本發明(ming)涉及(ji)一(yi)種(zhong)血管緊張素轉化酶抑制肽及(ji)其(qi)制備提取(qu)方法。

背景技術：

高(gao)血(xue)(xue)(xue)壓(ya)是一(yi)種(zhong)世界性的(de)(de)(de)疾(ji)病，影響到(dao)大多數國家30％的(de)(de)(de)成年人口(kou)。它是最常(chang)見的(de)(de)(de)嚴重慢性疾(ji)病，是引發(fa)動脈(mo)硬化，中(zhong)風，心肌梗(geng)死和(he)(he)終末期腎臟(zang)疾(ji)病等的(de)(de)(de)重要(yao)因素(su)。血(xue)(xue)(xue)管(guan)(guan)緊(jin)張(zhang)素(su)轉化酶(angiotensinconvertingenzyme,ace)是調節(jie)外周血(xue)(xue)(xue)壓(ya)和(he)(he)電解質平(ping)衡的(de)(de)(de)關(guan)鍵酶，它能促進血(xue)(xue)(xue)管(guan)(guan)緊(jin)張(zhang)素(su)i高(gao)度有效的(de)(de)(de)轉化為(wei)血(xue)(xue)(xue)管(guan)(guan)緊(jin)張(zhang)素(su)ii，導致(zhi)血(xue)(xue)(xue)壓(ya)升高(gao)。ace抑(yi)制(zhi)劑(ji)(angiotensinconvertingenzymeinhibitor,acei)可以(yi)抑(yi)制(zhi)ace的(de)(de)(de)活性，通過動物模型和(he)(he)臨床實驗已證明其(qi)可有效的(de)(de)(de)降低(di)血(xue)(xue)(xue)壓(ya)。從(cong)天(tian)然產(chan)物中(zhong)提取的(de)(de)(de)ace抑(yi)制(zhi)肽以(yi)其(qi)穩定、安全、無副作用的(de)(de)(de)優(you)勢(shi)已經引起了廣泛的(de)(de)(de)興趣，快速、高(gao)效的(de)(de)(de)從(cong)天(tian)然產(chan)物中(zhong)純化ace抑(yi)制(zhi)肽將(jiang)對治療(liao)高(gao)血(xue)(xue)(xue)壓(ya)有著(zhu)非(fei)常(chang)重要(yao)的(de)(de)(de)作用。但小分(fen)子肽所處環(huan)境(jing)復(fu)雜且濃度很(hen)低(di)，特(te)別是雜質特(te)性與目(mu)標小分(fen)子肽性質相似，使得小分(fen)子肽的(de)(de)(de)分(fen)離純化非(fei)常(chang)困(kun)難。

傳統的(de)(de)分離(li)(li)方法如超濾(lv)、微濾(lv)、鹽析、透(tou)析、離(li)(li)子(zi)交換(huan)、電泳等操作過程復雜、分離(li)(li)速度(du)慢(man)、樣(yang)品處理量(liang)(liang)小(xiao)、回收率低(di)(di)以及(ji)成(cheng)本(ben)昂(ang)貴(gui)。另一方面，由于生物(wu)樣(yang)品中(zhong)目標小(xiao)分子(zi)含量(liang)(liang)低(di)(di)，大量(liang)(liang)存在(zai)的(de)(de)生物(wu)大分子(zi)會影響小(xiao)分子(zi)擴散和競爭吸附(fu)位點(dian)，會降低(di)(di)目標小(xiao)分子(zi)的(de)(de)純度(du)及(ji)吸附(fu)量(liang)(liang)。因此(ci)高選擇性并(bing)高效的(de)(de)分離(li)(li)純化方法是(shi)小(xiao)分子(zi)肽(tai)的(de)(de)重要研究(jiu)方向。

技術實現要素：

本發(fa)明的目的是提(ti)供一種(zhong)血管緊(jin)張素轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)抑制肽及其(qi)制備提(ti)取方法(fa)，本發(fa)明先利用(yong)聚(ju)乙二醇(chun)單甲醚5000將(jiang)固定(ding)化(hua)(hua)金屬親和介(jie)(jie)質(zhi)(zhi)(imac)進行修飾(shi)制備限進親和介(jie)(jie)質(zhi)(zhi)這種(zhong)分離介(jie)(jie)質(zhi)(zhi)，限進親和介(jie)(jie)質(zhi)(zhi)具(ju)有的特(te)(te)異性吸附和大(da)分子(zi)阻拒的特(te)(te)點，再利用(yong)限進親和介(jie)(jie)質(zhi)(zhi)高(gao)效快速地(di)提(ti)取分離血管緊(jin)張素轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)抑制肽，提(ti)高(gao)了imac分離小分子(zi)肽的效率。

為解決(jue)上(shang)述技術(shu)問題(ti)，本發明采用(yong)如(ru)下技術(shu)方案：

一種血(xue)管緊張素(su)轉化酶抑制(zhi)肽，其氨基(ji)酸序列為：leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg。

一種血管(guan)緊張素轉化酶(mei)抑制(zhi)肽(tai)的(de)制(zhi)備(bei)提取方法(fa)，其特征在于，包括以下步驟(zou)：

s1.磁(ci)(ci)性(xing)(xing)二(er)氧(yang)化(hua)硅(gui)(gui)微(wei)球(qiu)的(de)制(zhi)備：取(qu)0.03～0.05gfe3o4、0.95～1.05ml正硅(gui)(gui)酸(suan)(suan)乙(yi)(yi)(yi)酯(teos)和(he)0.08～0.12ml聚乙(yi)(yi)(yi)二(er)醇(chun)單辛基苯基醚(tritionx-100)加(jia)入(ru)100ml乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)/水(shui)(shui)混合液中(zhong)并以50～60khz功(gong)率(lv)超聲分散8～15min，然(ran)后(hou)加(jia)入(ru)9ml濃度為(wei)(wei)(wei)25％的(de)氨(an)水(shui)(shui)，反應(ying)2～3h后(hou)利用外加(jia)磁(ci)(ci)場分離(li)出(chu)固體產品得到磁(ci)(ci)性(xing)(xing)二(er)氧(yang)化(hua)硅(gui)(gui)微(wei)球(qiu)，所(suo)述fe3o4的(de)粒徑為(wei)(wei)(wei)10～30nm，所(suo)述乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)/水(shui)(shui)混合液中(zhong)乙(yi)(yi)(yi)醇(chun)和(he)水(shui)(shui)的(de)體積(ji)比為(wei)(wei)(wei)1:1；fe3o4為(wei)(wei)(wei)磁(ci)(ci)性(xing)(xing)粒子，tritionx-100為(wei)(wei)(wei)表面活性(xing)(xing)劑，使得fe3o4粒子分布均勻，氨(an)水(shui)(shui)給反應(ying)提供(gong)堿(jian)性(xing)(xing)環境(jing)，正硅(gui)(gui)酸(suan)(suan)乙(yi)(yi)(yi)酯在堿(jian)性(xing)(xing)條(tiao)件下能(neng)夠水(shui)(shui)解生成(cheng)二(er)氧(yang)化(hua)硅(gui)(gui)，反應(ying)結束后(hou)得到磁(ci)(ci)性(xing)(xing)二(er)氧(yang)化(hua)硅(gui)(gui)微(wei)球(qiu)；

s2.限進(jin)(jin)親和(he)介(jie)(jie)質的(de)(de)(de)制備：利用3-氨(an)(an)丙基(ji)(ji)三(san)乙(yi)(yi)氧基(ji)(ji)硅烷(wan)(aptes)將(jiang)(jiang)(jiang)s1中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)磁(ci)性(xing)(xing)二氧化(hua)硅微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)進(jin)(jin)行氨(an)(an)基(ji)(ji)化(hua)改性(xing)(xing)得(de)(de)到氨(an)(an)基(ji)(ji)化(hua)微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)，再(zai)用環(huan)氧氯丙烷(wan)對氨(an)(an)基(ji)(ji)化(hua)微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)進(jin)(jin)行活化(hua)，然(ran)后用活化(hua)后的(de)(de)(de)氨(an)(an)基(ji)(ji)化(hua)微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)螯(ao)合(he)銅(tong)離(li)子得(de)(de)到螯(ao)合(he)微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)；將(jiang)(jiang)(jiang)1～2g聚乙(yi)(yi)二醇單甲醚5000(mpeg-5000)加入(ru)裝(zhuang)有4～8ml二甲基(ji)(ji)亞砜(dmso)的(de)(de)(de)三(san)口瓶(ping)中(zhong)(zhong)，再(zai)向三(san)口瓶(ping)中(zhong)(zhong)加入(ru)1.5～3ml氯仿及0.6～0.8ml乙(yi)(yi)酸酐并(bing)在35～40℃反(fan)應12h，得(de)(de)到mpeg-cho；將(jiang)(jiang)(jiang)0.2g的(de)(de)(de)螯(ao)合(he)微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)溶于50～100ml乙(yi)(yi)醇/水(shui)(乙(yi)(yi)醇和(he)水(shui)的(de)(de)(de)體積比為1:1)混(hun)合(he)溶液中(zhong)(zhong)，加入(ru)1g的(de)(de)(de)mpeg-cho，在室溫下(xia)攪拌(ban)反(fan)應24h后再(zai)加入(ru)0.05～0.08g還原劑(ji)nabh3，繼續反(fan)應48h，將(jiang)(jiang)(jiang)反(fan)應后產物置于透析(xi)袋中(zhong)(zhong)，在蒸餾(liu)水(shui)中(zhong)(zhong)透析(xi)48h，最后磁(ci)性(xing)(xing)分離(li)得(de)(de)到限進(jin)(jin)親和(he)介(jie)(jie)質；磁(ci)性(xing)(xing)二氧化(hua)硅微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)氨(an)(an)基(ji)(ji)化(hua)后能(neng)接枝mpeg-cho，氨(an)(an)基(ji)(ji)化(hua)微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)與銅(tong)離(li)子螯(ao)合(he)使得(de)(de)微(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)獲得(de)(de)特異(yi)性(xing)(xing)吸附(fu)功能(neng)；

s3.將酪蛋白(bai)(bai)用(yong)胰蛋白(bai)(bai)酶(mei)和(he)胃蛋白(bai)(bai)酶(mei)在(zai)55℃下酶(mei)解2h以上(shang)得到(dao)酶(mei)解液，然后(hou)采用(yong)超(chao)(chao)濾(lv)(lv)離(li)心管(10kda)對(dui)酶(mei)解液進行超(chao)(chao)濾(lv)(lv)得到(dao)濾(lv)(lv)液，將10mgs2中的(de)(de)限進親和(he)介(jie)質加入(ru)2ml濾(lv)(lv)液中進行吸附1～2h，然后(hou)利(li)用(yong)外加磁場分(fen)(fen)離(li)出限進親和(he)介(jie)質,再用(yong)0.5～1ml濃度為0.5～1mol/l的(de)(de)氯(lv)化銨和(he)0.5～1ml濃度為0.5～1mol/l的(de)(de)氯(lv)化鈉對(dui)其洗脫(tuo)0.5～1h得到(dao)洗脫(tuo)液，旋(xuan)轉蒸發洗脫(tuo)液得到(dao)濃縮(suo)液；酶(mei)解液超(chao)(chao)濾(lv)(lv)是為了(le)將一部(bu)分(fen)(fen)雜質和(he)沒有酶(mei)解的(de)(de)大(da)分(fen)(fen)子除去，使得酶(mei)解液得到(dao)純化，有利(li)于(yu)限進親和(he)介(jie)質吸附目標小分(fen)(fen)子多(duo)肽；

s4.采用hplc對s3中所述(shu)濃縮液(ye)進行分離(li)，流動相為(wei)(wei)(wei)：a相為(wei)(wei)(wei)水(1％tfa)，b相為(wei)(wei)(wei)乙腈(jing)(jing)(1％tfa)；分離(li)程序(xu)為(wei)(wei)(wei)：0～40min，b相乙腈(jing)(jing)體積由(you)5％到30％，流速為(wei)(wei)(wei)0.5ml/min，檢(jian)測波長為(wei)(wei)(wei)280nm，分離(li)收集到氨基酸(suan)序(xu)列為(wei)(wei)(wei)leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血(xue)管緊張素轉化(hua)酶抑制肽。

作為優選，s2中(zhong)(zhong)所述氨(an)基化(hua)微(wei)球(qiu)的制備方法為：取0.2gs1中(zhong)(zhong)的磁性二(er)氧化(hua)硅(gui)微(wei)球(qiu)置于三口瓶(ping)中(zhong)(zhong)，加入(ru)200ml乙醇(chun)，2ml去(qu)離子水(shui)，然后(hou)超(chao)(chao)聲分散30min，再以400～600r/min的轉速攪拌10min，向三口瓶(ping)中(zhong)(zhong)逐滴加入(ru)1.8～2.2mlaptes，在(zai)72～78℃下回(hui)流8～10h，反(fan)應結束后(hou)用(yong)磁鐵在(zai)瓶(ping)底吸(xi)附，傾去(qu)上清液，再加入(ru)無水(shui)乙醇(chun)，經超(chao)(chao)聲、洗滌，最(zui)后(hou)磁性分離得到氨(an)基化(hua)微(wei)球(qiu)。

作為優選，s2所述螯合微球的制備方法為：稱取0.15gs2中的氨基化微球，加入2.5ml濃度為0.4mol/l的naoh和2.5ml濃度為2.5mol/l環氧氯丙烷，接著加入0.9～1.1ml的dmso，在30～40℃下搖床振蕩4h，然后去離子水洗滌去除未反應的環氧氯丙烷得到環氧化微球，將制備出的環氧化微球加入20ml濃度為0.5mol/l的na2co3溶液中，再加入0.05～0.1g亞氨基二乙酸(ida)，在40～50℃下反應8h，cu²⁺與ida發(fa)生配(pei)位反應(ying)，反應(ying)結(jie)束后加入20ml濃度為0.05mol/l的cuso4溶液(ye)，搖床震蕩2h得到螯合(he)微球。

作為(wei)(wei)優選(xuan)，所(suo)述胰蛋(dan)(dan)白(bai)酶和(he)胃(wei)蛋(dan)(dan)白(bai)酶的質量比為(wei)(wei)1：1，所(suo)述胰蛋(dan)(dan)白(bai)酶與酪蛋(dan)(dan)白(bai)的質量比為(wei)(wei)1:60～100。

作為優選，所述限進親和介質的cu²⁺螯合密度不低于(yu)(yu)50μmol/g，保(bao)障限進親和介質(zhi)對小(xiao)(xiao)分子肽(tai)特異(yi)性吸附(fu)性能；mpeg-5000的接(jie)枝(zhi)率(lv)為10％～50％，接(jie)枝(zhi)率(lv)太低無(wu)法(fa)形成體積排(pai)阻效應，接(jie)枝(zhi)率(lv)過高則會(hui)不利于(yu)(yu)小(xiao)(xiao)分子肽(tai)的吸附(fu)。

本發明(ming)提供所述血管(guan)緊張素轉(zhuan)化酶抑制(zhi)肽在制(zhi)備(bei)減緩高血壓癥(zheng)狀(zhuang)的功能食品(pin)中的應(ying)用。

本發明的有益效果：

本發明制備(bei)的(de)(de)限(xian)進親和(he)(he)介質(zhi)能特異性吸附(fu)小分(fen)(fen)子多(duo)肽的(de)(de)同時阻(zu)拒大分(fen)(fen)子雜(za)蛋白(bai)的(de)(de)吸附(fu)，相對(dui)于(yu)(yu)imac其活(huo)性組分(fen)(fen)的(de)(de)含(han)量提高20％～30％。利用制備(bei)的(de)(de)限(xian)進親和(he)(he)介質(zhi)快速的(de)(de)從酪蛋白(bai)酶解液中(zhong)分(fen)(fen)離純化的(de)(de)ace抑(yi)制肽具(ju)有良好的(de)(de)ace抑(yi)制效果。本發明制備(bei)的(de)(de)限(xian)進親和(he)(he)介質(zhi)非常適(shi)用于(yu)(yu)從復雜(za)的(de)(de)生物基(ji)質(zhi)樣品中(zhong)快速、有效的(de)(de)分(fen)(fen)離出小分(fen)(fen)子活(huo)性物，提高分(fen)(fen)離效果。

附圖說明

圖(tu)1為實(shi)施例1中酪蛋白(bai)酶解液(ye)(a)、親(qin)(qin)和介質洗脫(tuo)液(ye)(b)和限(xian)進親(qin)(qin)和介質洗脫(tuo)液(ye)(c)的凝膠色譜(pu)圖(tu)。測試條(tiao)件(jian)：色譜(pu)柱：shodexptoteninkw-802.5，檢(jian)測器：dad二極管(guan)陣列檢(jian)測器，流動(dong)相：0.01mpbs緩沖液(ye)(ph＝7)，檢(jian)測波長：280nm，流速：0.5ml/min；

圖2為實施例1中酪蛋白(bai)酶解液(ye)(ye)(a)、親(qin)和介質(zhi)洗(xi)脫(tuo)液(ye)(ye)(b)和限進親(qin)和介質(zhi)洗(xi)脫(tuo)液(ye)(ye)(c)的高效(xiao)液(ye)(ye)相(xiang)色譜(pu)圖。測(ce)試條(tiao)件：色譜(pu)柱：agilentsb-c18，檢測(ce)器：dad二極管陣列檢測(ce)器，流(liu)動(dong)相(xiang)：a相(xiang)：水(0.1％tfa)，b相(xiang)：乙腈(0.1％tfa)，流(liu)動(dong)相(xiang)：5％～30％b相(xiang)(0～40min)，流(liu)速(su)：0.5ml/min，檢測(ce)波長：280nm；

圖3為實施例1中限進(jin)親和介(jie)質從(cong)酪蛋白酶解液(ye)中純化(hua)的多肽leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的質譜圖。

具體實施方式

參(can)照(zhao)附(fu)圖對本發明(ming)具(ju)體(ti)實施(shi)例做進一步說明(ming)。

本發明的血管緊(jin)張素(su)轉化酶(mei)抑制肽的氨(an)基酸序(xu)列為：leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg。

實施例1

一(yi)種血管緊張素轉(zhuan)化酶抑制肽的(de)制備提取方法(fa)，包(bao)括(kuo)以下步驟：

(1)磁(ci)性(xing)二(er)(er)(er)氧(yang)化硅微(wei)球的(de)制備：取0.03g平均粒徑為(wei)10nm的(de)fe3o4、1ml正硅酸乙(yi)酯(teos)和(he)0.1ml聚乙(yi)二(er)(er)(er)醇單辛基(ji)苯(ben)基(ji)醚(tritionx-100)加(jia)入100ml乙(yi)醇/水混合液(ye)(乙(yi)醇和(he)水的(de)體(ti)(ti)積比為(wei)1：1)中并以(yi)50khz功率超聲(sheng)分(fen)散10min，然后(hou)加(jia)入9ml濃(nong)度為(wei)25％的(de)氨水，反(fan)應2h后(hou)利用外加(jia)磁(ci)場分(fen)離(li)出固體(ti)(ti)產品得到磁(ci)性(xing)二(er)(er)(er)氧(yang)化硅微(wei)球；

(2)氨基化微(wei)球(qiu)的(de)(de)制(zhi)備：取0.2g(1)中(zhong)制(zhi)備的(de)(de)磁(ci)性二氧化硅微(wei)球(qiu)置于三口瓶(ping)(ping)中(zhong)，加(jia)入(ru)200ml乙醇，2ml去(qu)離(li)子水(shui)，然后超聲分散(san)30min，再以500r/min的(de)(de)轉速攪拌10min，向三口瓶(ping)(ping)中(zhong)逐滴加(jia)入(ru)2mlaptes，在75℃下(xia)回(hui)流8h，反(fan)應(ying)結束后用磁(ci)鐵在瓶(ping)(ping)底吸附，傾去(qu)上清(qing)液，再加(jia)入(ru)無水(shui)乙醇，經(jing)超聲、洗滌，磁(ci)性分離(li)得到(dao)氨基化微(wei)球(qiu)；

(3)螯(ao)合(he)微(wei)球(qiu)的(de)(de)(de)制(zhi)備(bei)：稱取(qu)0.15g(2)中制(zhi)備(bei)的(de)(de)(de)氨基化微(wei)球(qiu)，加(jia)(jia)入2.5ml濃(nong)度(du)(du)為(wei)0.4mol/l的(de)(de)(de)naoh和2.5ml濃(nong)度(du)(du)為(wei)2.5mol/l環(huan)(huan)氧(yang)氯丙烷，接著加(jia)(jia)入1ml的(de)(de)(de)dmso，在(zai)30℃下搖(yao)床(chuang)振蕩4h，然后去離子水洗滌得(de)(de)到環(huan)(huan)氧(yang)化微(wei)球(qiu)，將制(zhi)備(bei)出的(de)(de)(de)環(huan)(huan)氧(yang)化微(wei)球(qiu)加(jia)(jia)入20ml濃(nong)度(du)(du)為(wei)0.5mol/l的(de)(de)(de)na2co3溶液(ye)中，再加(jia)(jia)入0.05g亞氨基二(er)乙酸(ida)，在(zai)50℃下反(fan)應8h，反(fan)應結束后加(jia)(jia)入20ml濃(nong)度(du)(du)為(wei)0.05mol/l的(de)(de)(de)cuso4溶液(ye)，搖(yao)床(chuang)震(zhen)蕩2h得(de)(de)到螯(ao)合(he)微(wei)球(qiu)；

(4)限(xian)進(jin)親(qin)和介質(zhi)的(de)制(zhi)備：將1g聚乙(yi)二醇單甲醚5000(mpeg-5000)加(jia)入(ru)(ru)裝有(you)4ml二甲基亞砜(dmso)的(de)三口瓶(ping)中(zhong)(zhong)，再(zai)向(xiang)三口瓶(ping)中(zhong)(zhong)加(jia)入(ru)(ru)1.5ml氯仿及0.6ml乙(yi)酸酐并在(zai)40℃反應12h，得(de)到mpeg-cho；將0.2g(3)中(zhong)(zhong)制(zhi)備的(de)的(de)螯合(he)微球溶于(yu)50ml乙(yi)醇/水(shui)(乙(yi)醇和水(shui)的(de)體積比為1:1)混合(he)溶液中(zhong)(zhong)，加(jia)入(ru)(ru)1g的(de)mpeg-cho，在(zai)室溫下攪拌反應24h后再(zai)加(jia)入(ru)(ru)0.05g還(huan)原劑nabh3，繼續(xu)反應48h，將反應后產物(wu)置于(yu)透析(xi)袋中(zhong)(zhong)，在(zai)蒸餾(liu)水(shui)中(zhong)(zhong)透析(xi)48h，最后磁(ci)性(xing)分(fen)離得(de)到限(xian)進(jin)親(qin)和介質(zhi)。

(5)將(jiang)60g酪蛋白(bai)用1g胰蛋白(bai)酶(mei)和1g胃蛋白(bai)酶(mei)在(zai)55℃下酶(mei)解(jie)(jie)2h以上(shang)得(de)(de)到酶(mei)解(jie)(jie)液(ye)(ye)(ye)，然(ran)后采用超(chao)濾(lv)離(li)心管(10kda)對(dui)(dui)酶(mei)解(jie)(jie)液(ye)(ye)(ye)進(jin)行(xing)超(chao)濾(lv)得(de)(de)到濾(lv)液(ye)(ye)(ye)，將(jiang)10mg(4)中制(zhi)備的(de)限(xian)進(jin)親和介質加入2ml濾(lv)液(ye)(ye)(ye)中進(jin)行(xing)吸(xi)附(fu)2h，然(ran)后利用外加磁場分離(li)出限(xian)進(jin)親和介質,再用0.5ml濃(nong)度為0.5mol/l的(de)氯(lv)化銨和0.5ml濃(nong)度為0.5mol/l的(de)氯(lv)化鈉(na)對(dui)(dui)其洗(xi)脫1h得(de)(de)到洗(xi)脫液(ye)(ye)(ye)，旋轉蒸發洗(xi)脫液(ye)(ye)(ye)得(de)(de)到濃(nong)縮(suo)液(ye)(ye)(ye)；

(6)采(cai)用hplc對(dui)(5)中濃(nong)縮液進行分離，流動相(xiang)為(wei)(wei)：a相(xiang)為(wei)(wei)水(1％tfa)，b相(xiang)為(wei)(wei)乙(yi)腈(jing)(1％tfa)；分離程序為(wei)(wei)：0～40min，b相(xiang)乙(yi)腈(jing)體(ti)積由5％到30％，流速(su)為(wei)(wei)0.5ml/min，檢測波長為(wei)(wei)280nm，分離收集到氨基酸(suan)序列為(wei)(wei)leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血管緊張素轉化酶抑制肽。

所述限進親和介質的cu²⁺螯(ao)合密度(du)為52μmol/g，mpeg-5000的接枝率為10.3％。

實施例2

一種(zhong)血管緊張(zhang)素轉化(hua)酶抑制肽的制備提取方法，包括以下步(bu)驟：

(1)磁(ci)性(xing)二(er)氧化(hua)硅(gui)(gui)微(wei)球的(de)制備(bei)：取0.04g平均粒徑為(wei)(wei)(wei)15nm的(de)fe3o4、1.05ml正硅(gui)(gui)酸(suan)乙(yi)(yi)酯(teos)和(he)0.12ml聚乙(yi)(yi)二(er)醇單(dan)辛基(ji)苯基(ji)醚(tritionx-100)加(jia)入(ru)(ru)100ml乙(yi)(yi)醇/水(shui)混合液(乙(yi)(yi)醇和(he)水(shui)的(de)體(ti)(ti)積比為(wei)(wei)(wei)1：1)中并(bing)以60khz功率超(chao)聲分散15min，然后加(jia)入(ru)(ru)9ml濃度為(wei)(wei)(wei)25％的(de)氨(an)水(shui)，反應3h后利用外加(jia)磁(ci)場(chang)分離(li)出固體(ti)(ti)產品(pin)得(de)到磁(ci)性(xing)二(er)氧化(hua)硅(gui)(gui)微(wei)球；

(2)氨基化(hua)(hua)微球(qiu)的(de)制(zhi)備：取0.2g(1)中制(zhi)備的(de)磁(ci)性二(er)氧化(hua)(hua)硅(gui)微球(qiu)置于三口(kou)瓶中，加入(ru)200ml乙醇，2ml去(qu)離子水(shui)，然后(hou)超聲(sheng)分(fen)(fen)散30min，再以(yi)400r/min的(de)轉速攪拌10min，向三口(kou)瓶中逐(zhu)滴(di)加入(ru)1.8mlaptes，在72℃下回流10h，反應(ying)結束后(hou)用磁(ci)鐵(tie)在瓶底吸附，傾(qing)去(qu)上清液(ye)，再加入(ru)無水(shui)乙醇，經超聲(sheng)、洗(xi)滌，磁(ci)性分(fen)(fen)離得(de)到氨基化(hua)(hua)微球(qiu)；

(3)螯合(he)微(wei)球(qiu)(qiu)的(de)制備：稱取0.15g(2)中(zhong)制備的(de)氨基化微(wei)球(qiu)(qiu)，加(jia)入(ru)(ru)2.5ml濃(nong)度為(wei)0.4mol/l的(de)naoh和2.5ml濃(nong)度為(wei)2.5mol/l環(huan)(huan)氧氯丙烷(wan)，接著(zhu)加(jia)入(ru)(ru)0.9ml的(de)dmso，在40℃下搖床振蕩(dang)4h，然(ran)后去(qu)離(li)子(zi)水洗滌得到(dao)環(huan)(huan)氧化微(wei)球(qiu)(qiu)，將制備出的(de)環(huan)(huan)氧化微(wei)球(qiu)(qiu)加(jia)入(ru)(ru)20ml濃(nong)度為(wei)0.5mol/l的(de)na2co3溶(rong)液中(zhong)，再(zai)加(jia)入(ru)(ru)0.08g亞氨基二乙酸(ida)，在40℃下反(fan)應(ying)8h，反(fan)應(ying)結(jie)束后加(jia)入(ru)(ru)20ml濃(nong)度為(wei)0.05mol/l的(de)cuso4溶(rong)液，搖床震蕩(dang)2h得到(dao)螯合(he)微(wei)球(qiu)(qiu)；

(4)限(xian)進親(qin)和(he)介質(zhi)的制備：將2g聚乙(yi)二醇單甲(jia)醚(mi)5000(mpeg-5000)加(jia)入(ru)裝有8ml二甲(jia)基亞砜(dmso)的三口瓶中，再(zai)向(xiang)三口瓶中加(jia)入(ru)2.8ml氯仿(fang)及0.8ml乙(yi)酸酐(gan)并在(zai)38℃反(fan)應12h，得到(dao)mpeg-cho；將0.2g(3)中制備的的螯合(he)微球溶于100ml乙(yi)醇/水(乙(yi)醇和(he)水的體積比為1:1)混合(he)溶液中，加(jia)入(ru)1g的mpeg-cho，在(zai)室溫(wen)下攪拌反(fan)應24h后再(zai)加(jia)入(ru)0.08g還原劑nabh3，繼續(xu)反(fan)應48h，將反(fan)應后產(chan)物置于透(tou)析(xi)(xi)袋中，在(zai)蒸餾水中透(tou)析(xi)(xi)48h，最后磁性分離得到(dao)限(xian)進親(qin)和(he)介質(zhi)。

(5)將(jiang)80g酪蛋(dan)白用(yong)(yong)(yong)1g胰(yi)蛋(dan)白酶(mei)和1g胃蛋(dan)白酶(mei)在55℃下酶(mei)解2h以上得(de)到(dao)(dao)酶(mei)解液(ye)(ye)，然(ran)后(hou)采(cai)用(yong)(yong)(yong)超濾(lv)離(li)心管(10kda)對酶(mei)解液(ye)(ye)進行(xing)超濾(lv)得(de)到(dao)(dao)濾(lv)液(ye)(ye)，將(jiang)10mg(4)中(zhong)制(zhi)備的限(xian)(xian)進親(qin)和介質加入2ml濾(lv)液(ye)(ye)中(zhong)進行(xing)吸附1.5h，然(ran)后(hou)利用(yong)(yong)(yong)外加磁場分離(li)出限(xian)(xian)進親(qin)和介質,再用(yong)(yong)(yong)1ml濃(nong)度為1mol/l的氯(lv)化銨(an)和1ml濃(nong)度為1mol/l的氯(lv)化鈉對其洗脫(tuo)(tuo)0.5h得(de)到(dao)(dao)洗脫(tuo)(tuo)液(ye)(ye)，旋轉蒸發洗脫(tuo)(tuo)液(ye)(ye)得(de)到(dao)(dao)濃(nong)縮液(ye)(ye)；

(6)采用hplc對(dui)(5)中(zhong)濃縮液(ye)進行分(fen)(fen)離，流動相(xiang)為(wei)(wei)：a相(xiang)為(wei)(wei)水(1％tfa)，b相(xiang)為(wei)(wei)乙腈(jing)(1％tfa)；分(fen)(fen)離程(cheng)序為(wei)(wei)：0～40min，b相(xiang)乙腈(jing)體積由(you)5％到30％，流速為(wei)(wei)0.5ml/min，檢測波長為(wei)(wei)280nm，分(fen)(fen)離收集(ji)到氨基(ji)酸(suan)序列為(wei)(wei)leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血(xue)管緊張(zhang)素轉化酶(mei)抑制肽。

所述限進親和介質的cu²⁺螯合密度(du)為(wei)61μmol/g，mpeg-5000的接枝率為(wei)12.4％。

實施例3

一(yi)種(zhong)血管緊張素轉化(hua)酶抑制(zhi)肽的制(zhi)備提取方(fang)法，包括以下步(bu)驟：

(1)磁(ci)性(xing)二(er)氧(yang)化(hua)硅微(wei)(wei)球的(de)制(zhi)備(bei)：取0.05g平均粒徑為(wei)30nm的(de)fe3o4、0.95ml正硅酸乙酯(teos)和(he)0.08ml聚乙二(er)醇單辛基苯基醚(tritionx-100)加(jia)(jia)入100ml乙醇/水(shui)混合液(ye)(乙醇和(he)水(shui)的(de)體積比為(wei)1：1)中并以(yi)55khz功率超聲分(fen)散8min，然后加(jia)(jia)入9ml濃(nong)度為(wei)25％的(de)氨水(shui)，反(fan)應2.5h后利用外加(jia)(jia)磁(ci)場(chang)分(fen)離出固(gu)體產(chan)品得到(dao)磁(ci)性(xing)二(er)氧(yang)化(hua)硅微(wei)(wei)球；

(2)氨基化微(wei)球(qiu)的制備：取0.2g(1)中制備的磁(ci)性二氧化硅(gui)微(wei)球(qiu)置于三(san)口(kou)(kou)瓶中，加入(ru)(ru)200ml乙(yi)(yi)醇，2ml去離子水，然(ran)后超聲分散30min，再以600r/min的轉速(su)攪拌(ban)10min，向三(san)口(kou)(kou)瓶中逐滴加入(ru)(ru)2.2mlaptes，在78℃下回流9h，反應結(jie)束后用磁(ci)鐵在瓶底吸附(fu)，傾(qing)去上清(qing)液，再加入(ru)(ru)無水乙(yi)(yi)醇，經超聲、洗滌，磁(ci)性分離得到氨基化微(wei)球(qiu)；

(3)螯合(he)微(wei)球(qiu)(qiu)的(de)(de)制(zhi)備(bei)：稱取(qu)0.15g(2)中制(zhi)備(bei)的(de)(de)氨基(ji)化微(wei)球(qiu)(qiu)，加(jia)入(ru)2.5ml濃度為(wei)0.4mol/l的(de)(de)naoh和2.5ml濃度為(wei)2.5mol/l環(huan)(huan)氧氯丙烷(wan)，接(jie)著加(jia)入(ru)1.1ml的(de)(de)dmso，在35℃下搖床振蕩4h，然后(hou)去離(li)子水洗滌(di)得(de)到(dao)環(huan)(huan)氧化微(wei)球(qiu)(qiu)，將制(zhi)備(bei)出的(de)(de)環(huan)(huan)氧化微(wei)球(qiu)(qiu)加(jia)入(ru)20ml濃度為(wei)0.5mol/l的(de)(de)na2co3溶液(ye)中，再加(jia)入(ru)0.1g亞氨基(ji)二乙(yi)酸(ida)，在45℃下反應8h，反應結束后(hou)加(jia)入(ru)20ml濃度為(wei)0.05mol/l的(de)(de)cuso4溶液(ye)，搖床震(zhen)蕩2h得(de)到(dao)螯合(he)微(wei)球(qiu)(qiu)；

(4)限進(jin)親和介(jie)質(zhi)的(de)制備：將1.6g聚(ju)乙二(er)(er)醇單甲醚5000(mpeg-5000)加(jia)入(ru)裝(zhuang)有6ml二(er)(er)甲基(ji)亞砜(dmso)的(de)三(san)口瓶(ping)中，再向三(san)口瓶(ping)中加(jia)入(ru)3ml氯仿及0.7ml乙酸酐(gan)并在35℃反(fan)(fan)(fan)應(ying)12h，得(de)到mpeg-cho；將0.2g(3)中制備的(de)的(de)螯合微球溶于80ml乙醇/水(shui)(乙醇和水(shui)的(de)體積比為1:1)混合溶液中，加(jia)入(ru)1g的(de)mpeg-cho，在室溫下攪拌(ban)反(fan)(fan)(fan)應(ying)24h后(hou)再加(jia)入(ru)0.07g還原劑nabh3，繼續反(fan)(fan)(fan)應(ying)48h，將反(fan)(fan)(fan)應(ying)后(hou)產物置于透析袋中，在蒸餾水(shui)中透析48h，最(zui)后(hou)磁性(xing)分離得(de)到限進(jin)親和介(jie)質(zhi)。

(5)將100g酪(lao)蛋白(bai)用1g胰蛋白(bai)酶和1g胃蛋白(bai)酶在55℃下酶解(jie)2h以上得到酶解(jie)液(ye)(ye)，然后采用超濾離心管(10kda)對酶解(jie)液(ye)(ye)進行超濾得到濾液(ye)(ye)，將10mg(4)中制(zhi)備的(de)(de)限(xian)進親和介(jie)質(zhi)加入2ml濾液(ye)(ye)中進行吸(xi)附1h，然后利用外(wai)加磁場(chang)分離出限(xian)進親和介(jie)質(zhi),再(zai)用0.7ml濃(nong)度為0.8mol/l的(de)(de)氯(lv)(lv)化(hua)銨和0.8ml濃(nong)度為0.7mol/l的(de)(de)氯(lv)(lv)化(hua)鈉對其洗(xi)脫(tuo)0.6h得到洗(xi)脫(tuo)液(ye)(ye)，旋轉蒸(zheng)發洗(xi)脫(tuo)液(ye)(ye)得到濃(nong)縮液(ye)(ye)；

(6)采(cai)用hplc對(5)中濃縮液進行分(fen)(fen)離，流(liu)動相為(wei)(wei)：a相為(wei)(wei)水(1％tfa)，b相為(wei)(wei)乙(yi)腈(jing)(1％tfa)；分(fen)(fen)離程序為(wei)(wei)：0～40min，b相乙(yi)腈(jing)體(ti)積由5％到30％，流(liu)速為(wei)(wei)0.5ml/min，檢(jian)測波(bo)長為(wei)(wei)280nm，分(fen)(fen)離收集到氨基(ji)酸序列為(wei)(wei)leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血(xue)管緊張素轉化(hua)酶抑制(zhi)肽。

所述限進親和介質的cu²⁺螯合密度為(wei)57μmol/g，mpeg-5000的接枝率為(wei)14.2％。

本(ben)發(fa)明的(de)(de)保(bao)護范圍(wei)并不(bu)僅局限(xian)于上述實(shi)施例(li)，凡屬(shu)于本(ben)發(fa)明思(si)路下(xia)的(de)(de)技(ji)術方(fang)案均屬(shu)于本(ben)發(fa)明的(de)(de)保(bao)護范圍(wei)。應(ying)當指出，對(dui)于本(ben)技(ji)術領域的(de)(de)普(pu)通技(ji)術人員來(lai)說，在不(bu)脫離本(ben)發(fa)明原(yuan)理前提下(xia)的(de)(de)若干(gan)改進和潤飾，這(zhe)些改進和潤飾也(ye)應(ying)視(shi)為本(ben)發(fa)明的(de)(de)保(bao)護范圍(wei)。