技術領域

本發明屬(shu)于醫(yi)藥領(ling)域，涉及Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗原表(biao)位多肽以及其在制(zhi)備檢(jian)測(ce)或治療類風關(RA)滑膜細(xi)胞(bao)(FLS)增生、銀(yin)屑病(bing)表(biao)皮細(xi)胞(bao)增生及炎癥(zheng)疾病(bing)的藥物中的用途。

背景技術：

Cyr61(cysteine-rich 61)，又稱為(wei)CCN1，是(shi)一(yi)種由381個氨(an)基(ji)(ji)酸殘基(ji)(ji)的(de)(de)相(xiang)對分(fen)(fen)(fen)子(zi)質量(liang)為(wei)42kDa的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)泌蛋(dan)白(bai)(bai)，最早被克隆的(de)(de)Cyr61/CCN1是(shi)1985年(nian)Lau等在用血(xue)(xue)清或血(xue)(xue)小(xiao)板(ban)衍(yan)生生長因(yin)(yin)子(zi)(PDGF)刺(ci)激小(xiao)鼠BALB/c 3T3成(cheng)纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)時發現的(de)(de)，因(yin)(yin)富含(han)半胱氨(an)酸(含(han)10％的(de)(de)半胱氨(an)酸殘基(ji)(ji))被命名為(wei)Cyr61/CCN1。Cyr61/CCN1具有明顯的(de)(de)促有絲分(fen)(fen)(fen)裂活(huo)性和趨化(hua)性，可誘導成(cheng)纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)與表皮細(xi)胞(bao)增殖和分(fen)(fen)(fen)泌細(xi)胞(bao)外(wai)基(ji)(ji)質，參與調(diao)節細(xi)胞(bao)增生、分(fen)(fen)(fen)化(hua)、胚胎發育形成(cheng),是(shi)生命活(huo)動(dong)的(de)(de)基(ji)(ji)本蛋(dan)白(bai)(bai)。

在抗(kang)原(yuan)抗(kang)體(ti)的(de)(de)(de)結合(he)(he)(he)反應中，抗(kang)體(ti)參與結合(he)(he)(he)的(de)(de)(de)部位(wei)稱(cheng)抗(kang)體(ti)的(de)(de)(de)對位(wei)(paratope)，而(er)抗(kang)原(yuan)(Cyr61/CCN1蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai))參與結合(he)(he)(he)的(de)(de)(de)部位(wei)稱(cheng)為抗(kang)原(yuan)的(de)(de)(de)表(biao)位(wei)(epitope)。表(biao)位(wei)是蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質抗(kang)原(yuan)性(xing)的(de)(de)(de)基礎。抗(kang)原(yuan)表(biao)位(wei)(小(xiao)分(fen)子肽段(duan))的(de)(de)(de)確(que)定對于明確(que)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)作用(yong)(yong)(yong)位(wei)點即小(xiao)分(fen)子肽段(duan)、進而(er)設計(ji)采(cai)用(yong)(yong)(yong)該(gai)(gai)小(xiao)分(fen)子肽段(duan)而(er)模擬(ni)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)作用(yong)(yong)(yong)、或(huo)者設計(ji)能夠模擬(ni)該(gai)(gai)肽段(duan)的(de)(de)(de)小(xiao)分(fen)子化合(he)(he)(he)物(wu)(wu)用(yong)(yong)(yong)于代替(ti)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)或(huo)肽分(fen)子的(de)(de)(de)作用(yong)(yong)(yong)、或(huo)者設計(ji)小(xiao)分(fen)子化合(he)(he)(he)物(wu)(wu)以阻斷該(gai)(gai)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)作用(yong)(yong)(yong)具有重要意義(yi)，這也是當今國際(ji)上流行的(de)(de)(de)新型藥物(wu)(wu)的(de)(de)(de)發展(zhan)和制備方法(fa)之一(yi)。

技術實現要素：

本發明提供了(le)Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)抗原表(biao)位多肽，其氨基酸序(xu)列如SEQ ID NO.1所示，為GLECNFG。

本(ben)發明還提供了(le)Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽(tai)(tai)，其為如SEQ ID NO.2所(suo)(suo)示的環狀(zhuang)肽(tai)(tai)段，即在(zai)SEQ ID NO.1的肽(tai)(tai)段的N端添加一個半胱氨基酸，從而(er)構成如SEQ ID NO.2所(suo)(suo)示的環狀(zhuang)肽(tai)(tai)段“C-G LECNF G”。

本發明的Cyr61/CCN1蛋(dan)白抗(kang)原表位(wei)多肽(tai)是位(wei)于(yu)Cyr61/CCN1蛋(dan)白的第75-81位(wei)氨基酸，能夠(gou)和特異性抗(kang)Cyr61/CCN1單抗(kang)093G9結合(KD為(wei)10-7)并在體內外中和Cyr61/CCN1功能，當N端(duan)添加一個C時可(ke)經人工合成為(wei)環狀肽(tai)段“C-G LECNF G”。

本發明中(zhong)，Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)(bai)抗原表位多(duo)肽可通過蛋(dan)白(bai)(bai)酶水(shui)解制備得到，Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)(bai)抗原表位多(duo)肽還可以通過常規的(de)固相多(duo)肽合成方法(fa)合成或基因工程(cheng)技術制備得到。

本發明(ming)中，根據基因(yin)庫檢(jian)索所(suo)得(de)的人Cyr61/CCN1蛋白(bai)全長序列(GenBank：M_001554)，如SEQ ID NO.3所(suo)示，為：

其(qi)中，黑(hei)框中序列為Cyr61/CCN1蛋白的信號肽。

本發明(ming)還提(ti)供了特(te)異性抗Cyr61/CCN1單抗，所述特(te)異性抗Cyr61/CCN1單抗能與本發明(ming)Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗原(yuan)表(biao)位多(duo)肽結(jie)合。

本發明還提供了Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗原(yuan)表位多肽的抑制劑，其能與本發明Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗原(yuan)表位多肽結合、能與GLECNFG環狀(zhuang)結構(gou)結合、并能夠(gou)阻斷由此介導的生(sheng)物學功(gong)能。

本(ben)發明Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗(kang)原(yuan)表(biao)(biao)(biao)位(wei)多(duo)肽(tai)的(de)(de)抑制劑(ji)，包(bao)括(kuo)能夠(gou)阻(zu)(zu)(zu)斷(duan)Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗(kang)原(yuan)表(biao)(biao)(biao)位(wei)多(duo)肽(tai)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)學功能的(de)(de)小(xiao)分子(zi)(zi)化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)。較(jiao)佳地(di)，如本(ben)發明實施例所(suo)示的(de)(de)小(xiao)分子(zi)(zi)化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)SC1-SC15。具(ju)體(ti)地(di)，可以(yi)根據(ju)Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗(kang)原(yuan)表(biao)(biao)(biao)位(wei)多(duo)肽(tai)的(de)(de)肽(tai)段構象表(biao)(biao)(biao)位(wei)能夠(gou)設(she)計具(ju)有模擬(ni)和抑制該(gai)肽(tai)段生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)學功能的(de)(de)小(xiao)分子(zi)(zi)化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)。能夠(gou)阻(zu)(zu)(zu)斷(duan)該(gai)多(duo)肽(tai)肽(tai)段的(de)(de)小(xiao)分子(zi)(zi)化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)具(ju)有抑制Cyr61/CCN1分子(zi)(zi)病(bing)理(li)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)學的(de)(de)作用(yong)，這對于進(jin)一(yi)步發展成為先導化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)及其在制備抗(kang)滑膜(mo)增(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)和骨破壞、抗(kang)Cyr61/CCN1高(gao)表(biao)(biao)(biao)達乳腺癌細(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)殖、抗(kang)表(biao)(biao)(biao)皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)過度增(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)以(yi)及抗(kang)纖維(wei)(wei)(wei)化(hua)(hua)(hua)(如肝(gan)纖維(wei)(wei)(wei)化(hua)(hua)(hua))的(de)(de)藥物(wu)(wu)(wu)(wu)均有重(zhong)要用(yong)途。本(ben)發明抑制劑(ji)能夠(gou)和GLECNFG環狀結構相結合(he)(he)(he)、并能夠(gou)阻(zu)(zu)(zu)斷(duan)由此介導的(de)(de)病(bing)理(li)作用(yong)(包(bao)括(kuo)致(zhi)(zhi)炎，致(zhi)(zhi)纖維(wei)(wei)(wei)母細(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)、致(zhi)(zhi)Cyr61/CCN1高(gao)表(biao)(biao)(biao)達乳腺癌細(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)與(yu)轉移、致(zhi)(zhi)表(biao)(biao)(biao)皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)與(yu)活化(hua)(hua)(hua)等)。

本(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)之(zhi)前的研(yan)究(jiu)已經(jing)表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)，IL-17能夠上調Cyr61/CCN1的表(biao)(biao)(biao)達(da)，而(er)上調表(biao)(biao)(biao)達(da)Cyr61/CCN1能夠通過與滑(hua)膜(mo)細胞(bao)表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)整合(he)(he)素受體AvB5結合(he)(he)后而(er)促(cu)進(jin)滑(hua)膜(mo)細胞(bao)的過度增(zeng)(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)，并可促(cu)進(jin)金(jin)屬蛋白(bai)(bai)酶3和金(jin)屬蛋白(bai)(bai)酶9的合(he)(he)成而(er)參(can)與軟骨(gu)(gu)和骨(gu)(gu)破(po)壞(huai)。本(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)研(yan)究(jiu)表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)，Cyr61/CCN1蛋白(bai)(bai)能直接(jie)促(cu)進(jin)滑(hua)膜(mo)細胞(bao)產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)IL-6，從(cong)而(er)參(can)與炎(yan)癥發(fa)(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)發(fa)(fa)展。進(jin)一步地，本(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)研(yan)究(jiu)表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)Cyr61/CCN1還能夠促(cu)進(jin)人類表(biao)(biao)(biao)皮(pi)(pi)細胞(bao)增(zeng)(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)，參(can)與銀(yin)屑(xie)病(bing)發(fa)(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)。本(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)動物(wu)實(shi)驗中(zhong)還發(fa)(fa)現Cyr61/CCN1能夠介導干燥綜合(he)(he)征(zheng)、增(zeng)(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)型(xing)炎(yan)性(xing)腸病(bing)發(fa)(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)。本(ben)(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)實(shi)驗已經(jing)證(zheng)實(shi)用抗Cyr61/CCN1單抗中(zhong)和該蛋白(bai)(bai)表(biao)(biao)(biao)達(da)可以(yi)抑制(zhi)滑(hua)膜(mo)細胞(bao)增(zeng)(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)和IL-6產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)、減(jian)輕CIA模型(xing)中(zhong)關節炎(yan)的臨(lin)床癥狀和組織破(po)壞(huai)與炎(yan)癥；抑制(zhi)表(biao)(biao)(biao)皮(pi)(pi)細胞(bao)增(zeng)(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)，減(jian)輕銀(yin)屑(xie)病(bing)樣小鼠的皮(pi)(pi)膚(fu)增(zeng)(zeng)厚與鱗屑(xie)產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)、緩解(jie)干燥綜合(he)(he)征(zheng)和增(zeng)(zeng)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)型(xing)腸病(bing)動物(wu)模型(xing)的炎(yan)癥和臨(lin)床癥狀。

本發明制(zhi)備得到能夠結(jie)合(he)Cyr61/CCN1蛋白的(de)單(dan)克隆(long)抗(kang)(kang)體。這(zhe)些(xie)抗(kang)(kang)體表(biao)現出功能的(de)不同，其原因在于(yu)這(zhe)些(xie)不同的(de)單(dan)克隆(long)抗(kang)(kang)體所結(jie)合(he)的(de)抗(kang)(kang)原表(biao)位，也就是(shi)Cyr61/CCN1蛋白的(de)不同部位所造成的(de)。

本發明還提供了Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗原表(biao)位多肽在制(zhi)備檢測和/或治療炎(yan)癥(zheng)性(xing)疾(ji)病(bing)藥(yao)物中的應用。優選(xuan)地，所(suo)述(shu)炎(yan)癥(zheng)性(xing)疾(ji)病(bing)包括風濕性(xing)疾(ji)病(bing)、類風濕性(xing)關節炎(yan)、銀(yin)屑(xie)病(bing)。優選(xuan)地，所(suo)述(shu)炎(yan)癥(zheng)性(xing)疾(ji)病(bing)包括干燥綜合征。優選(xuan)地，所(suo)述(shu)炎(yan)癥(zheng)性(xing)疾(ji)病(bing)包括增生型炎(yan)性(xing)腸病(bing)。

本(ben)發(fa)明還(huan)提供(gong)了Cyr61/CCN1蛋白抗原(yuan)表(biao)(biao)(biao)位多肽在(zai)制備抗類(lei)風關滑膜細(xi)胞增(zeng)生(sheng)的(de)(de)藥物(wu)中的(de)(de)應用。本(ben)發(fa)明的(de)(de)實(shi)施例表(biao)(biao)(biao)明，能夠(gou)特異性中和(he)這(zhe)一抗原(yuan)表(biao)(biao)(biao)位的(de)(de)單克隆抗體(ti)(ti)093G9在(zai)體(ti)(ti)內和(he)體(ti)(ti)外(wai)可以抑(yi)(yi)制類(lei)風關及其(qi)(qi)動(dong)物(wu)模型(xing)的(de)(de)滑膜細(xi)胞增(zeng)生(sheng)抑(yi)(yi)制銀屑病(bing)及其(qi)(qi)動(dong)物(wu)模型(xing)的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)皮細(xi)胞增(zeng)生(sheng)、抑(yi)(yi)制干燥綜合征動(dong)物(wu)模型(xing)的(de)(de)癥狀和(he)炎癥、抑(yi)(yi)制增(zeng)生(sheng)型(xing)炎性腸病(bing)動(dong)物(wu)模型(xing)的(de)(de)炎癥和(he)癥狀。

本(ben)(ben)發(fa)明還(huan)提供了(le)Cyr61/CCN1蛋白抗原(yuan)表(biao)位(wei)多(duo)肽在制備抑(yi)(yi)制乳(ru)腺(xian)癌細胞高表(biao)達(da)的藥物中(zhong)(zhong)(zhong)的應用。本(ben)(ben)發(fa)明實(shi)施例表(biao)明，能夠特異性(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)和(he)Cyr61/CCN1蛋白抗原(yuan)表(biao)位(wei)的單克(ke)隆抗體(ti)(ti)093G9在體(ti)(ti)內(nei)和(he)體(ti)(ti)外可以抑(yi)(yi)制高表(biao)達(da)Cyr61/CCN1蛋白的乳(ru)腺(xian)癌細胞增(zeng)殖(zhi)、遷移和(he)侵襲，在動物模型(xing)(體(ti)(ti)內(nei))中(zhong)(zhong)(zhong)可以抑(yi)(yi)制該類(lei)型(xing)的腫瘤生(sheng)長(chang)和(he)淋巴轉(zhuan)移。

本(ben)發明還提供(gong)了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多(duo)肽在制備(bei)抗纖維化藥(yao)物中的(de)應(ying)用。

本發明(ming)還提供了(le)Cyr61/CCN1蛋(dan)白抗(kang)原(yuan)表(biao)(biao)位多肽在(zai)制備抗(kang)銀屑(xie)病(bing)的(de)藥物中(zhong)的(de)應用(yong)。本發明(ming)實施例表(biao)(biao)明(ming)，能夠特異性中(zhong)和這一抗(kang)原(yuan)表(biao)(biao)位的(de)單(dan)克(ke)隆抗(kang)體(ti)093G9在(zai)體(ti)內(nei)和體(ti)外(wai)可以抑制表(biao)(biao)皮細胞增殖、銀屑(xie)病(bing)樣小鼠的(de)皮膚增厚(hou)與鱗屑(xie)產生。

本發明還提供了Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗原表位多肽的抑制劑在制備(bei)治療風(feng)濕性(xing)疾(ji)病藥(yao)物中的應用。

對(dui)于本(ben)發明位于Cyr61/CCN1蛋白上的抗(kang)原表位進行功能分(fen)析表明，抗(kang)體093G9的識(shi)別肽段的環肽具有刺激類風關滑(hua)膜細胞體外(wai)增殖的作用，而對(dui)照抗(kang)體096B7的識(shi)別表位不具有這樣(yang)的特性(xing)，如圖1所示。

將所獲得(de)的(de)抗體識別表(biao)位用(yong)人工合成肽(tai)段(duan)，將這些(xie)肽(tai)段(duan)加入細胞(bao)(bao)培養中(zhong)觀(guan)察其生(sheng)物學特(te)性。結(jie)(jie)果發現某(mou)些(xie)肽(tai)段(duan)能(neng)夠(gou)抑制滑膜細胞(bao)(bao)和(he)Cyr61/CCN1高表(biao)達乳(ru)腺癌細胞(bao)(bao)株在體外(wai)增生(sheng)，表(biao)明其具(ju)有(you)模擬抗Cyr61/CCN1單抗的(de)作(zuo)用(yong)。因此，這些(xie)肽(tai)段(duan)及其能(neng)夠(gou)與之結(jie)(jie)合的(de)化合物小分子，均具(ju)有(you)抑制Cyr61/CCN1蛋白的(de)作(zuo)用(yong)，具(ju)有(you)制藥的(de)潛(qian)能(neng)。

本發明有益效果還包(bao)括Cyr61/CCN1蛋白抗(kang)原(yuan)表位(wei)多肽(tai)在研究開(kai)發治療類風(feng)濕(shi)關(guan)節炎(yan)(yan)、銀屑病(bing)、干燥綜合征、增生型炎(yan)(yan)性腸病(bing)的(de)(de)新(xin)藥物中(zhong)的(de)(de)應用。類風(feng)濕(shi)關(guan)節炎(yan)(yan)的(de)(de)發病(bing)率(lv)在中(zhong)國高達0.4-1％；銀屑病(bing)在中(zhong)國人(ren)中(zhong)的(de)(de)發病(bing)率(lv)高達0.3-0.5％，在白種人(ren)中(zhong)的(de)(de)發病(bing)率(lv)更高(如美國發病(bing)率(lv)為1-3％；挪(nuo)威發病(bing)率(lv)高達7％)，可見，本發明Cyr61/CCN1蛋白抗(kang)原(yuan)表位(wei)多肽(tai)及根據(ju)本表位(wei)發展的(de)(de)新(xin)藥物將有廣闊應用前景。

本(ben)發明肽段G LECNF G(114,環肽為(wei)111)表位(wei)的意義：根據“Trends Biochem Sci.2008October；33(10):461–473”報道序列：CCN家族分子序列的IGFBP區域的第(di)75-81位(wei)氨基酸中均含有G L C這樣三個(ge)保守氨基酸。

CCN1-LSTCPAAC--HCPLEA-PKCAPGVGLVRDGCGCCKVCAKQLNEDCSKTQPCDHTKGLECNFGAS-STALKGICRAQSE

CCN2VGQNCSGPC--RCPDEPAPRCPAGVSLVLDGCGCCRVCAKQLGELCTERDPCDPHKGLFCHFGSP-ANRKIGVC-TAKD

CCN3ATQRCPPQCPGRCPATP-PTCAPGVRAVLDGCSCCLVCARQRGESCSDLEPCDESSGLYCDRSAD–PSNQTGIC–TAVD

CCN4RPQFCKWPC--ECPPSP–PRCPLGVSLITDGCECCKMCAQQLGDNCTEAAICDPHRGLYCDYSGDRPRYAIGVC–AQVV

上述中(zhong)，涂色部分(fen)的(de)(de)(de)7個(ge)(ge)氨基酸是(shi)這個(ge)(ge)家族(zu)分(fen)子(CCN1-6)的(de)(de)(de)保(bao)守(shou)序列(lie)，但(dan)是(shi)，093G9只(zhi)能和Cyr61/CCN1結(jie)合(he)。雖然(ran)G LECNF G僅位(wei)于Cyr61/CCN1上，是(shi)093G9的(de)(de)(de)特(te)異性識別表位(wei)，但(dan)是(shi)其(qi)中(zhong)保(bao)守(shou)的(de)(de)(de)序列(lie)G-L-C在所有(you)CCN家族(zu)中(zhong)都有(you)。根據093G9不(bu)與(yu)線肽(tai)G LECNF G結(jie)合(he)、只(zhi)與(yu)環(huan)肽(tai)*C G LECNF G結(jie)合(he)的(de)(de)(de)實驗(yan)結(jie)果(guo)，提示雖然(ran)環(huan)肽(tai)C-G-L-C形成構(gou)象(xiang)表位(wei)可能位(wei)于CCN家族(zu)分(fen)子中(zhong)，但(dan)是(shi)G LECNF G是(shi)具有(you)致病作用的(de)(de)(de)特(te)異性表位(wei)。

本發(fa)明(ming)的表位的生(sheng)物學意(yi)義包括：

環肽111能夠刺激RA患者滑膜細胞(bao)和Cyr61/CCN1高表(biao)達乳腺癌(ai)MDA-MB-231細胞(bao)的體外增(zeng)殖，因(yin)此，該肽段是Cyr61/CCN1分子的特異性致(zhi)病表(biao)位。

單抗093G9能(neng)夠(gou)特異性(xing)識別Cyr61/CCN1的肽段(IGFBP)中的表(biao)位，阻斷(duan)(duan)這一表(biao)位的抗體093G9具有(you)阻斷(duan)(duan)Cyr61/CCN1致滑膜細(xi)胞、高表(biao)達乳腺癌MDA-MB-231細(xi)胞、其他纖維母(mu)細(xi)胞增殖的作用。

根據這一(yi)肽(tai)段(duan)(duan)構象表位能(neng)夠(gou)設計具有模擬和抑(yi)制(zhi)該肽(tai)段(duan)(duan)生(sheng)物(wu)學(xue)(xue)功能(neng)的化(hua)學(xue)(xue)小分(fen)子(zi)(SC)。其中，能(neng)夠(gou)阻斷該肽(tai)段(duan)(duan)化(hua)學(xue)(xue)小分(fen)子(zi)(SC)具有抑(yi)制(zhi)Cyr61/CCN1分(fen)子(zi)病(bing)理生(sheng)物(wu)學(xue)(xue)的作(zuo)用。這對于進一(yi)步發展成為先(xian)導化(hua)合(he)物(wu)及其在(zai)制(zhi)備抗滑(hua)膜(mo)增(zeng)生(sheng)和骨破壞、抗Cyr61/CCN1高表達乳腺癌細胞增(zeng)殖、以及抗纖(xian)維化(hua)(如肝纖(xian)維化(hua))的藥物(wu)中，有重要的用途。

由于Cyr61/CCN1蛋白內(nei)富(fu)含半胱氨酸，容(rong)易(yi)形(xing)成二(er)硫鍵，因(yin)此(ci)(ci)，采用(yong)(yong)基因(yin)工(gong)(gong)程方(fang)法(fa)表達(da)十分(fen)困難，而該(gai)肽段容(rong)易(yi)進行人工(gong)(gong)合成，因(yin)此(ci)(ci)能夠代替Cyr61/CCN1分(fen)子免疫(yi)以獲得抗該(gai)功能表位的抗血清，或者制備(bei)相應單(dan)抗，用(yong)(yong)于進一步的臨床檢測和治療中的應用(yong)(yong)。

本發(fa)明旨在保護(hu)多肽(tai)111的序(xu)列、由(you)該序(xu)列所(suo)可能(neng)(neng)產生(sheng)的立體結構(gou)(包括線形結構(gou)和(he)環狀結構(gou))，以及與其相(xiang)結合(he)并產生(sheng)相(xiang)同作用(如促進滑膜細胞增殖(zhi)、免疫后產生(sheng)抗體能(neng)(neng)夠抑(yi)制(zhi)膠原誘導關節炎(yan)(CIA)小(xiao)鼠(shu)炎(yan)癥作用等(deng))或者直(zhi)接(jie)抑(yi)制(zhi)這些(xie)肽(tai)段功能(neng)(neng)的小(xiao)分(fen)子化(hua)合(he)物。

附圖說明

圖(tu)(tu)1表(biao)示本發明多肽的模擬構(gou)象示意圖(tu)(tu)及化學結(jie)構(gou)，其(qi)中，(A)表(biao)示線性構(gou)象的多肽114；(B)表(biao)示環狀構(gou)象的多肽111；(C)表(biao)示多肽111的化學結(jie)構(gou)。

圖2表(biao)示本(ben)發明多(duo)肽刺激(ji)RA滑膜細胞體外(wai)增值的(de)實驗結果。

圖3表示(shi)本發明(ming)多肽刺(ci)激MDA-MB-231細胞增殖(zhi)作用的實驗(yan)結果。

圖(tu)4表示(shi)本發明(ming)小(xiao)分(fen)子化(hua)合物對肽段刺(ci)激的(de)滑膜(mo)(mo)細(xi)(xi)胞增(zeng)殖(zhi)的(de)抑(yi)制效果(guo)，其中(zhong)，(A)表示(shi)15個化(hua)學小(xiao)分(fen)子(SC 1-15)分(fen)別對肽段111刺(ci)激的(de)滑膜(mo)(mo)細(xi)(xi)胞增(zeng)殖(zhi)的(de)明(ming)顯抑(yi)制；(B)表示(shi)15個化(hua)學小(xiao)分(fen)子(SC 1-15)分(fen)別對Cyr61/CCN1蛋白刺(ci)激的(de)滑膜(mo)(mo)細(xi)(xi)胞增(zeng)殖(zhi)的(de)明(ming)顯抑(yi)制。

圖(tu)5表示本發明(ming)小(xiao)分(fen)子化合物對肽段(duan)(duan)刺激的乳腺(xian)癌(ai)細胞株MDA-MB-231增(zeng)殖的抑(yi)制效果，其(qi)中，(A)表示15個(ge)化學小(xiao)分(fen)子(SC 1-15)對肽段(duan)(duan)111刺激的乳腺(xian)癌(ai)細胞株MDA-MB-231體外(wai)增(zeng)殖的明(ming)顯抑(yi)制；(B)表示15個(ge)化學小(xiao)分(fen)子(SC 1-15)分(fen)別對Cyr61/CCN1蛋白刺激的乳腺(xian)癌(ai)細胞株MDA-MB-231體外(wai)增(zeng)殖的明(ming)顯抑(yi)制。

具體實施方式

結合以下(xia)具體實(shi)(shi)施例(li)和(he)附圖，對(dui)本(ben)(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)作(zuo)進一(yi)步的(de)詳細說明(ming)(ming)，本(ben)(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)保護內(nei)(nei)(nei)容不(bu)局(ju)限(xian)于以下(xia)實(shi)(shi)施例(li)。在不(bu)背離發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)構思(si)的(de)精神(shen)和(he)范(fan)圍(wei)下(xia)，本(ben)(ben)(ben)(ben)領域(yu)技術人員(yuan)能夠想到的(de)變化和(he)優點(dian)都被包括在本(ben)(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)中，并且以所附的(de)權(quan)利要求書為保護范(fan)圍(wei)。實(shi)(shi)施本(ben)(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)過程、條件(jian)、試劑(ji)、實(shi)(shi)驗方(fang)法等，除(chu)以下(xia)專門提及的(de)內(nei)(nei)(nei)容之外，均(jun)為本(ben)(ben)(ben)(ben)領域(yu)的(de)普(pu)遍知識和(he)公知常識，本(ben)(ben)(ben)(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)沒有特別限(xian)制內(nei)(nei)(nei)容。

實(shi)施(shi)例(li)1本發(fa)明(ming)Cyr61/CCN1蛋白抗原表位(wei)多肽(tai)的篩選(xuan)

本發(fa)明中，采用免疫印跡(ji)法(fa)篩選(xuan)：采用了(le)改(gai)進的傳統(tong)測定抗(kang)(kang)原表位方法(fa)，即通過基因工程分段(duan)表達Cyr61/CCN1一系(xi)列的小肽段(duan)，然(ran)后用這2株抗(kang)(kang)體進行蛋(dan)白印跡(ji)(Western Blot)雜(za)交(jiao)而篩選(xuan)結(jie)合表位，從而得到(dao)能(neng)夠和(he)2株Cyr61/CCN1單抗(kang)(kang)結(jie)合的肽段(duan)。

根據已有研究結果將Cyr61/CCN1蛋白分成約25個氨基酸片段長度的小肽段，然后設計引物將這些片段的基因克隆入大腸桿菌中，經表達測序正確后誘導表達，PAGE電泳后轉至硝酸纖維膜上，然后分別用鼠抗人Cyr61/CCN1特異性單克隆抗體093G9(CGMCC No.3351)和鼠抗人Cyr61/CCN1特異性單克隆抗體096B7(CGMCC No.3299)進行雜交和顯色，觀察結合情況。能夠結合則顯色陽性，否則陰性。由此判斷這兩種抗體的結合表位。通過上述方法，篩選出抗體093G9結合的抗原表位位于Cyr61/CCN1的75－81位氨基酸的表位：Cyr61/CCN1_75-81GLECNFG。這一表(biao)位(wei)(wei)在Cyr61/CCN1序列中的位(wei)(wei)置(粗(cu)體(ti)字體(ti)標(biao)出的部位(wei)(wei))：

實施例2Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)抗原表位多(duo)肽的合成(cheng)

本實施例(li)中，Cyr61/CCN1蛋白(bai)抗(kang)原表(biao)位多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)合成(cheng)(cheng)是由上海強耀公司(si)合成(cheng)(cheng)。基(ji)(ji)本原理(li)全(quan)自動固相合成(cheng)(cheng)法。其(qi)基(ji)(ji)本過(guo)程如下：基(ji)(ji)于Fmoc化(hua)學合成(cheng)(cheng)，先(xian)將所(suo)要合成(cheng)(cheng)的(de)(de)目標多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)的(de)(de)C-端氨(an)基(ji)(ji)酸的(de)(de)羧(suo)基(ji)(ji)以共(gong)價鍵形式與一個不溶性的(de)(de)高分(fen)子樹(shu)脂(zhi)相連，然后以這(zhe)一氨(an)基(ji)(ji)酸的(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)作為(wei)多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)合成(cheng)(cheng)的(de)(de)起點，同其(qi)它(ta)的(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸已經(jing)活(huo)化(hua)的(de)(de)羧(suo)基(ji)(ji)作用形成(cheng)(cheng)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)鍵，不斷重復這(zhe)一過(guo)程，即可得到(dao)多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)。所(suo)合成(cheng)(cheng)的(de)(de)多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)純(chun)化(hua)采用HPLC純(chun)化(hua)，純(chun)度達(da)95％以上。根據篩選得到(dao)的(de)(de)結合表(biao)位，分(fen)別合成(cheng)(cheng)了線性和環(huan)狀(zhuang)多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)，其(qi)中，所(suo)合成(cheng)(cheng)的(de)(de)多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)分(fen)別為(wei)：線性多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(編號(hao)114)，其(qi)序列(lie)為(wei)GLECNFG；環(huan)狀(zhuang)多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(tai)(編號(hao)111)，其(qi)序列(lie)為(wei)C GLECNFG。

實施例3Cyr61/CCN1蛋白抗原表(biao)位多(duo)肽(tai)的構(gou)(gou)象與(yu)化學(xue)結構(gou)(gou)

采用(yong)Cassion分(fen)子模擬(ni)計算(suan)機軟件，將本發明(ming)Cyr61/CCN1蛋白抗原表位肽(tai)(tai)段在純(chun)水溶液中進行擬(ni)合，以得到可(ke)能在體(ti)內的(de)溶液環境中最為可(ke)能形成的(de)構(gou)象(xiang)(xiang)，獲得具有立(li)體(ti)觀察效果的(de)分(fen)子結構(gou)。如圖(tu)1(a)和(b)所示(shi)(shi)的(de)Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多(duo)(duo)肽(tai)(tai)的(de)立(li)體(ti)構(gou)象(xiang)(xiang)，其(qi)中，圖(tu)1(a)表示(shi)(shi)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)114，為線性構(gou)象(xiang)(xiang)；圖(tu)1(b)表示(shi)(shi)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)111，為環狀構(gou)象(xiang)(xiang)；圖(tu)1(c)表示(shi)(shi)多(duo)(duo)肽(tai)(tai)111的(de)化學(xue)結構(gou)。

實施例4Cyr61/CCN1蛋白抗原表(biao)位多肽刺激滑(hua)膜(mo)細胞體外增殖(zhi)

類風關滑膜細胞培養與增殖實驗

臨(lin)床(chuang)樣(yang)本：研究(jiu)中(zhong)所有(you)樣(yang)本均來自于臨(lin)床(chuang)骨科行(xing)膝(xi)關節置換或(huo)滑膜切(qie)除(chu)術的RA患(huan)(huan)者，所有(you)病例的診斷(duan)符(fu)合國際診斷(duan)標(biao)準。患(huan)(huan)者滑膜組(zu)織(zhi)用(yong)于細(xi)胞的體外培養(yang)。本研究(jiu)中(zhong)所用(yong)臨(lin)床(chuang)樣(yang)本，均對患(huan)(huan)者進行(xing)知情告知。

滑膜細胞的制備及原代培養：將無菌獲取滑膜組織，PBS清洗后用無菌手術剪刀剪切成約1mm×1mm×1mm的碎塊；用2－3倍體積0.5mg/ml的膠原酶I或膠原酶II，37℃，消化2小時；經200目紗網過濾后，離心去上清后，將細胞重懸于DMEM培養液，置于培養皿中，37℃，5％CO₂培養(yang)(yang)。之后待FLS生(sheng)長(chang)成片>80％時，消(xiao)化(hua)傳代。顯微鏡下觀察，3-5代的(de)(de)RA FLS生(sheng)長(chang)迅速，細(xi)胞(bao)形(xing)態趨向于長(chang)梭形(xing)，排列整齊，取(qu)向一致。用特異性淋(lin)巴(ba)細(xi)胞(bao)分化(hua)抗原如CD3，CD14，CD19，CD11C等標(biao)記后用流式(shi)細(xi)胞(bao)儀檢測(ce)發現上述(shu)分子表達(da)為(wei)陰性(<2％CD1Ib,<2％CD14+,<1％CD3+,and<5％CD19+)，表明所培養(yang)(yang)的(de)(de)細(xi)胞(bao)為(wei)均(jun)一的(de)(de)FLS，極少有淋(lin)巴(ba)細(xi)胞(bao)污染(ran)。

滑膜細胞的增殖實驗：取對數生長期的FLS，經0.25％的胰蛋白酶消化后調整細胞濃度1×10⁴細(xi)胞/毫升，接(jie)種于96孔(kong)細(xi)胞培(pei)(pei)(pei)養(yang)板(ban)中，加入(ru)不同濃度的上(shang)述(shu)肽段(肽段終濃度為(wei)：2.5ug/ml,5.0ug/ml 10ug/ml)。同時采用(yong)Cyr61/CCN1完(wan)整(zheng)蛋(dan)白作(zuo)為(wei)陽性(xing)對照(Proptech公司，美(mei)國，San Diego)。也設(she)培(pei)(pei)(pei)養(yang)液對照。將肽段或者純(chun)Cyr61/CCN1蛋(dan)白與(yu)FLS共同培(pei)(pei)(pei)養(yang)，在培(pei)(pei)(pei)養(yang)結束前16個小時加入(ru)1μCi的3H(每(mei)孔(kong))，收集細(xi)胞，β液閃儀(yi)檢測增殖(zhi)。

II型(xing)膠原誘導小鼠(shu)關節炎(CIA)模型(xing)實驗：

肽段(duan)免(mian)(mian)疫(yi)預(yu)防(fang)CIA小(xiao)鼠發生關節炎(yan)實驗(yan)：將肽段(duan)與CFA完(wan)全(quan)混(hun)勻，DBA1小(xiao)鼠背(bei)部皮下免(mian)(mian)疫(yi)3次(ci)：第(di)一次(ci)：肽+CFA，第(di)二次(ci)和第(di)三次(ci)：肽+IFA(不完(wan)全(quan)佐劑)，免(mian)(mian)疫(yi)劑量(liang)：100ug肽/mouse,背(bei)部免(mian)(mian)疫(yi)2－3點，每次(ci)間(jian)隔(ge)1個月，第(di)三次(ci)免(mian)(mian)疫(yi)后7天，尾部采血(xue)，用ELISA檢測是否產生抗血(xue)清；同時用CII100ug加(jia)等量(liang)IFA免(mian)(mian)疫(yi)小(xiao)鼠，觀察(cha)小(xiao)鼠的發病(bing)情況(kuang)、發病(bing)速(su)度和炎(yan)癥強度。

肽段治療(liao)或者(zhe)沖擊CIA小鼠：即先制(zhi)備CIA小鼠模型，待(dai)炎癥(zheng)達到4分時用肽段進行(xing)粘(zhan)膜(mo)給(gei)藥。方(fang)法：肽段2500ug/ml,10ul/mouse,終濃度為25ug/mouse/day。采用溶劑為陰性對照(zhao)。

將(jiang)本發明(ming)Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)抗原表位多肽的(de)上述肽段(duan)分別加入(ru)類風(feng)關(guan)原代(dai)培養的(de)滑(hua)膜(mo)細(xi)(xi)胞(bao)中，于48小時后檢測其對于滑(hua)膜(mo)細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的(de)刺激(ji)能(neng)力(li)，實(shi)驗結果表明(ming)，肽段(duan)111能(neng)夠明(ming)顯刺激(ji)滑(hua)膜(mo)細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)生(sheng)，并呈劑量依賴性，如圖2所示。這一實(shi)驗結果表明(ming)，位于Cyr61/CCN1的(de)75－81位置(zhi)的(de)肽段(duan)111，在水溶液中可能(neng)形成的(de)環狀構象能(neng)夠模擬Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)刺激(ji)滑(hua)膜(mo)細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的(de)作用。

實施例(li)5Cyr61/CCN1蛋(dan)白抗(kang)原表(biao)位多肽刺激Cyr61/CCN1高表(biao)達(da)乳腺癌細胞(bao)株(MDA-MB-231)體外增殖

將1×10⁴個MDA-MB-231細胞接種至96孔(kong)板(ban)中，然后加(jia)入(ru)不同濃度(du)(2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml)的(de)肽段，4小(xiao)時(shi)后加(jia)入(ru)3H-TdR，繼續(xu)孵育16小(xiao)時(shi)，收(shou)集(ji)細胞，Beta閃爍(shuo)儀(yi)檢測c.p.m.值，用于判(pan)斷細胞增殖狀態。結果如圖3所(suo)示(shi)，肽段111有明(ming)顯的(de)刺(ci)激(ji)細胞增殖作(zuo)用。

實施例6篩(shai)選得到與環肽111結合并(bing)抑制(zhi)其活性(xing)的小分子(zi)化合物(SC 1-15)

根據肽段構象表(biao)位(環狀多肽C GLECNFG，編號111)設計(ji)具(ju)有(you)模擬(ni)(ni)和抑制該肽段生(sheng)物學(xue)功能(neng)(neng)的(de)(de)(de)化(hua)(hua)學(xue)小分(fen)子(SC)，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)，能(neng)(neng)夠阻(zu)斷該肽段化(hua)(hua)學(xue)小分(fen)子(SC)具(ju)有(you)抑制Cyr61/CCN1分(fen)子病理生(sheng)物學(xue)的(de)(de)(de)作用(yong)。這對(dui)于進(jin)一步發展成為先導(dao)化(hua)(hua)合物及其(qi)(qi)在制備(bei)抗滑膜增生(sheng)和骨破壞、抗Cyr61/CCN1高表(biao)達乳腺(xian)癌細胞增殖、以及抗纖(xian)維化(hua)(hua)(如肝纖(xian)維化(hua)(hua))的(de)(de)(de)藥(yao)物中(zhong)(zhong)，有(you)重要的(de)(de)(de)用(yong)途。本發明采用(yong)開發新藥(yao)中(zhong)(zhong)常用(yong)的(de)(de)(de)虛擬(ni)(ni)篩(shai)(shai)選方法(fa)，通過計(ji)算法(fa)篩(shai)(shai)選出可能(neng)(neng)有(you)治療效用(yong)的(de)(de)(de)化(hua)(hua)學(xue)分(fen)子。目(mu)前應用(yong)較為廣泛的(de)(de)(de)是對(dui)藥(yao)物的(de)(de)(de)標靶(ba)利(li)用(yong)X-ray繞射或核磁共振(NMR)的(de)(de)(de)實驗，或運用(yong)生(sheng)物信息結構預測的(de)(de)(de)方法(fa)，得到(dao)標靶(ba)的(de)(de)(de)三(san)維高分(fen)辨(bian)率結構后，再進(jin)行虛擬(ni)(ni)篩(shai)(shai)選。

本實施(shi)例中，藥物虛擬篩選成功的(de)(de)要件(jian)包括：(1)足夠大的(de)(de)化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)(xue)(xue)空(kong)間(chemical space)，(2)準(zhun)確(que)的(de)(de)評(ping)分(fen)(fen)函(han)數(shu)(shu)(scoring function)，(3)高效率的(de)(de)搜尋演算法(searching algorithm)。化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)(xue)(xue)空(kong)間，即所(suo)用的(de)(de)化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)(xue)(xue)數(shu)(shu)據庫；廣(guang)義來講，化(hua)(hua)(hua)學(xue)(xue)(xue)(xue)空(kong)間則包括配(pei)(pei)體(ti)(ti)(ligand)和(he)受體(ti)(ti)較可能存在的(de)(de)構(gou)形(xing)(conformation)；評(ping)分(fen)(fen)函(han)數(shu)(shu)，其(qi)設計主(zhu)要是(shi)從(cong)蛋白質(zhi)結構(gou)數(shu)(shu)據庫(Protein Databank，//www.pdb.org)中尋找分(fen)(fen)辨率較好的(de)(de)配(pei)(pei)體(ti)(ti)與受體(ti)(ti)的(de)(de)結合(he)體(ti)(ti)(complex)，運(yun)用能量(liang)(liang)的(de)(de)計算，加(jia)上諸如多變量(liang)(liang)線性(xing)回歸(multivariate linear regression)的(de)(de)統計方法，建立一個(ge)準(zhun)確(que)的(de)(de)數(shu)(shu)學(xue)(xue)(xue)(xue)函(han)數(shu)(shu)，并可快速有效地(di)推(tui)測未知的(de)(de)配(pei)(pei)體(ti)(ti)對一給定(ding)的(de)(de)受體(ti)(ti)是(shi)否可穩定(ding)地(di)結合(he)，甚至(zhi)預(yu)測結合(he)強度(du)(binding affinity)或結合(he)的(de)(de)自由能(binding free energy)。上述評(ping)分(fen)(fen)函(han)數(shu)(shu)是(shi)根據配(pei)(pei)體(ti)(ti)分(fen)(fen)子相(xiang)對于(yu)受體(ti)(ti)做(zuo)平移(translation)、旋轉(rotation)、或者是(shi)構(gou)形(xing)變化(hua)(hua)(hua)(conformational changes)時十分(fen)(fen)復(fu)雜(za)的(de)(de)能量(liang)(liang)變化(hua)(hua)(hua)情形(xing)，尋找具有最佳評(ping)分(fen)(fen)值(zhi)的(de)(de)結合(he)模式(shi)。

本實施(shi)例在對靶標環(huan)狀(zhuang)(zhuang)多(duo)肽(tai)(tai)C GLECNFG(編號111)能(neng)(neng)有(you)(you)(you)效(xiao)模擬Cyr61/CCN1蛋白(bai)的(de)(de)生物學(xue)作用的(de)(de)研究基礎上(shang)，篩選得到具有(you)(you)(you)結(jie)(jie)(jie)構(gou)實體的(de)(de)靶向(xiang)環(huan)肽(tai)(tai)111的(de)(de)先導化合(he)物，這(zhe)些小分子(zi)(zi)結(jie)(jie)(jie)構(gou)的(de)(de)化合(he)物能(neng)(neng)與環(huan)肽(tai)(tai)111結(jie)(jie)(jie)合(he)并抑(yi)制(zhi)其活(huo)性。根據環(huan)狀(zhuang)(zhuang)多(duo)肽(tai)(tai)111的(de)(de)化學(xue)結(jie)(jie)(jie)構(gou)，采用本方法(fa)篩選到能(neng)(neng)夠和這(zhe)一環(huan)狀(zhuang)(zhuang)多(duo)肽(tai)(tai)結(jie)(jie)(jie)合(he)的(de)(de)小分子(zi)(zi)化合(he)物SC有(you)(you)(you)15個，其結(jie)(jie)(jie)構(gou)和名稱如(ru)下表(biao)1中所示(shi)的(de)(de)SC-1至SC-15化合(he)物。這(zhe)些小分子(zi)(zi)化合(he)物SC的(de)(de)結(jie)(jie)(jie)構(gou)及合(he)成方法(fa)均為(wei)現有(you)(you)(you)技術。

實(shi)施例7能與肽段(duan)111結合的化學小分子(SC)1-15在體外抑(yi)制由環肽111刺激滑膜細胞增(zeng)殖(zhi)的作用(yong)

本(ben)實施例中(zhong)臨床(chuang)樣本(ben)、滑膜(mo)細胞制備及原代培養均與實施例4中(zhong)所(suo)述相(xiang)同。

滑膜細胞的增殖實驗：取對數生長期的FLS，經0.25％的胰蛋白酶消化后調整細胞濃度1×10⁴細胞(bao)/毫升(sheng)，接(jie)種于96孔細胞(bao)培(pei)養板中，分(fen)別(bie)加入(ru)10ug/ml的(de)肽(tai)段111和2.5ug/ml的(de)Cyr61/CCN1蛋白(bai)(Proptech公司(si)，美國(guo)，San Diego)。然后分(fen)別(bie)加入(ru)按實施例6方法(fa)篩選得到的(de)10μM化學(xue)(xue)小(xiao)分(fen)子(zi)SC-1～SC-15，詳見下(xia)表1，共同培(pei)養48小(xiao)時(shi)。在培(pei)養結束前16個(ge)小(xiao)時(shi)加入(ru)1μCi的(de)3H(每(mei)孔)，收(shou)集細胞(bao)，β液(ye)閃儀檢測增殖，實驗結果(guo)如圖(tu)4所示，15個(ge)化學(xue)(xue)小(xiao)分(fen)子(zi)(SC-1～SC-15)分(fen)別(bie)對肽(tai)段111(如圖(tu)4A所示)和Cyr61/CCN1蛋白(bai)(如圖(tu)4B所示)刺激的(de)滑膜(mo)細胞(bao)增殖有明顯抑制作用(yong)。

實施例(li)8能與肽段111結合的化學小(xiao)分子1-15在體(ti)外抑(yi)制由環肽111和(he)Cyr61/CCN1刺(ci)激乳(ru)腺癌細胞(bao)株MDA-MB-231增殖的作用

將1×10⁴個(ge)(ge)MDA-MB-231細(xi)胞接種至96孔板中，加(jia)入(ru)10ug/ml的(de)肽段111和2.5ug/ml的(de)Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)(Proptech公司，美(mei)國(guo)，San Diego)。然后分(fen)別加(jia)入(ru)按(an)實(shi)施例6方法(fa)篩選得到的(de)10μM化學小(xiao)分(fen)子SC-1～SC-15，詳見下表(biao)1，共同培(pei)養4小(xiao)時(shi)后加(jia)入(ru)1μCi的(de)3H(每孔)，繼(ji)續(xu)孵(fu)育16小(xiao)時(shi)，收集細(xi)胞，Beta閃爍儀(yi)檢測c.p.m.值，用于判(pan)斷細(xi)胞增(zeng)殖狀態。實(shi)驗結(jie)果如(ru)圖(tu)5所(suo)(suo)示，所(suo)(suo)述15個(ge)(ge)化學小(xiao)分(fen)子(SC 1-15)對肽段111(如(ru)圖(tu)5A所(suo)(suo)示)和Cyr61/CCN1蛋(dan)白(bai)(如(ru)圖(tu)5B所(suo)(suo)示)刺激(ji)的(de)乳(ru)腺癌細(xi)胞株MDA-MB-231體外增(zeng)殖有明顯抑制作用。