酶解豆粕制備ace抑制肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品技術領域，尤其是涉及一種酶解豆柏制備ACE抑制肽的方法。
【背景技術】
[0002]ACE抑制肽，即血管緊張素轉化酶抑制肽(ACEIP ,Ang1tensin ConvertingEnzyme Inhibitory Peptides)，是一些具有抑制血管緊張素轉化酶(ACE)活性的多肽物質，這些多肽的氨基酸序列和肽鏈長度各有不同，但都具有類似的功能，即有降血壓的功能，所以又稱為降血壓肽。1981年第一個合成口服有效的肽類ACE抑制劑一一巰甲丙脯酸(captopril)問世，迄今已有許多化學合成的ACE抑制劑應用于臨床。然而這類藥物作用時間不長，停藥后會使血壓反彈;經腎臟排出易損害腎功能，有一定的副作用。國內外研究表明，食源性蛋白質酶解產物中的一些短肽具有廣泛的生理調節功能，特別是具有降血壓活性的ACE抑制肽受到廣泛的關注，這些降血壓肽只對高血壓患者起降壓作用，對血壓正常者無降壓作用，這些肽又是利用酶解技術從蛋白質中提取得到的，安全性很高。
[0003]高溫豆柏是由大豆浸油后，經高溫脫溶所得。豆柏中約含45%-50%的蛋白質，以及10%-15%的低聚糖、20%-25%的多糖和纖維素，有很高的開發和利用價值。我國是世界產糧和產油大國，每年糧油加工中產生大量豆柏副產品，豆柏資源豐富。目前高溫豆柏主要用作飼料，在食品上的應用極少，只限于釀造食品。酶水解豆柏是利用現代生物技術將大豆蛋白通過蛋白酶酶解為可溶性蛋白和小分子多肽的混合物。來源于大豆蛋白的ACE抑制肽的降壓效果雖然不及化學合成的降血壓藥，但其無毒副作用，安全性高，且對血壓正常者無降壓作用，特別適用于作為口服藥劑或功能性食品基料，添加制成各種保健食品，用來預防、緩解和輔助治療高血壓。
[0004]目前，ACE抑制肽沒有投入大規模的生產應用，其主要原因是:缺乏價廉有效、便于生產的酶制劑，不能有效實現酶解產物分子量的控制，嚴重影響后期純化效果;無法有效解決酶解產物苦味問題，限制其在食品領域的應用。
[0005]為了提高豆柏資源的利用率，提高大豆肽的水解度，降低ACE抑制肽的生產成本，生產穩定性好、適用性廣的ACE抑制肽粉末狀產品，本發明以大豆柏為原料，選取價格低廉、作用效果明顯、條件容易控制的酶制劑，優化酶解條件，探索有效地提純方法，提高ACE抑制肽提取效率，以期解決目前酶解法工業化制備ACE抑制肽急需解決的問題，開拓ACE抑制肽的工業化生產之路。本發明一方面增加了豆柏的附加值，創造良好的經濟效益和市場價值；另一方面，將豆柏ACE抑制肽的降壓功能得到最大化利用，具有良好的應用價值和社會效益。

【發明內容】

[0006]有鑒于此，本發明旨在提出一種酶解豆柏制備ACE抑制肽的方法，提升了現有豆柏資源的利用價值，加工制備出食源性具有ACE抑制活性的豆柏蛋白肽。
[0007]為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的:
[0008]一種酶解豆柏制備ACE抑制肽的方法，包括如下步驟:
[0009](I)豆柏預處理
[0010]將高溫豆柏進行粉碎、過篩，所得豆柏粉與水以質量比為1:(4-6)的配比進行混合，攪拌均勻，調節PH值為8-10，進行超聲，得到豆柏混合物；
[0011]⑵酶解
[0012]調節豆柏混合物的pH值為7-9，加入豆柏混合物質量的3%_5 %的復合酶制劑，混合均勻，在35-50°C溫度下，水解時間5-8小時，然后將水解液沸水浴煮沸滅酶，冷卻至室溫，得到混合液;其中，復合酶制劑包括由堿性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶的原料制成;其中，堿性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶的質量比為(5-7):(3-5):(1-3):(2-4): (2-4): (1_3);
[0013](3)分離
[0014]調節混合液的pH值為6.5-7.5，進行離心，取上清液，將上清液進行超濾處理，得到濾過液；
[0015](4)將濾過液真空冷凍干燥，得到ACE抑制肽粉末。
[0016]進一步，:所述的步驟(I)中過篩步驟的篩子選擇60目篩。
[0017]進一步，所述的步驟(I)中超聲步驟的條件為:功率150-400W，溫度40_50°C，時間10_20mino
[0018]進一步，所述的步驟(I)中粉碎步驟使用粉碎機。
[0019]進一步，所述的步驟(2)中沸水浴步驟的時間為10-20min。
[0020]進一步，所述的步驟(3)中離心步驟使用高速冷凍離心機。
[0021 ] 進一步，所述的步驟(3)中離心步驟的條件為:轉速4000-4500r/min，時間10-20mino
[0022]進一步，所述的步驟(3 )中超濾步驟將上清液分別通過101(0&、61(0&、31(0&的超濾膜進行超濾處理。
[0023]進一步，所述的步驟(3)中堿性蛋白酶的酶活為11000U/g，胰蛋白酶的酶活為ιοοοου/g，枯草桿菌蛋白酶的酶活為100000U/g，中性蛋白酶為50000U/g，木瓜蛋白酶的酶活為2000000U/g，菠蘿蛋白酶的酶活為1000000U/g。
[0024]相對于現有技術，本發明所述的酶解豆柏制備ACE抑制肽的方法具有以下優勢:
[0025]本發明所述的酶解豆柏制備ACE抑制肽的方法采用的原料新，資源豐富，可以充分開發高溫豆柏的利用價值;本發明的工藝簡單易行，整個過程反應條件溫和，使用復配好的復合酶制劑，便于工業化加工操作，可制備成膠囊類制品，方便保存和食用;本發明的應用范圍廣泛，制備的食源性ACE抑制肽產品，ACE抑制率可達到35 %?44 %，食用安全性高，可作為藥品、功能性食品、食品、食品添加劑等進一步加工利用。
【具體實施方式】
[0026]除非另外說明，本文中所用的術語均具有本領域技術人員常規理解的含義，為了便于理解本發明，將本文中使用的一些術語進行了下述定義。
[0027]所有的數字標識，例如PH、溫度、時間、濃度，包括范圍，都是近似值。要了解，雖然不總是明確的敘述所有的數字標識之前都加上術語“約”。同時也要了解，雖然不總是明確的敘述，本文中描述的試劑僅僅是示例，其等價物是本領域已知的。
[0028]本發明中涉及到的ACE抑制率測定方法如下:
[0029]取40yL待測液于試管中，與含5mM馬尿酰-組氨酰-亮氨酰(HHL)作底物的0.1M硼酸緩沖液(含0.3MNaCl，pH值為8.3)相混合，再與20yL酶液(0.lU/mL)混合。將混合液在37°C反應60min，加入150yL IN鹽酸終止反應。再加入1.0mL乙酸乙酯，振蕩20秒，3000r/min離心10111；[11，分離上層0.81]11^乙酸乙酯層。將該層在120°(3加熱40111；[11以揮去溶劑，加31]11^蒸饋水，振蕩約20s。提取出的馬尿酸在228nm處測其吸收值。
[0030]ACE抑制率以下列公式計算:
[0031 ] ACE抑制率=((A-B)/(A-C)) X 100%
[0032]A:228nm空白對照品吸收值
[0033]B:228nm待測樣品吸收值
[0034]C:228nm既無酶又無樣品吸收值
[0035]下面結合實施例來詳細說明本發明。
[0036]實施例1
[0037]—種酶解豆柏制備ACE抑制肽的方法，包括如下步驟:
[0038](I)豆柏預處理
[0039]將高溫豆柏使用粉碎機進行粉碎、過60目篩，所得豆柏粉與水以1:5的質量比混合，攪拌均勻，調節pH值為9，進行超聲，超聲功率300W，溫度40°C，時間15min得到豆柏混合物；
[0040](2)酶解
[0041 ]調節豆柏混合物的pH值為7.2，加入豆柏混合物質量的4%的復合酶制劑，混合均勻，在40°C溫度下，水解時間6小時，然后將水解液沸水浴煮沸滅酶lOmin，冷卻至室溫，得到混合液;其中，復合酶制劑包括由堿性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶的原料制成;堿性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶的質量比為6:4:1:3:2:1;堿性蛋白酶的酶活為11000U/g，胰蛋白酶的酶活為10000U/g，枯草桿菌蛋白酶的酶活為100000U/g，中性蛋白酶為50000U/g，木瓜蛋白酶的酶活為2000000U/g，菠蘿蛋白酶的酶活為1000000U/g;
[0042](3)分離
[0043]調節混合液的pH值為7，使用高速冷凍離心機進行離心，離心轉速4000r/min，時間1min，取上清液，將上清液先后通過1KDa、6KDa、3KDa的超濾膜進行超濾處理，得到濾過液；
[0044](4)將濾過液真空冷凍干燥，得到ACE抑制肽粉末。
[0045]將所述的ACE抑制肽粉末進行ACE抑制率的測定，測定得到ACE抑制肽粉末的抑制率為39%。
[0046]實施例2
[0047]一種酶解豆柏制備ACE抑制肽的方法，包括如下步驟:
[0048](I)豆柏預處理
[0049]將高溫豆柏使用粉碎機進行粉碎、過60目篩，所得豆柏粉與水以1:4的質量比混合，攪拌均勻，調節PH值為8，進行超聲，超聲功率400W，溫度40°C，時間1min得到豆柏混合物；
[0050](2)酶解
[0051]調節豆柏混合物的pH值為8，加入豆柏混合物質量的5%的復合酶制劑，混合均勻，在50°C溫度下，水解時間5小時，然后將水解液沸水浴煮沸滅酶lOmin，冷卻至室溫，得到混合液;其中，復合酶制劑包括由堿性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、