專利名稱：干擾纖維化的方法
技術領域：
本工作涉及到改變結締組織生長因子(CTGF)的活性的方法，包含使表達血清和糖皮質激素誘導激酶SGK1的細胞與調節所述糖皮質激素誘導激酶的物質接觸。另外，本發明還涉及到纖維化疾病的診斷和治療。
背景技術：
纖維化是一種正常傷口愈合過程失去平衡的病理性的病癥，其導致持續生成瘢痕組織，這些瘢痕組織會阻礙正常的組織功能，并且大范圍的纖維化紊亂會導致器官衰竭。
已知成纖維細胞表達的CTGF在纖維化中起著關鍵的作用，因此它成為抗纖維化治療中具有吸引力的靶標。越來越多的大量臨床證據支持了CTGF在纖維化紊亂中的作用。眾多的公開研究表明，從患有纖維增生性紊亂的病人的主要器官和組織，包括肺、皮膚、腎臟、肝臟、心臟和眼睛中所得到的樣品中，CTGF以異常高的量存在(Ihn2002)。在很多種疾病中都觀察到了CTGF生成的改變，例如照射、腫瘤、血管形成、肉芽腫疾病、器官和移植物排異、紅斑狼瘡、動脈硬化、低氧、氧化應激、心肌梗塞和局部缺血、心臟肥大和纖維化、腎小球腎炎和腎小球硬化、腎纖維化、糖尿病、纖維化胰腺炎、肝硬化、脂肪性肝炎和膽汁纖維化、纖維化和炎癥性腸病、消化性潰瘍、腹內粘連、腹膜透析中的腹膜纖維化、肺纖維化、纖維性肺泡炎、肺結節病和/或哮喘、卵巢功能障礙、子宮肌瘤、關節炎、肌肉疼痛/肌痛和筋膜炎、硬皮病、瘢痕瘤、齒齦肥大、包括角膜、眼房水(occular fluid)和視網膜的不同的器官中瘢痕或結締組織的形成、青光眼、包括大腦梗塞在內的大腦病變、阿爾茨海默病、傷口愈合、拔牙后的愈合、骨骼愈合和生長、骨折修復，這在下文稱之為“纖維增生性紊亂”。
鑒于CTGF在觸發一系列事件導致誘導CTGF以及在傷口瘢痕形成過程的隨后事件中所起到的中心作用，它已被提出作為抗纖維化治療的靶標。然而，這一方法仍然處于研究和發展的初級階段，并且其結果還不確定。本申請提供了一種不同的方法，其也將干擾CTGF的活性，但它是在更早的時期干擾CTGF的調控從而阻止CTGF的表達。因此，本發明預期將提供優點是能夠提供重大臨床益處而無大范圍副作用的治療。
最初，SGK1是作為糖皮質激素誘導基因被克隆出來的，隨后被證明它可以被鹽皮質素強烈上調。已經證明了SGK1可以被胰島素樣生長因子IGF1、胰島素和[經由涉及磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)和磷酸肌醇依賴性激酶PDK1的信號級聯的]氧化應激所調控(Kobayashi & Cohen 1999，Park等人，1999，Kobayashi等人，1999)。通過PDK1激活SGK1中涉及絲氨酸422的磷酸化。另外還表明，將ser422突變成天冬氨酸(S422DSGK1)會產生持續激活的激酶(Kobayashi等人，1999)。
測量糖皮質激素誘導激酶SGK1的活性可以通過應用多種檢測系統。在閃爍親近測定法(scintillation proximity assay)(Sorg等人，J.of.Biomolecular Screening，2002，7，11-19)和閃爍板檢測法(flashplateassay)中，測量與γATP同為底物的蛋白或肽的放射性磷酸化。在抑制化合物存在下檢測到不到或者減弱的放射性信號。另外，均相時間分辨熒光共振能量轉移(HTR-FRET)和熒光偏振技術作為測量方法也可應用(Sills等人，J.of Biomolecular Screening，2002，191-214)。其它基于非放射性ELISA的檢測方法應用特異性的磷酸抗體(AB)。這種磷酸抗體只結合磷酸化的底物。這一結合通過化學發光檢測應用過氧化酶綴合的抗綿羊二抗檢測(Ross等人，2002，Biochem.J.，直接發表，原稿BJ20020786)。
早期的結果表明SGK1是腎上皮Na+-通道強有力的刺激物(De laRosa等人1999，Boehmer等人2000，Chen等人1999，Naray-Fejes-Toth等人1999，Lang等人2000，Shigaev等人2000，Wagner等人2001).
另一個有關SGK1的發現是其在外顯子8上的核苷酸組合為(CC/CT)的單核苷酸多態現象(SNP)和在內含子6上的附加多態現象(CC)與血壓的增高有關(Busjahn等人2002)，并由此得出結論SGK1可能對于血壓的調節和高血壓具有重要的作用。
由于SGK1活性的增高與腎上皮Na+-通道的活性相關聯，而Na+-通道的活性會增強鈉的腎再吸收而導致高血壓(Lifton 1996；Staessen等人，2003；Warnock2001)，由此得到結論，取決于SGK1等位變體的組合，會發生腎Na+再吸收的增加，并由此使血壓增高(Busjahn等人2002)。
發明概述成纖維細胞中結締組織生長因子(CTGF)的表達在誘導與眾多疾病相關的纖維化中起到核心作用。出乎意料地，本發明證明了CTGF表達的增高與血清和糖皮質激素誘導激酶SGK1的存在和上調強相關。
更詳細地，本發明公開了SGK1具有兩種新的關鍵功能(i)鹽皮質素向鹽需求的信號傳遞(ii)介導鹽皮質素誘導的CTGF的生成和心臟纖維化。
諸如心臟纖維化的數據證明了，SGK1激酶通常對于纖維化疾病起到至關重要的作用。在糖尿病性腎病、腎小球腎炎、克隆病(Crohn’s disease)、肺纖維化、肝硬化和纖維化胰腺炎中，均觀察到了SGK1的過度轉錄。已經研究了在心臟纖維化中過度轉錄SGK1在功能上的重要性，所屬領域的技術人員可以容易地將本觀測結論擴展到其它盡管尚未通過本工作研究的、但是強烈表明SGK1活躍參與所述疾病的病理生理學的纖維化疾病中。
在來自于SGK1敲除小鼠的成纖維細胞中，脫氧皮質酮，一種眾所周知的誘導纖維化的試劑，不能誘導CTGF的生成。另一方面，這一激素在來自于含有完整功能SGK1的正常小鼠的成纖維細胞中，誘導CTGF顯著的表達。因此SGK1是CTGF推動的纖維化的強有力的調節子。
因為在成纖維細胞中表達的CTGF是誘導纖維化的最重要的介質，所以抑制SGK1可以干擾CTGF的表達從而阻抑纖維化。由此，在疾病促進過程中具有核心作用的SGK1除了其自然固有的功能外，還具有一些其它未曾預料的和新的與導致纖維化疾病有關的功能。
本發明也陳述了一種檢測纖維化疾病的易患體質、進展、消退或發作的方法，這是通過測量組織樣品和樣本中與CTGF狀態相關聯的SGK1表達的上調或下調來完成的。取自患病個體的樣品可能會進一步允許在這些樣品中分析選定的SGK1單核苷酸表達多態性變體及其與疾病易患體質的相互聯系。
(本發明)另一方面涉及鑒定調節疾病相關SGK1的新候選藥物的篩選方法。根據本發明尤其有用的調節劑是干擾SGK1功能并由此阻止CTGF表達和活性上調的化合物。SGK1的抑制劑尤其對于治療具有選自下組“纖維增生性紊亂”疾病癥狀的受試者特別有用照射引起的纖維化、腫瘤、血管形成、肉芽腫疾病、器官和移植物排異、紅斑狼瘡、動脈硬化、低氧、氧化應激、心肌梗塞和局部缺血、心臟肥大和纖維化、腎小球腎炎和腎小球硬化、腎纖維化、糖尿病、纖維化胰腺炎、肝硬化、脂肪性肝炎和膽汁纖維化、纖維性和炎癥性腸病、消化性潰瘍、腹內粘連、腹膜透析中的腹膜纖維化、肺纖維化、纖維性肺泡炎、肺結節病和/或哮喘、卵巢功能障礙、子宮肌瘤、關節炎、肌肉疼痛/肌痛和筋膜炎、硬皮病、瘢痕瘤、齒齦肥大、瘢痕形成、包括角膜、眼房水和視網膜的不同的器官中瘢痕或結締組織的紊亂形成、青光眼、包括大腦梗塞在內的大腦病變、阿爾茨海默病、傷口愈合、拔牙后的愈合、骨骼愈合和生長、骨折后骨骼的愈合。
根據本發明實施的藥物篩選方法導致了SGK1定向的治療性化合物的發現。已經鑒定了兩類化合物，一類屬于酰腙衍生物類，另一類屬于吡啶并嘧啶衍生物類。在包含有藥物有效的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物中，所選定的SGK1抑制化合物對于治療多種導致纖維化的疾病都具有療效。本發明重要的一點在于鑒定具有期望治療性能的新藥所用的篩選方法并不局限于(鑒定)本申請所公開的化合物。此外，對于技術人員顯而易見的是，一步法或兩步法篩選SGK1調節化合物可能在應用中比較有用。這種篩選的第一步包括鑒定可以干擾SGK1激酶活性的化合物。多種測定形式都可用，優選的測定法是測量與γATP一起作為底物被SGK1催化的蛋白或肽的放射性磷酸化作用。在存在SGK1抑制化合物時，沒有或者只能檢測到減少的放射性信號。在另一個讀出系統中，監測SGK1抑制化合物干擾CTGF表達的潛能，不過也可以測量其它的讀出活性。除了測量CTGF外，還可以考慮測量前膠原、整合蛋白α5或蛋白聚糖，或者用上述測量代替CTGF的測量。
發明詳述為了研究SGK1是否參與心臟纖維化的信號傳導，將一粒可以持續釋放DOCA(2.4mg/天)的小丸分別植入sgk1+/+和sgk1-/-兩種小鼠中，同時在其飲用水中加入1％的NaCl。
處理前，sgk1+/+和sgk1-/-小鼠的血壓與血漿中Na+、Cl-、Ca2+和磷酸鹽的濃度、腎小球濾過率、尿流速和腎臟的電解質消除一樣都很相似。
在sgk1+/+和sgk1-/-小鼠中，DOCA/高鹽處理18天后，都會導致統計學顯著的血壓增高和尿中排出的NaCl和水的增多。這一效果同時伴隨著顯著性的尿中排出的Ca2+和磷酸鹽的增多，典型的細胞外容積膨脹的后果(12，13)。在sgk1+/+小鼠中，DOCA會引起低鉀血癥，而在sgk1-/-小鼠中則不會，這表明SGK1在鹽皮質素調控的腎臟的K+分泌中起到一定的作用。
在sgk1-/-小鼠中血壓的升高現象與Na+再吸收的顯著性上調相一致，并且如本文中所表明的，這種不依賴于SGK1的、DOCA介導的鹽皮質素受體的激活對腎臟鹽類再吸收的上調，顯然足夠引起最終腎臟中的NaCl滯留并由此使得血壓升高。
與sgk1+/+小鼠相比，在sgk1-/-小鼠中DOAC/高鹽處理誘導的血漿中Na+濃度、尿流速、完全或者部分的NaCl分泌的增加程度都具有顯著性的減弱。考慮到sgk1-/-小鼠對腎臟Na+的再吸收缺陷型的刺激，預期相反地，也就是說在這些小鼠中，其尿液排出的NaCl應當是增加而不是減少。
從而一個新發現是SGK1可能有助于鹽皮質素誘導的鹽需求。為了驗證這種可能性，將小鼠置于可用兩個飲用水瓶的代謝籠中，其中瓶1一直含有自來水。當將瓶2中的水換成1％NaCl時，sgk1+/+小鼠并沒有顯著性地更改從瓶1中水的攝取量，只在小鼠體內植入DOCA小丸后才會誘導其從瓶2中攝取鹽量的明顯增加，這與DOCA誘導的鹽需求相一致(

圖1)。而在sgk1-/-小鼠中，這種反應顯著性地減弱。即使在瓶2提供自來水后，sgk1+/+小鼠和sgk1-/-小鼠之間的這種來自瓶2的液體攝取的顯著性差異依然存在，表明sgk1+/+小鼠仍然比sgk1-/-小鼠更強烈地尋找鹽。這些數據提供了第一個證明SGK1在鹽皮質素調控的Na+穩態中起到雙重作用的證據，即SGK1不僅通過激活腎臟Na+的再吸收來參與抑制排出，而且通過鹽皮質素誘導的鹽需求刺激攝入(6，7)。SGK1可以通過糖皮質激素類似地參與調節鹽需求(2)，并且SGK1依賴的鹽攝入量的增加會在應激狀態下促成增加細胞外液的體積和血壓(15)。此外，增加的鹽需求及隨后增加的鹽攝取還有細胞外液的膨脹會促成在SGK1基因中攜帶常見多態現象的個體具有更高的血壓值，這影響了多達5％隨機選取的白種人(16)。
盡管血壓一樣升高，DOCA/高鹽對于腎臟生長和蛋白尿的作用卻在sgk1-/-小鼠中顯著性減弱。此外，sgk1-/-小鼠和sgk1+/+小鼠的心臟形態也具有顯著性差異。18天的DOCA/高鹽處理會使得sgk1+/+小鼠的心臟出現顯著的纖維化，但是對sgk1-/-小鼠的心臟卻依然沒有可察覺的影響(圖2a)。通過測量纖維化的面積并表示為占總面積的百分比，對纖維化的嚴重程度進行定量分析，顯示DOCA/高鹽處理的sgk1+/+小鼠和sgk1-/-小鼠的纖維化程度在統計學上具有顯著性差異(圖2b)。而在DOCA/高鹽處理前，在sgk1+/+小鼠和sgk1-/-小鼠中都沒有觀察到顯著性的纖維化(圖2b)。
在DOCA/高鹽處理的sgk1+/+小鼠中發現的增強的心臟纖維化伴隨著若干基因轉錄調控的改變，這是通過微列陣分析測得的。在sgk1+/+小鼠中，DOCA/高鹽處理48小時后誘導產生了若干與纖維化病理相關的基因，如前膠原、整合蛋白α5、蛋白聚糖4和結締組織生長因子CTGF(圖2c)，同時伴隨著SGK1轉錄的增加(通過實時PCR檢測，與未經處理的sgk1+/+小鼠相比，在DOCA/高鹽處理的sgk1+/+小鼠中，SGK1/GAPDH的拷貝數增加了2.10±0.14倍)。相反，在sgk1-/-小鼠中，DOCA/高鹽則不能誘導這些基因中的任何一個。
由于DOCA/高鹽處理的sgk1+/+小鼠與sgk1-/-小鼠相比表現出更大的鹽攝入(圖1)，并且以前有報道稱延長的和增強的鹽攝入在鹽皮質素缺失的情況下會刺激心臟纖維化(17)，因此我們進行了以下一系列的深入實驗，即用DOCA加1％鹽水處理sgk1+/+小鼠和用DOCA加2％鹽水處理sgk1-/-小鼠來確定sgk1+/+小鼠和sgk1-/-小鼠的心臟纖維化程度的差異是否是sgk1+/+小鼠攝取了更多的鹽造成的繼發作用。即使在這些情況下，sgk1-/-小鼠(n＝5)的液體攝入量是sgk1+/+小鼠(n＝5)的2.2±0.4倍，即Na+的攝入量比sgk1+/+小鼠高4倍多，Western印跡法檢測心臟CTGF的表達(在本例中作為心臟纖維化的標志)后發現，僅在來自于sgk1+/+小鼠的心臟組織中有顯著性的增加(未處理的0.9±0.2vs DOCA/1％鹽4.7±1.0，CTGF/β-微管蛋白的任意單位的光密度測定，(P＜0.01))，而在sgk1-/-小鼠中則沒有(未處理的1.5±1.0vs DOCA/2％鹽1.7±0.7，CTGF/β-微管蛋白的任意單位的光密度測定)。
上文描述的低鉀血癥可能具有心臟毒性并由此引發補償性纖維化(18)。因此，在DOCA/高鹽處理的sgk1+/+小鼠中，過度的低鉀血也會促成觀測到的心臟纖維化。但是，先前已經有報道表明對經鹽皮質素/高鹽處理的大鼠補充KCl對于纖維化程度和心臟的膠原含量沒有效果(19)。
CTGF是CCN(ctgf/cyr61/nov)基因家族的成員(20)，是一個在基質蛋白形成中的關鍵介質(21，22)，CTGF表達的繼發作用是上調膠原和整合蛋白α5的轉錄(23，24)。因此我們進一步研究了DOCA在調控CTGF蛋白水平方面的作用。根據Western印跡分析，在來自于sgk1+/+小鼠的心臟組織中，DOCA/高鹽處理(18天)明顯上調CTGF的表達，而在sgk1-/-小鼠中則沒有變化(圖3a，b)。類似地，用DOCA(10μM，24h)刺激從sgk1+/+和sgk1-/-小鼠中分離的原代培養的小鼠肺成纖維細胞只能提高sgk1+/+細胞中CTGF的蛋白水平(圖3c，d)。在培養的成纖維細胞中需要SGK1參與體外激活CTGF的表達證明鹽皮質素誘導的CTGF形成的差異性并不要求sgk1-/-和sgk1+/+小鼠間在血壓、電解質代謝或者血漿濃度方面有差異，即使這些和其他的功能性參數也會在鹽皮質素過量情況下促成改變心臟的功能和纖維化。SGK1-依賴的CTGF表達的上調為這一激酶在增強的基質沉積作用的信號傳導中起決定性作用提供了說明。但是，本發現并不排除還有其它涉及SGK1能夠導致心臟纖維化的信號傳遞通路。
附圖的簡短說明圖1SGK1是DOCA刺激的NaCl攝入所必需的。
圖示了在DOCA處理之前和期間，SGK1敲除小鼠(sgk1-/-，空心標志)或其野生型同窩小鼠(sgk1+/+，實心標志)從瓶1(自來水，左圖)或者從瓶2(自來水或鹽水，右圖)的日飲水量。
圖2SGK1是DOCA誘導的心臟纖維化的發生和基因表達的改變所必需的。
a用H&E和Masson三色染色分別對經DOCA/高鹽飼料處理18天的野生型小鼠(sgk1+/+，左)和SGK1敲除小鼠(sgk1-/-，右)的心臟組織進行染色(×150倍放大)。b圖示了觀察到的DOCA/高鹽處理的sgk1+/+和sgk1-/-小鼠的纖維化程度(纖維化區域表示為其占整體區域的百分比)(平均值±SEM，n＝6，*顯著性差異(P＜0.05))。c對比經過2天DOCA/高鹽飼料處理的SGK1敲除小鼠(sgk1-/-，空心柱)和同窩野生型小鼠(sgk1+/+，實心柱)，通過微列陣分析得到了二者與未處理小鼠相比的結締組織生長因子(CTGF)、I型、IV型和VIII型前膠原、蛋白聚糖4和整合蛋白α5的轉錄水平的倍數變化的算術平均值±SEM(兩動物間進行四次對比)。
圖3DOCA增強來自于sgk1+/+小鼠心臟和原代小鼠肺成纖維細胞中CTGF的表達，但是對于sgk1-/-小鼠則沒有這種作用。
a來自于對照、DOCA/高鹽處理(18天)的SGK1敲除小鼠(sgk1-/-)和同窩野生型小鼠(sgk1+/+)的心臟中CTGF和β-微管蛋白水平的代表性Western印跡。b光密度測定法檢測CTGF Western印跡，表達為β-微管蛋白的比值(平均值±SEM，n＝3-5，*sgk1+/+處理和sgk1+/+DOCA具有顯著性差異，#sgk1+/+DOCA和sgk1-/-DOCA之間的顯著性差異，(P＜0.05))。cDOCA處理的小鼠肺成纖維細胞中CTGF和β-微管蛋白表達的代表性Western印跡，和d分別來自于SGK1敲除動物(sgk1-/-，空心柱)和同窩野生型(sgk1+/+，實心柱)的成纖維細胞中CTGF蛋白的豐度(作為β-微管蛋白表達的函數)的算術平均值±SEM(下圖，n＝6，*顯著性差異，P＜0.05)。
附加方法和材料實施例1動物實驗SGK1缺失的小鼠依據以前的描述(9)產生。在麻醉(腹膜注射美托咪定0.5mg/kg+咪噠唑侖5mg/kg+芬太尼0.05mg/kg，可通過皮下注射阿替美唑2.5 mg/kg+氟馬西尼0.5mg/kg+納絡酮1.2mg/kg恢復)狀態下，分別向野生型(sgk1+/+)和SGK1敲除(sgk1-/-)的小鼠的頸部區域植入21天釋放50mg DOCA的小丸(美國創新研究(Innovative Research ofAmerica)，Sarasota，FL)。在植入DOCA小丸一天前，sgk1-/-和sgk1+/+小鼠被稱重，并分別單獨地放入代謝籠中(Tecniplast Hohenpeissenberg，Germany)進行24小時的基底尿液收集。小鼠可以自由攝取標準小鼠飼料(Altromin，Heidenau，Germany)和自來水和/或1％或2％NaCl。代謝籠的內壁是硅質的，并且尿液收集在水-飽和的油下。通過尾動脈測壓法在DOCA/1％NaCl處理前、處理1、2、4、6、10和14天時測量心臟收縮期動脈血壓。在DOCA/高鹽處理18天時，再次測定24小時收集的尿液和體重，將動物麻醉(腹膜內注射克他命(Ketamin)和甲苯噻嗪(Xylazine))并且通過穿刺小鼠后眼窩血管從肝素化的毛細血管叢中采集200μl血液。在血漿和尿液中，用火焰光度計(ELEX 6361，Eppendorf，Germany)測量Na+和K+的濃度，用電勢滴定法(氯化物定量器6610，Eppendorf，Germany)測定Cl-的濃度，用商用的診斷試劑盒(Sigma，Munich，Germany)測定Ca2+、磷和肌酸酐的濃度。
實施例2顯微術將未處理的或DOCA/高鹽處理后(18天)的sgk1+/+和sgk1-/-小鼠麻醉后，迅速取出心臟，測重，固定在4％多聚甲醛/0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中過夜，并且包埋在石蠟中。將5μm厚的脫臘心臟肌肉切片用H & E和Masson三色法染色(30)。在Zeiss Axioplan顯微鏡(Zeiss，Jena，Germany)下分析染色的石蠟切片。用Axiocam攝影機并通過廠商的軟件在數字化的圖像中測量區域。總組織區域用4×物鏡測量；纖維化區域通過20×物鏡確定并定量。之后以占總組織區域的百分比計算纖維化的程度。
實施例3微列陣分析根據廠商的說明書，用Qiagen RNeasy纖維組織中型試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)分別提取來自于未處理的或者DOCA/高鹽(48h)處理的sgk1+/+和sgk1-/-小鼠的心臟的總RNA。應用可商購的試劑盒(Invitrogen Life Technologies，Rockville，MD)和寡脫氧胸苷(dT)24 T7引物，用DOCA/高鹽處理或假處理的sgk1-/-和sgk1+/+小鼠的心臟總RNA進行第二鏈合成。通過利用T7啟動子偶聯的雙鏈cDNA作為模板和T7RNA轉錄標記試劑盒(ENZO Diagnostics，Farmingdale，NY)進行體外轉錄，生物素標記的CTP和UTP用來生成cRNA。將cRNA斷裂并且雜交到小鼠基因組MOE430A寡核苷酸陣列芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)上。用藻紅蛋白綴合的鏈霉抗生素蛋白(分子探針，Invitrogen LifeTechnologies，Rockville，MD)將陣列芯片染色，并用激光共聚焦掃描儀(Agilent，Affymetrix，Santa Clara，CA)確定熒光強度。掃描圖像的強度用Microarray Suite Version 5(Affymetrix，Santa Clara，CA)分析。對于所有的陣列都要進行全局標定，從而每個陣列的平均強度是相當的。在全局標定中，每個探針池的原始信號值要乘以一個標度因子。信號對數比為0.5的表達量顯著性改變的基因通過數據挖掘工具(Affymetrix，SantaClara，CA)確定。
實施例4調節SGK1的化合物4.1.通式I的化合物及其可藥用的衍生物、鹽、溶劑合物和立體異構體，包括混合物。
其中，R1，R5為H、OH、OA、OAc或者甲基，R2，R3，R4，R6，R7，R8，R9，R10為H、OH、OA、OAc、OCF3、Hal、NO2、CF3、A、CN、OSO2CH3、SO2CH3、NH2或者COOH，R11為H或CH3，A為具有1、2、3或者4個碳原子的烷基，X為CH2、CH2CH2、OCH2或者-CH(OH)-，Hal為F、Cl、Br或者I。
式I的化合物，其選自下組的化合物(3-羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-羥基-苯基)-乙酸-[1-(4-羥基-2-甲氧基-苯基)-亞乙基]-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，苯乙酸-(3-氟-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(4-羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，
(3，4-二氯-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，間甲苯基-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，鄰甲苯基-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(2-氯-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-氯-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(4-氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(2-氯-4-氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2，6-二甲基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(3-氟-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-[1-(4-羥基-2-甲氧基-苯基)-亞乙基]-酰肼，(3-甲基磺酰氧基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3，5-二羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-氟-苯基)-乙酸-(3-氟-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(4-乙酰氧基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-三氟甲基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，3-(3-甲氧基-苯基)-丙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2，4-二羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯氧基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-硝基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(5-氯-2-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2-羥基-5-硝基-亞芐基)-酰肼，2-羥基-2-苯基-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-(2-乙氧基-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-溴-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，(3-甲氧基-苯基)-乙酸-[1-(4-羥基-苯基)-亞乙基]-酰肼，(3，5-二氟-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲氧基-亞芐基)-酰肼，
(3-羥基-苯基)-乙酸-(4-羥基-2-甲基-亞芐基)-酰肼，(3-羥基-苯基)-乙酸-(2-乙氧基-4-羥基-亞芐基)-酰肼，(3-羥基-苯基)-乙酸-(2-甲氧基-4-羥基-6-甲基-亞芐基)-酰肼，(2-氟-苯基)-乙酸-(2-甲氧基-4-羥基-亞芐基)-酰肼4.2通式II的化合物及其可藥用的衍生物、鹽、溶劑合物和立體異構體，包括混合物。
其中R1、R2、R3、R4、R5是H、A、OH、OA、鏈烯基、鏈炔基、NO2、NH2、NHA、NA2、Hal、CN、COOH、COOA、-OHet、-O-亞烷基-Het、-O-亞烷基-NR8R9或CONR8R9，從R1、R2、R3、R4、R5中選擇的兩個基團還可以是-O-CH2-CH2-、-O-CH2-O-或-O-CH2-CH2-O-，R6、R7為H、A、Hal、OH、OA或CN，R8、R9為H或A，Het是飽和或不飽和的具有1到4個氮、氧和/或硫原子的雜環，該雜環被一個或多個Hal、A、OA、COOA、CN或羰基氧(＝O)取代，A為具有1到10個碳原子的烷基，其中1-7個氫原子可以被氟和/或氯所取代，X、X’是NH或不存在，Hal為F、Cl、Br或I。
式II的化合物，其選自下組的化合物1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-氯-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，4-二氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，6-二氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(3-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-氟-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-甲基-5-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，3，4，5，6-五氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，4-二溴-6-氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-6-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-5-甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2，3，4-三氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(4-溴-2，6-二氟-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-(2-氟-3-三氟甲基-苯基)-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-(1-叔丁氧羰基-哌啶-4-基)-苯基]-脲，N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-2，4-二氯-苯甲酰胺，N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-4-氯-5-三氟甲基-苯甲酰胺，N-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-2-氟-5-三氟甲基-苯甲酰胺，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-5-三氟甲基-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氟-5-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[5-氟-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氯-5-三氟甲基-2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-(哌啶-4-基氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氟-5-(2-二乙氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氟-5-[2-(哌啶-1-基)-乙氧基]-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-(2-二乙氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-[2-(嗎啉-4-基)-乙氧基]-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氟-2-[2-(嗎啉-4-基)-乙氧基]-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[3-氯-4-(2-二乙氨基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[4-氯-2-(2-二甲氧基-乙氧基)-苯基]-脲，1-[4-(4-氨基-5-氧代-5H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-8-基)-苯基]-3-[2-氯-5-(2-二乙氨基-乙氧基)-苯基]-脲。
實施例5SGK1核苷酸多態性定義兼性(facultative)高血壓病人的內含子6中的核苷酸序列為...aattacattCgcaacccag...，然而代表健康人群的核苷酸序列為...aattacattTgcaacccag...。所述序列可由登錄號GI 2463200的2071位得到。
兼性高血壓病人的外顯子8的序列或者為純合態..tactgaCttcggact..或....tactgaTttcggact....，或者為雜合態..tactgaCttcggact..和..tactgaTttcggact..。所述序列可由登錄號NM_005627.2的777位得到。
而具有TT核苷酸組合的純和個體是受保護的，即使在內含子6中同時具有CC單核苷酸多態現象也是如此。
實施例6細胞培養為了從sgk1+/+和sgk1-/-小鼠(8-14周齡)中獲得肺成纖維細胞，將完整的肺取出并轉移到90mm含有兩毫升DMEM的細胞培養皿中，其中DMEM中補充加入了10％胎牛血清，100U/ml的青霉素，100mg/ml的鏈霉素和2mM的L-谷氨酸(Gibco-Invitrogen，Karlsruhe，Germany)。將組織切成小片，并在標準的細胞培養條件下培養(37℃，5％CO2)。在最初鋪板后2-4天觀察到細胞生長。通過纖連蛋白陽染來鑒定成纖維細胞，并且在試驗中使用傳至第2-6代之間的細胞。DOCA處理后SGK1 mRMA量的增加和sgk1-/-小鼠中SGK1的缺失通過實時PCR檢測(數據未出示)。
實施例7Western印跡分析分別將未處理的和DOCA/高鹽處理(18天)的sgk1+/+和sgk1-/-小鼠的整個心臟取出，并立即冰凍在液氮中，之后用玻璃的勻漿器將組織在裂解液中進行勻漿，裂解液含有50mM Tris-HCl，PH7.4，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，50mM氟化鈉，5mM焦磷酸鈉，1mM原釩酸鈉，1％Triton(三硝基甲苯)X-100，1％脫氧膽酸鈉，1％十二烷基硫酸鈉(sodium doecyl sulphate)和蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Basel，Switzerland)，勻漿物在10,000轉，4℃下離心15min，取上清進行Western印跡分析。將在60mm培養皿中培養的sgk1+/+和sgk1-/-小鼠肺成纖維細胞撤去血清培養18h，之后加入DOCA(10μM)24h后將細胞裂解。總的細胞裂解物(50μg)和心臟的勻漿物(70μg)通過SDS-page(10％Tris-甘氨酸)分離，轉移到硝酸纖維素膜上，在封閉緩沖液(5％的無脂牛奶溶解在含有0.1％Tween的PBS中)封閉1h后，在4℃中與山羊多克隆抗體CTGF的一抗(1∶1400在封閉緩沖液中稀釋，Santa Cruz，Heidelberg，Germany)溫育過夜。與HRP綴合的抗山羊的二抗(Santa Cruz，Heidelberg，Germany)溫育后，根據廠商的說明，用ECL觀察(Amersham，Freiburg，Germany)。膜也用β-微管蛋白(Santa Cruz，Heidelberg，Germany)的一抗探測作為上樣對照。應用Scion成像系統(Scion，Maryland，USA)進行CTGF的光密度分析，并用β-微管蛋白進行標準化。
參考文獻1.放療/照射[Flanders等人，2003；Gervaz等人，2003；Quan等人，2002；Vozenin-Brotons等人，2003]2.腫瘤[Hishikawa等人，1999；Kasaragod等人，2001；Koliopanos等人，2002；Li和Sarkar 2002；Moritani等人，2003；Shimo等人，2001]Vascularization.
3.肉芽腫疾病[Babic等人，1999；Shimo等人，1999][Inkinen等人，2003]4.器官和移植物排異[Franceschini等人，2003；Inkinen等人，2001]5.紅斑狼瘡[Bao等人，2003]6.動脈硬化和低氧[Harlow和Hillier 2002；Ruperez等人2003；Schober等人，2002；Schober等人，2003][Honda等人，2001；Kondo等人，2002；Shimo等人，2001]7.氧化應激[Park等人，2001]8.心肌梗塞和局部缺血[Ohnishi等人，1998；Simkhovich等人，2003；Way等人，2002]9.心臟肥大和纖維化[Buchhorn等人，2003；Chen等人，2000；Finckenberg等人，2001]10.腎小球腎炎和腎小球硬化[Ito等人，2001；Kanemoto等人，2003]，[Chen等人，2003；Gupta等人，2000]11.(腎小管間質)腎纖維化[Gupta等人，2000；Inoue等人，2003]12.糖尿病[Gilbert等人，2003；Tikellis等人，2004；Wada等人，2002]13.(纖維化)胰腺炎(Fibrosing)pancreatitis[di Mola等人，1999；Schuppan等人，2000；Vogelmann等人，2001]14.肝硬化、脂肪性肝炎和膽汁纖維化[Abou-Shady等人，2000；Hayashi等人，2002；Kamada等人，2003；Kurikawa等人，2003；Schuppan等人，2000]，[Paradis等人，2001]，[Sedlaczed等人，2001]15.纖維化和炎癥性腸病[Dammerer等人，1998；Schuppan等人，2000]
16.治療的消化性潰瘍[Lempinen等人，2002]17.腹內粘連[Thaler等人，2002]18.腹膜透析中的腹膜纖維化[Zarrinkalam等人，2003]19.肺纖維化[Allen等人，1999；Atamas and White 2003；Bonniaud等人，2003；Howell等人，2001；Kelly等人，2003]20.纖維性肺泡炎、肺結節病和/或哮喘[Millar 2000]，[Allen等人，1999]，[Burgess等人，2003]21.卵巢功能障礙[Harlow等人，2002；Harlow和Hillier 2002]22.子宮肌瘤[Sampath等人，2001]23.關節炎[Varga和Kahari 1997]，24.肌肉疼痛(肌痛)和筋膜炎(Varga和Kahari，1997)25.(假)硬皮病[Atamas和White 2003；Igarashi等人，1996；Leask等人，2004；Querfeld等人，2000]26.治療的瘢痕瘤[Igarashi等人，1996；Liu等人，2003]27.齒齦肥大[Hong等人，1999；Uzel等人，2001]28.瘢痕形成[Liu等人，2003；Wada等人，2002]29.角膜中瘢痕或結締組織的紊亂形成[Ivarsen等人，2003；Razzaque等人，2003；van Setten等人，2003].Occular fluid[van Setten等人，2002]and in the retian[Honda等人，2001]30.青光眼[Esson等人，2004]31.大腦病變[Hertel等人，2000]including cerebral infarction[Schwab等人，2000]32.阿爾茨海默病[Ueberham等人，2003]33.傷口愈合[Flanders等人，2003；Thomas和Harding 2002；Wang等人，2001]34.骨折后的骨骼愈合[Fukunaga等人，2003；Kanyama等人，2003；Nakanishi等人，2001；Nakata等人，2002；Pereira等人，2000；Takigawa等人，2003]
權利要求
1.一種改變結締組織生長因子(CTGF)活性和表達的方法，包括將表達SGK1、SGK2、SGK3的細胞和調節糖皮質激素誘導激酶的物質相接觸。
2.根據權利要求1的方法在制備用于治療由CTGF上調或下調引起的纖維增生性紊亂的藥物中的用途。
3.根據權利要求2的方法，其中所述疾病選自下組的纖維增生性紊亂照射引起的疾病、腫瘤、血管形成、肉芽腫疾病、器官和移植物排異、紅斑狼瘡、動脈硬化、低氧、氧化應激、心肌梗塞和局部缺血、心臟肥大和纖維化、腎小球腎炎和腎小球硬化、腎纖維化、糖尿病、纖維性胰腺炎、肝硬化、脂肪性肝炎和膽汁纖維化、纖維化和炎癥性腸病、消化性潰瘍、腹內粘連、腹膜透析中的腹膜纖維化、肺纖維化、纖維性肺泡炎、肺結節病和/或哮喘、卵巢功能障礙、子宮肌瘤、關節炎、肌肉疼痛/肌痛和筋膜炎、硬皮病、瘢痕瘤、齒齦肥大、包括角膜、眼房水和視網膜的不同器官中瘢痕或結締組織的形成、青光眼、包括大腦梗塞在內的大腦病變、阿爾茨海默病、傷口愈合、拔牙后的愈合、骨骼愈合和生長、骨折修復。
4.一種確定纖維增生性紊亂的進展、消退或發作的方法，其通過測量組織樣品和樣本中SGK1、SGK2或SGK3上調的表達來實現。
5.根據權利要求4的方法，其中SGK1包括選定的單核苷酸多態性變體。
6.根據權利要求4-5的疾病診斷的方法，其中疾病選自下組照射引起的疾病、腫瘤、血管形成、肉芽腫疾病、器官和移植物排異、紅斑狼瘡、動脈硬化、低氧、氧化應激、心肌梗塞和局部缺血、心臟肥大和纖維化、腎小球腎炎和腎小球硬化、腎纖維化、糖尿病、纖維化胰腺炎、肝硬化、脂肪性肝炎和膽汁纖維化、纖維化和炎癥性腸病、消化性潰瘍、腹內粘連、腹膜透析中的腹膜纖維化、肺纖維化、纖維性肺泡炎、肺結節病和/或哮喘、卵巢功能障礙、子宮肌瘤、關節炎、肌肉疼痛/肌痛和筋膜炎、硬皮病、瘢痕瘤、齒齦肥大、包括角膜、眼房水和視網膜的不同器官中瘢痕或結締組織的形成、青光眼、包括大腦梗塞在內的大腦病變、阿爾茨海默病、傷口愈合、拔牙后的愈合、骨骼愈合和生長、骨折修復。
7.選自通式I或II中所列化合物的SGK1抑制劑在制備用于治療由于結締組織生長因子的調節異常引起的紊亂中的用途。
全文摘要
本發明公開了調節糖皮質激素誘導激酶以恢復結締組織生長因子活性的方法。也公開了用于檢測和治療纖維增生性紊亂的方法和化合物。
文檔編號A61K31/165GK1964705SQ200580007792
公開日2007年5月16日 申請日期2005年2月8日 優先權日2004年3月11日
發明者F·朗 申請人:默克專利有限公司