丁二酰氯(lv)，室溫(wen)反(fan)應2小時，化(hua)合(he)(he)物(Ⅳ)：乙醚(mi)：三乙胺(an)：丁二酰氯(lv)＝2:6:3.5:2(摩爾(er)比)，過柱分離得化(hua)合(he)(he)物(Ⅴ)。

向反應瓶中加入化(hua)合(he)物(wu)(Ⅴ)，四氫呋喃，在0℃下加入硼氫化(hua)鈉，加畢，室溫下反應5小時，化(hua)合(he)物(wu)(Ⅴ)：硼氫化(hua)鈉：四氫呋喃＝1:0.3:200(摩爾比)，過柱分離得化(hua)合(he)物(wu)(Ⅵ)。

向反(fan)應瓶中加入化(hua)(hua)合物(Ⅵ)，磷(lin)酸(含量85％)，化(hua)(hua)合物(6)：磷(lin)酸(折100％)＝2：3(摩爾(er)比)，加畢(bi)，在160℃反(fan)應2小時，加入氫氧化(hua)(hua)鈉溶液游離出堿性化(hua)(hua)合物(Ⅶ)，過柱分離得(de)化(hua)(hua)合物(Ⅶ)。

向(xiang)反應(ying)(ying)瓶中加入2,4-二(er)(er)甲基苯(ben)胺，乙(yi)醚，三乙(yi)胺，再滴加4-氯代丁酰氯，室溫反應(ying)(ying)2小時，2,4-二(er)(er)甲基苯(ben)胺：乙(yi)醚：三乙(yi)胺：4-氯代丁酰氯＝2:5:3:2(摩爾比)，過(guo)柱分離得化合物(Ⅷ)。

向反應瓶中加入化(hua)合物(wu)(wu)(Ⅶ)，化(hua)合物(wu)(wu)(Ⅷ)，甲苯，碳(tan)酸(suan)鉀，回流(liu)反應3小時，化(hua)合物(wu)(wu)(Ⅶ)：化(hua)合物(wu)(wu)(Ⅷ)：碳(tan)酸(suan)鉀：甲苯＝2:1.5:2:12(摩爾比)，過柱分離得(de)化(hua)合物(wu)(wu)(I)。

圖2本發明的實施例(li)所(suo)涉及的激肽釋放酶7小分子抑制劑的核磁圖。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：9.19(s，RNHR)，6.29-7.20(m，8H，Ar-H)，4.48(t，2H，CCH₂N)，2.56，2.25(s，3H，3H，Py-CH₃)，2.23，2.12(s，3H，3H，Ph-CH₃)，2.36(t，2H，OCCH₂R)，2.18(m，2H，CH₂CH₂CH₂)。

實施例(li)4：激(ji)肽釋放酶7小(xiao)分子抑制劑的制備

1.0mol化合物(Ⅱ)溶解于98％(質量分數)H₂SO₄中(其中含2.0mol H₂SO₄)，滴加98％(質量分數)H₂SO₄(其中含1.0mol H₂SO₄)與70％(質量分數)HNO₃(其中含1.0mol HNO₃)形成的混酸，控溫(wen)30℃以下，反應4小時，得化(hua)合物(wu)(wu)(Ⅲ)，倒入冰(bing)水中，過濾得化(hua)合物(wu)(wu)(Ⅲ)粗品，過柱分離得化(hua)合物(wu)(wu)(Ⅲ)。

向反應(ying)(ying)瓶(ping)中(zhong)加(jia)入25mol水，3.0mol鐵(tie)粉，30％(質量分(fen)數)鹽酸溶(rong)液(其中(zhong)含氯化氫0.3mol)，控溫85℃，分(fen)批加(jia)入化合物(wu)(Ⅲ)，反應(ying)(ying)3小時，以碳酸鈉中(zhong)和，過柱分(fen)離(li)得化合物(wu)(Ⅳ)。

向反應(ying)瓶中(zhong)加(jia)入化(hua)合物(wu)(Ⅳ)，乙醚，三(san)乙胺，再(zai)滴加(jia)丁二(er)酰(xian)氯，室溫反應(ying)2小時，化(hua)合物(wu)(Ⅳ)：乙醚：三(san)乙胺：丁二(er)酰(xian)氯＝1:5:2.5:1(摩爾(er)比)，過柱(zhu)分離得(de)化(hua)合物(wu)(Ⅴ)。

向反應瓶中加入化合(he)(he)物(wu)(Ⅴ)，四氫(qing)呋(fu)喃，在0℃下(xia)加入硼(peng)氫(qing)化鈉(na)，加畢(bi)，室溫下(xia)反應4小時，化合(he)(he)物(wu)(Ⅴ)：硼(peng)氫(qing)化鈉(na)：四氫(qing)呋(fu)喃＝1:0.5:200(摩爾比)，過柱分(fen)離得(de)化合(he)(he)物(wu)(Ⅵ)。

向反(fan)應瓶中加入化合物(wu)(Ⅵ)，85％(質量分數)磷(lin)酸，化合物(wu)(Ⅵ)：磷(lin)酸(折100％)＝1：2.5(摩爾比)，加畢，在160℃反(fan)應3小時(shi)，加入5％(質量分數)氫(qing)氧(yang)化鈉溶液(ye)游離(li)出(chu)化合物(wu)(Ⅶ)，過柱分離(li)得化合物(wu)(Ⅶ)。

向反(fan)應(ying)瓶中加入2,4-二甲(jia)基苯胺(an)(an)，乙(yi)(yi)醚，三乙(yi)(yi)胺(an)(an)，再滴加4-氯(lv)(lv)代丁酰(xian)氯(lv)(lv)，室溫(wen)反(fan)應(ying)2小時，2,4-二甲(jia)基苯胺(an)(an)：乙(yi)(yi)醚：三乙(yi)(yi)胺(an)(an)：4-氯(lv)(lv)代丁酰(xian)氯(lv)(lv)＝1:5:1.5:1(摩爾比)，過柱(zhu)分離得化(hua)合(he)物(Ⅷ)。

向反應(ying)瓶中加入(ru)化合(he)物(Ⅶ)，化合(he)物(Ⅷ)，甲苯，碳酸鉀(jia)，回流反應(ying)3小時，化合(he)物(Ⅶ)：化合(he)物(Ⅷ)：碳酸鉀(jia)：甲苯＝1.0:1.2:1.0:10.0(摩爾比(bi))，過柱(zhu)分離(li)得化合(he)物(I)。

圖2為本(ben)發明的實施例所涉及的激肽釋放酶7小分子抑制劑的核磁圖。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：9.19(s，RNHR)，6.29-7.20(m，8H，Ar-H)，4.48(t，2H，CCH₂N)，2.56,2.25(s，3H，3H，Py-CH₃)，2.23,2.12(s，3H，3H，Ph-CH₃)，2.36(t，2H，OCCH₂R)，2.18(m，2H,CH₂CH₂CH₂)。

實施例5：激肽(tai)釋(shi)放酶(mei)7小分子抑(yi)制劑(ji)的制備(bei)

1.0mol化合物(Ⅱ)溶解于98％(質量分數)H₂SO₄中(其中含2.0mol H₂SO₄)，滴加98％(質量分數)H₂SO₄(其中含1.0mol H₂SO₄)與65％(質量分數)HNO₃(其中含1.0mol HNO₃)形成的(de)混(hun)酸，控溫30℃以下，反應6小時(shi)，得化(hua)合物(wu)(Ⅲ)，倒入冰水(shui)中，過濾得化(hua)合物(wu)(Ⅲ)粗(cu)品，過柱分離得化(hua)合物(wu)(Ⅲ)。

向反(fan)應(ying)瓶中加入20mol水(shui)，2.0mol鐵粉，20％(質量(liang)分(fen)數)鹽酸(其中含0.1mol HCl)，控溫90℃，分(fen)批(pi)加入化合物(Ⅲ)，反(fan)應(ying)2小(xiao)時，以碳(tan)酸鈉中和，過柱分(fen)離得化合物(Ⅳ)。

向(xiang)反應瓶中(zhong)加入化合物(wu)(Ⅳ)，乙(yi)(yi)醚，三乙(yi)(yi)胺(an)，再滴加丁二(er)酰氯(lv)，室溫反應2小時，化合物(wu)(Ⅳ)：乙(yi)(yi)醚：三乙(yi)(yi)胺(an)：丁二(er)酰氯(lv)＝0.5:3:1.5:0.5(摩爾(er)比(bi))，過柱分離得化合物(wu)(Ⅴ)。

向反(fan)應(ying)瓶中加入化(hua)合物(wu)(Ⅴ)，四氫(qing)呋(fu)喃，在0℃下(xia)加入硼(peng)氫(qing)化(hua)鈉，加畢，室溫下(xia)反(fan)應(ying)5小時，化(hua)合物(wu)(Ⅴ)：硼(peng)氫(qing)化(hua)鈉：四氫(qing)呋(fu)喃＝1:0.5:200(摩爾比)，過(guo)柱分離得化(hua)合物(wu)(Ⅵ)。

向(xiang)反應瓶中加入化(hua)(hua)合(he)物(wu)(Ⅵ)，85％(質量分數)磷(lin)酸，化(hua)(hua)合(he)物(wu)(Ⅵ)：磷(lin)酸(折100％)＝0.5:1(摩爾比)，加畢，在160℃反應2小時，加入10％(質量分數)氫氧化(hua)(hua)鈉溶液游離出化(hua)(hua)合(he)物(wu)(Ⅶ)，過柱分離得(de)化(hua)(hua)合(he)物(wu)(Ⅶ)。

向反(fan)應(ying)瓶中加入2,4-二甲(jia)基苯(ben)胺(an)，乙(yi)醚(mi)，三(san)乙(yi)胺(an)，再(zai)滴(di)加4-氯代丁酰氯，室溫反(fan)應(ying)2小時(shi)，2,4-二甲(jia)基苯(ben)胺(an)：乙(yi)醚(mi)：三(san)乙(yi)胺(an)：4-氯代丁酰氯＝0.5:3:1:0.5(摩(mo)爾比)，過柱分離得化(hua)合物(Ⅷ)。

向反(fan)應(ying)瓶(ping)中加入(ru)化(hua)合物(Ⅶ)，化(hua)合物(Ⅷ)，甲苯(ben)，碳(tan)酸鉀，回流(liu)反(fan)應(ying)4小(xiao)時(shi)，化(hua)合物(Ⅶ)：化(hua)合物(Ⅷ)：碳(tan)酸鉀：甲苯(ben)＝0.5:1:0.5:8(摩爾(er)比)，過柱分(fen)離得化(hua)合物(I)。

圖2為本(ben)發明的實施例(li)所涉及的激肽釋放酶7小分子抑制(zhi)劑的核磁(ci)圖。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：9.19(s，RNHR)，6.29-7.20(m，8H，Ar-H)，4.48(t，2H，CCH₂N)，2.56,2.25(s，3H，3H，Py-CH₃)，2.23,2.12(s，3H，3H，Ph-CH₃)，2.36(t，2H，OCCH₂R)，2.18(m，2H,CH₂CH₂CH₂)。

實施例(li)6：激肽釋放(fang)酶7小分子抑制劑的制備(bei)

1.0mol化合物(Ⅱ)溶解于98％(質量分數)H₂SO₄中(其中含2.0mol H₂SO₄)，滴加98％(質量分數)H₂SO₄(其中含1.0mol H₂SO₄)與65％(質量分數)HNO₃(其中含1.0mol HNO₃)形成(cheng)的混酸(suan)，控溫30℃以(yi)下，反應(ying)6小(xiao)時，得化合(he)物(Ⅲ)，倒入冰水中(zhong)，過濾得化合(he)物(Ⅲ)粗品，過柱分離得化合(he)物(Ⅲ)。

向反應(ying)瓶中(zhong)加入30mol水，5mol鐵粉，30％(質量分數)鹽(yan)酸(其中(zhong)含0.5mol HCl)，控溫90℃，分批加入化(hua)合物(wu)(Ⅲ)，反應(ying)3小時，以碳(tan)酸鈉中(zhong)和(he)，過柱分離得化(hua)合物(wu)(Ⅳ)。

向反應(ying)瓶中加(jia)(jia)入化合(he)物(wu)(Ⅳ)，乙醚，三乙胺，再滴加(jia)(jia)丁(ding)二(er)酰氯(lv)，室(shi)溫(wen)反應(ying)2小(xiao)時，化合(he)物(wu)(Ⅳ)：乙醚：三乙胺：丁(ding)二(er)酰氯(lv)＝2:6:3.5:2(摩爾比(bi))，過柱分離得化合(he)物(wu)(Ⅴ)。

向反應(ying)瓶中加入(ru)化(hua)(hua)合物(Ⅴ)，四氫(qing)呋(fu)喃，在0℃下加入(ru)硼氫(qing)化(hua)(hua)鈉，加畢，室溫下反應(ying)5小時，化(hua)(hua)合物(Ⅴ)：硼氫(qing)化(hua)(hua)鈉：四氫(qing)呋(fu)喃＝1:0.5:200(摩爾比(bi))，過柱分(fen)離(li)得化(hua)(hua)合物(Ⅵ)。

向反應瓶(ping)中(zhong)加入化(hua)合(he)物(Ⅵ)，85％磷酸(質(zhi)量分數)，化(hua)合(he)物(Ⅵ)：磷酸(折(zhe)100％)＝2：3(摩爾(er)比)，加畢，在160℃反應2小(xiao)時，加入10％(質(zhi)量分數)氫氧化(hua)鈉溶液游離(li)出(chu)化(hua)合(he)物(Ⅶ)，過柱分離(li)得(de)化(hua)合(he)物(Ⅶ)。

向反應瓶中加(jia)入2,4-二甲基(ji)苯胺(an)，乙(yi)醚，三乙(yi)胺(an)，再滴(di)加(jia)4-氯代丁酰氯，室(shi)溫(wen)反應2小時，2,4-二甲基(ji)苯胺(an)：乙(yi)醚：三乙(yi)胺(an)：4-氯代丁酰氯＝2:5:3:2(摩(mo)爾比)，過柱分(fen)離得化合物(Ⅷ)。

向反(fan)應(ying)瓶中(zhong)加入化(hua)合(he)物(Ⅶ)，化(hua)合(he)物(Ⅷ)，甲苯，碳(tan)酸鉀(jia)，回流反(fan)應(ying)3小時，化(hua)合(he)物(Ⅶ)：化(hua)合(he)物(Ⅷ)：碳(tan)酸鉀(jia)：甲苯＝2:1.5:2:12(摩爾比)，過柱分離得化(hua)合(he)物(I)。

圖(tu)(tu)2為本發明的(de)(de)實施例所(suo)涉及(ji)的(de)(de)激肽釋放酶(mei)7小分子抑制劑的(de)(de)核磁圖(tu)(tu)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：9.19(s，RNHR)，6.29-7.20(m，8H，Ar-H)，4.48(t，2H，CCH₂N)，2.56,2.25(s，3H，3H，Py-CH₃)，2.23,2.12(s，3H，3H，Ph-CH₃)，2.36(t，2H，OCCH₂R)，2.18(m，2H,CH₂CH₂CH₂)。

實(shi)施(shi)例(li)7：激肽釋放酶7小(xiao)分子抑(yi)制(zhi)劑(ji)對(dui)KLK7的抑(yi)制(zhi)效果分析

KLK7分(fen)別與200μM和(he)50μM的激肽釋放酶7小分(fen)子抑(yi)(yi)制劑作用(yong)15分(fen)鐘(zhong)，然后(hou)加入KLK7的熒光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2，并作用(yong)15分(fen)鐘(zhong)，測(ce)(ce)酶活(huo)性(xing)，計算抑(yi)(yi)制率(lv)，抑(yi)(yi)制率(lv)＝(1-a/b)×100％，其中，a為待(dai)測(ce)(ce)樣品的酶活(huo)，b為陰(yin)性(xing)對(dui)照的酶活(huo)。

1.配制激肽釋放酶7小分子抑(yi)制劑溶(rong)液

1)將上(shang)述實施例1-6合成(cheng)的激(ji)肽釋(shi)放酶7小分子(zi)抑制劑按順序(xu)放好并(bing)編號；

2)對(dui)抑制劑粉末采(cai)用高精度(du)天平稱取0.5-1mg；

3)根據各個(ge)分子(zi)稱取的質量及其分子(zi)量計算需要加入溶劑(ji)的體積(ji)，使最終濃(nong)度為5mM；

4)采(cai)用高純度DMSO(>99％)將各個抑制劑分子(zi)溶解使最終濃度為5mM，放入(ru)-20℃冰箱儲存(cun)。

2.激肽釋(shi)放酶7小分(fen)子抑制劑對KLK7的抑制效果分(fen)析

實驗總體積100μL，其(qi)中KLK7最(zui)(zui)(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)5nM，底物最(zui)(zui)(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)為30μM，其(qi)中DMSO最(zui)(zui)(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)不超(chao)過3％(v/v)，熒光底物的濃(nong)度(du)為4.5mM。

抑(yi)制劑、酶和底(di)物作用的(de)順(shun)序為：

1)在KLK7活性buffer中讓(rang)酶和抑制劑分子(zi)在37℃作(zuo)用15分鐘。

2)15min后(hou)加入適量底(di)物，隨后(hou)在37℃下測KLK7的(de)活(huo)性(xing)15分鐘，與(yu)不含抑(yi)制劑分子的(de)陰性(xing)樣本(ben)對照，計算抑(yi)制率＝(1-a/b)×100％，a為待(dai)測樣品的(de)酶(mei)活(huo)，b為陰性(xing)對照的(de)酶(mei)活(huo)。

其中，KLK7激活buffer是經0.6057g Tris，0.11098g CaCl₂，0.8775g NaCl，0.05g Brij-35，10mL ddH₂0溶解(jie)，再定容至100mL，調節(jie)pH 7.5配制而(er)成。

所述KLK7活性buffer是經0.6057g Tris，0.585g NaCl，10mL ddH₂0溶解，再(zai)定容至100mL，調節pH 8.5配制而成(cheng)。

3.抑(yi)制劑濃度為200μM和50μM時的抑(yi)制率(lv)：

1)200μM濃度下實施例1-6制(zhi)(zhi)備的(de)激(ji)肽釋放酶7小(xiao)分子抑(yi)制(zhi)(zhi)劑對KLK7抑(yi)制(zhi)(zhi)效率均為100％；

2)將化合物(wu)(I)的(de)反應濃度降低至50μM，檢測在50μM濃度時，實施(shi)例1-6制(zhi)備的(de)激(ji)肽釋放酶7小分子抑制(zhi)劑對KLK7的(de)抑制(zhi)效率(lv)為73.61％。

實施例8：激肽釋放酶7小分子抑制劑的IC₅₀的測定

將實施例4合成的激肽釋放酶7小分子抑制劑設置成6.5、12.5、25、50、100和200μ/mol等6個濃度梯度，分別與KLK7作用15分鐘，然后加入KLK7的熒光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH₂，并作用15分鐘，測酶活性。如圖1所示，得到該化合物的IC₅₀為25.32。

化合物(I)檢測數據(ju)

可見，本發明(ming)提供的(de)激肽釋放(fang)酶7小分子(zi)抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)及(ji)其(qi)制(zhi)(zhi)(zhi)備方法(fa)、用(yong)途，該抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)為小分子(zi)抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)，能有(you)效抑制(zhi)(zhi)(zhi)KLK7，并且避免了傳統KLK7的(de)天然抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)作(zuo)為治療AD的(de)外用(yong)藥時由于分子(zi)大而不(bu)能透過(guo)皮膚角質層、吸收慢降解快(kuai)等問題(ti)，該小分子(zi)抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)合成(cheng)方法(fa)簡單(dan)，操(cao)作(zuo)方便，吸收快(kuai)，有(you)效抑制(zhi)(zhi)(zhi)KLK7，具有(you)應(ying)用(yong)于臨床特應(ying)性皮炎的(de)治療藥物的(de)制(zhi)(zhi)(zhi)備前景。

所(suo)屬領域的(de)(de)普(pu)通技術(shu)人員應當理(li)解：以(yi)(yi)上任何(he)實(shi)(shi)施(shi)例(li)(li)(li)的(de)(de)討論僅(jin)為示例(li)(li)(li)性(xing)的(de)(de)，并非旨在(zai)暗示本(ben)公開的(de)(de)范圍(包(bao)括(kuo)權利要求)被限于這些例(li)(li)(li)子；在(zai)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)思路下(xia)，以(yi)(yi)上實(shi)(shi)施(shi)例(li)(li)(li)或者不(bu)同實(shi)(shi)施(shi)例(li)(li)(li)中的(de)(de)技術(shu)特征(zheng)之間也可以(yi)(yi)進(jin)行組合，步驟可以(yi)(yi)以(yi)(yi)任意順(shun)序實(shi)(shi)現，并存在(zai)如上所(suo)述(shu)的(de)(de)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)不(bu)同方面的(de)(de)許多其它變化，為了簡(jian)明(ming)(ming)它們沒有在(zai)細節中提(ti)供。因此，凡(fan)在(zai)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)精神(shen)和原則之內，所(suo)做(zuo)的(de)(de)任何(he)省略(lve)、修改(gai)、等同替換、改(gai)進(jin)等，均應包(bao)含在(zai)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)保護(hu)范圍之內。