專利名稱：：纖維化標記的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物標記在纖維化識別中的用途。
背景技術：
：纖維化改變或疾病構成了發病率/死亡率的主要原因之一，其固有的慢性特征影響病人和社會，使其承受沉重的經濟負擔。器官和組織，包括肝、肺、腎、心臟、血管以及皮膚的進行性纖維化包含一系列枳j理上相關的改變。這些改變中的每個都包含過多的、改變的、主要是膠原質的細胞外基質的堆積，這涉及正常組織結構的破壞，以及隨之發生的功能性的損失。具體而言，肝纖維化是慢性肝損傷的主要并發癥，其長期的進展會導致硬化。肝纖維化最常見的原因是酒精的攝取、丙型肝炎病毒造成的感染和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。此外，肝纖維化很大程度上造成了肝功能不全和門靜脈高血壓的發展。因此，對肝纖維化的存在和嚴重性的評估是臨床實踐的重要參數，并構成了對于有硬化進行性危險的有價值的指示。此外，用于評估纖維化存在和嚴重性的適當方法的存在是對潛在抗纖維化分子研究中的決定性工具。肝的活組織檢查和后續的組織學檢查仍然是當今評估肝纖維化的參考技術。然而，這是一項昂貴的技術，并且應用有限，該技術是侵入性的并且是令人痛苦的，且對個人健康而言，有可能引起并發癥。由于組織標本提取的固有問題以及觀察者內和，見察者間的變化，該方法的精確性和可重復性遭受嚴重質疑。已經提出了用于測量進展的不同的方法，例如化學和血液學常規分析、生理學檢查以及血清纖維化標記。已經建議了血清中細胞外基質蛋白或其合成和降解產物的測量法，例如(US隱5,316,914,EP-0283779)。US6,631,330提出了一種方法，該方法使用建立在一系列臨床血清學參數(標記)上的二元邏輯回歸模型。此方案已被用于發展Fibrotest(Biopredictive,巴黎，法國)，一種結合了五種間接的血清纖維化標記的纖維化指標。與FibroScan(Echosens,巴黎，法國)(SandrmL.等人,2003."Transientelastography:anewnon-invasivemethodforassessmentofhepaticfibrosis";UltrasoundMed.Biol.29:1705-1713)結合使用的該測試似乎適合運用在對于丙型肝炎病毒感染纖維化進展的評估當中。WO2004/063753提供了一種基于血清N-多糖蛋白特征分析的評估方法。然而，那些容易執行的和非侵入性的，并且能夠恰當地評估肝纖維化程度的新的簡單的方法仍然是必需的，尤其是用于纖維化不太嚴重的階段中。
發明內容有證據顯示，許多病理學進程與體液分子組成物的量和功能性的改變相關。由于尿液是一種容易得到的體液，所以發展一種根據可在尿液中檢效'J的纖維化指示分析物例如蛋白的確定和量化來評估肝纖維化的方法將會是令人期待的和有益的。因此本發明的目的是發展一種通過生物樣品優選是尿液中可被檢測的不同指示分析物的確定和量化來評估肝以及其它重要器官纖維化的存在和嚴重性的方法。為此，健康個體和具有肝纖維化個體的尿液中不同的蛋白表達模式(蛋白質組)被分析，從而允許選擇多種蛋白作為生物標記候選物。圖1肝纖維化病人尿液樣品中的蛋白尿調制素、MAC2BP、AGPl和組織蛋白酶A的增加和表觀的識別。來自于病人和對照個體的代表性凝膠如圖所示。不同的點標記如下1:尿調制素，2:MAC2BP，3:AGPl和4:組織蛋白酶A。具體實施例方式第一方面，本發明涉及選自尿調制素(uromodulm)、MAC2BP、AGPl和組織蛋白酶A(cathepsmA)中的至少兩種標記的組合在體外檢測纖維化改變中的用途。該用途的特征在于其包含獲得生物學樣品和測量該樣品中所述標記的濃度。此外，本發明涉及用于在體外評估纖維化改變的存在(或缺失)和嚴重性(發展的階段或程度)的方法。所述方法的特征在于其包括:a)獲得生物學樣品；b)確定所述樣品中至少兩種標記的水平，所述標記選自-尿調制素_MAC2BP-AGPl,和-組織蛋白酶A。術語"標記"涉及其量被評估的分子或化合物。在本發明的方法中，其水平被確定的四種標記是蛋白質。纖維化改變的存在或嚴重性通過生物學樣品中所述標記的存在-缺失或增加-減少來指示。術語"尿調制素"涉及在人類中鑒定的、代號是UMOD(LOCUSLINK:7369Homosapiens;UNIGENE:Hs.164470)的基因編碼的蛋白，包括其任一種同種型和存在于任一動物物種中。所述蛋白還被稱為尿類粘蛋白(Uromucoid)或Tamm-Horsfall糖蛋白(THP)。在一個具體實施方案中，該蛋白是人類蛋白(Swiss-Prot登記編號P07911,最后一次更新Release4710-May-2005)。術語"MAC2BP"涉及由人類中鑒定的、代號是LGALS3BP(LOCUSLINK:3949Homosapiens;UNIGENE:Hs.514535)的基因編碼的蛋白，包括其任一種同種型和存在于任一動物物種中。所述蛋白還被稱為"半乳糖凝集素3(Galectm-3)結合蛋白"，"Mac-2結合蛋白"(MAC2BP)或"胂瘤相關抗原90K"。在一個具體實施方案中，該蛋白是人類蛋白(Swiss-Prot登記編號Q08380,最后一次更新Release4710-May-2005)。該蛋白是一種糖蛋白，其促進細胞粘附，并可以刺激抗病毒和肺瘤細胞的防御。術語"AGPl"涉及一種由人類中鑒定的、代號是ORM1(LOCUSLINK:5004Homosapiens;UNIGENE:Hs.494984)的基因編碼的蛋白，包括其任一種同種型和存在于任一動物物種中。所述蛋白還被稱為"a-l-酸性糖蛋白"(AGPl),或血清類粘蛋白l(OMDl)。在一個具體實施方案中，該蛋白是人類蛋白(Swiss-Prot登記編號P02763,最后一次更新Release4710-May-2005)。該蛋白在急性反應期中對免疫系統活性的調節的干預功能已被描述。硬化病人中該蛋白的糖基化模式發生改變，并且肝纖維化的啟動子功能也已被暗示。一種使用該蛋白特異性抗體對肝疾病(肝炎、硬化、肝癌)進行診斷的方法已,皮提出(WO2004058823)。詞語"組織蛋白酶A，，涉及由人類中鑒定的代號是PPGB(LOCUSLINK:5476Homosapiens;UNIGENE:Hs.517076)的基因編碼的蛋白，包括其任一種同種型和存在于任一動物物種中。所述蛋白還被稱為"溶酶體保護蛋白前體"、羧肽酶C、"p—半乳糖苷酶保護蛋白"或代碼E.C.3.4.16.5。在一個具體實施方案中，該蛋白是人類蛋白(Swiss-Prot登記編號P10619,最后一次更新Release4710-May-2005)。所含標記的濃度被測量的生物樣品可以是組織勻漿、組織溶解產物或生物液體，例如血液、血漿、血清、尿液、唾液、腦脊髓液、目艮淚、羊膜液和乳液等。在一個具體實施方案中，所述生物樣品是血液、血漿、血清或尿液。在一個優選實施方案中，所述生物樣品是尿液樣口C。如本發明所述的用于評估的生物樣品的準備是按照分析實驗技術員公知的常規過程實施的，基本上取決于生物樣品的類型以及本發明中被選譯用于評估的方法的設置。在最簡單的實施方案中，例如使用免疫色譜法試紙條("免疫試紙條"或"試紙條")對尿液進行的樣品評估，樣品無需準備而直接一皮施用。當為了測量不同標記或對之前的結果進行確認而需要額外的確定時，評估可以采用相同樣品的等分試樣或來自同一受試者的不同樣品完成。在本發明中，生物樣品可以來自任何動物，特別是任何哺乳動物，例如，比如實驗室動物(嚙齒動物，兔，靈長類動物，狗)，寵物或馴養動物(狗、貓、馬、牛或豬類動物)或野生動物。在本發明的一個具體實施方案中，所述生物樣品來自男人或女人。如本發明所述化合物水平的確定意思是樣品中所指化合物的量被評估(通常被表述為濃度)。所述評估可以僅為存在-缺失的確定、半定量評估，或更優選地為定量評估。本發明的一個具體實施方案進一步包含將所確定的標記的水平與參照標準或參照值相比較。在本發明的一個特定的實施方案中，高于1.5倍標準水平的水平與纖維化改變的存在相關聯。在一個優選實施方案中，至少為參照值兩倍的水平與纖維化改變的存在相關聯。于何種組織中無關，因此待評估的纖維化l變所影響:器官^以是任何器官。例如，待評估的纖維化改變可以是肺部、骨髓、肝、胰腺、腎臟、心臟或多器官的纖維化。在一個優選實施方案中，組合使用本發明所述的標記來評估肝纖維化的存在和嚴重性。在一個具體實施方案中，本發明包含組合使用選自尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A中的三種標記。優選地，所述四種標記的水平一皮確定。4壬選地，本發明可以包含^f吏用其它附加標記。所述附加標記可以是蛋白或其它任何類型的化合物(糖蛋白、多肽、小分子、多糖、核酸、抗體等)。本發明所述的標記水平的確定可以通過任何已知的分析方法完成，方法的選擇基本上取決于人們所希望獲得的主要影響評估的要求和需要速度-簡便性，敏感性和特異性，預測值等。根據本發明的不同設置，上述確定可以通過比色法、分光光度法、熒光法、化學發光過程、使用放射性同位素、分光光度法、NMR、色譜法、電泳法以及化學過程、免疫分析(基于抗原抗體反應)或上述方法的組合等來完成。在一個具體實施方案中，上述確定可以通過質譜例如tandem質i普與液相色i普耳關用(LC-MS-MS)或MALDI-TOF-MS(基質輔助激光解吸/電離飛fl"時間質i普MS)完成。在本發明的一個優選實施方案中，上述確定通過免疫分析完成。本發明方法中適用的免疫分析包括均一性分析、異質性分析、酶免疫分析(EIA、ELISA)、竟爭性分析、免疫測量分析(三明治)、混濁度分析(turbidimetricassays)、油度分析(nephelometricassays)以及上述方法的組合使用。上述免疫分析所適用的原理和實驗方案是公知的，在一些手冊中有詳盡的描述，例如，"Theimmunoassayhandbook"，editedbyDavidWild,2ndedition2001,NaturePublishinggroup,以引用方式包含在本申請中。在一個具體實施方案中，所述免疫分析是ELISA或試紙條免疫色語分析法(stripimmunochromatographyassay)("dipstrip，，、"免疫色語法試紙條"或"免疫試紙條(immunostrip)")。在另一個具體實施方案中，所述免疫分析使用抗體芯片進行。在專利文獻US5753517中，我們可以發現用于三明治類型試-險和抑制分析的定量免疫色譜法試紙條分析的可能適用的設置和實施方案的詳細信息，其不應作為對本發明的限制。免疫色譜法分析還可以采用許多其它的設置，例如那些在專利文獻US6316205中公開的，其中的一些允許在同一個分析和同一個樣品中分析幾個不同的標記。對于生物樣品中纖維化改變(fibroticalteration)，優選是肝纖維化的存在(或缺失)或嚴重性的最終評估，測試樣品(我們希望評估其纖維化的受試者的生物樣品)中所確定的該標記的水平與預先建立的參照值相比較。當定性(陽性-陰性)或半定性評估就足夠的時候，只需要對所測量的每一個化合物建立一個臨界值。當需要具有最優化的敏感度和特異性的定量評估時，例如，該參照值或指標可以通過每一個所測量的標記的不同值(discriminativevalues)的邏輯回歸分析和聯系每個化合物所獲得的測量值的邏輯函數的隨后構建而建立起來。通過使用ROC曲線對邏輯函數的質量進行分析。構建邏輯函數的程序已經眾所周知，并且也被使用在纖維化改變的評估中，其中肝纖維化使用血清學的標記。這些程序已經,皮公開，例如在文獻US6631330中，該專利文件已經以引用方式包含在本申請中。在本發明的一個優選實施方案中，標記被用于評估尿液樣品中肝纖維化的存在和嚴重性，并且該評估通過確定選自尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A中的至少兩種標記的水平完成。在一個具體實施方案中，所述標記獲得的測量值與邏輯函數相關聯。本發明的目的是例如在選擇和篩選具有潛在抗纖維化活性的藥物的方法中進行應用。該方法包含a)給予受試者(優選是動物)待研究的藥物；b)在研究的不同點上(給藥之前，給藥中和/或給藥后)，從動物中提取生物樣品并依據本發明來確定標記水平；以及c)比較在不同治療階段所獲得樣品的測定值，并與比如說沒有給藥的對照動物進行對比。在另一個應用中，本發明允許控制動物或病人的器官，優選是肝，的纖維化狀態的進展，以便動物或病人接受對于已定義標記的不同采樣和評估。在一個更為具體的應用中，本發明允許評估對于抗纖維化治療隨時間的響應。本發明的另一個方面的特征在于所述標記的濃度是通過使用針對選自尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A中的至少兩種標記的特異性探針來進行測量的。術語"探針"涉及一種分子，該分子特異性地與四種所示出的標記(尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A)中的一種發生反應，并且其反應可以通過反應強度的標記-示蹤物來直接或間4妾地;險測，所迷標記-示蹤物可以是有色的、萸光的、發光的產物或標記，或者是任何其它可以被檢測的標記。在一個具體實施方案中，探針為尿調制素、MAC2BP、AGP1或組織蛋白酶A的特異性配體，例如血凝素或抗體(多種抗體)。在一個優選實施方案中，所述探針為多克隆或單克隆的特異性抗體。在另一個附加的方面，本發明涉及用于確定選自尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A中的至少兩種標記的水平的試劑盒，其特征在于它包含用于兩種、三種或四種所述標記的任一組合的特異性探針。在一個具體實施方案中，該試劑盒包含用于兩種所述標記的兩種特異性探針(例如一種探針用于組織蛋白酶A,另一種探針用于尿調制素；或一種用于MAC2BP,另一種用于AGP1以及另一種用于尿調制素等)。在另一個實施方案中，該試劑盒包含用于三種所述標記的三種探針的任一組合。在另一個實施方案中，該試劑盒包含至少四種探針，分別對應于尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A四種標記中的一種。在一個優選實施方案中，至少一種所述探針是人們所希望檢測和定量的標記的特異性抗體。在另一個具體實施方案中，所有的試劑盒探針都是特異性抗體。本發明的試劑盒的一個或多個探針可以被包含在同一種組合物中或分開的組合物中，粘附在固相基底(例如用于ELISA的微量培養板上或用于免疫色譜法的試紙條上)或同一試劑盒中幾種組合物基底上。在一個具體實施方案中，該試劑盒是免疫分析試劑盒。在一個優選實施方案中，本發明的試劑盒是用于ELISA的試劑盒。在另一個實施方案中，本發明的試劑盒是免疫色譜法試劑盒。在優選實施方案中，本發明的試劑盒是免疫色語試劑盒，該試劑盒包含至少一種特異性抗體(探針)，其針對本發明方法中的四種標記中的一種，以及至少一種免疫色譜試紙條(strip)或膜。在一個具體實施方案中，所述標記的特異性抗體或其中部分可以與被標記的微粒相結合，裹附它們。在一個具體實施方案中，所述特異性抗體嵌入色i普試紙條或膜中。此外，其它材料或試劑例如與被標記的微粒結合或者不結合的針對內部對照的抗體，也可以粘附于色語試紙條上。在一個具體實施方案中，本發明的試劑盒是用于免疫色譜法的試劑盒，其包含兩種或更多種探針，抗體，優選是對于本發明方法中至少兩種或更多種標記有特異性的；兩種或更多種根據粘附其上的特異性抗體、對于特定標記有特異性的免疫色譜試紙條；以及其它用于檢測分析物與特異性抗體之間的反應以便完成免疫色諳分析所必需的試劑和材料。本發明的試劑盒還可以包含其它任選的材料和試劑，例如二抗、緩沖液、稀釋液、染色劑或示蹤劑(熒光、發光等)、標準樣、校準對照物、測試藥筒(testcartridges)、小瓶、瓶、試管、針、色譜法試紙條、微量培養板和使用說明書。在一個具體實施方案中，本發明的試劑盒包含帶有"用于評估纖維化的存在和嚴重性"，更優選是"用于評估肝纖維化的存在和嚴重性"指示標簽的包裝。在一個具體實施方案中，其包含"用于尿液測定"的指示。所述指示可以由其它被認為是等效的指示代替，在認為等效的范圍內，所述等效的指示隱含意味著在這樣一種方法中該試劑盒的應用或使用，所述方法包括作為中間步驟或最后的結果的、對纖維化的存在和/或嚴重性的評估，優選是指評估肝的纖維化的存在和/或嚴重性，和/或通過尿液的確定。本發明的實施方案下述實施例目的在于非限制性地闡明本發明的實施方案和本專利申i青的目的。實施例本研究中，來自11位具有不同程度和來源的肝纖維化的病人的尿液樣品與來自6位對照個體的尿液樣品進^t比較。臨床上肝纖維化的確定是通過使用在獲得尿液同一天收集到的肝的活組織檢查樣品的解剖病理學研究完成的。對應于KNODELL(KnodellRG,IshakKG，BlackWC,ChenTS，CraigR,KaplowitzN等人，Formulationandapplicationofanumericalscoringsystemforassessinghistologicalactivityinasymptomaticchronicactivehepatitis.Hepatology1981Sep-Oct;1:431-435)評估的第四方面的纖維化指標或分數被使用。使用來源醫院的常規臨床實驗方案來收集尿液樣品。對照個體的尿液樣品來自于該醫院的健康人群，通過相同的方式進行采集。^吏用二維電泳和質譜分析法對纖維化病人和健康個體的尿液樣品進行分析。為此，大約50mL來自于病人和對照個體的樣品纟皮分析。使用臨界大小為5000Da的Am訓nUltra(Millipore)濃縮器對樣品進行濃縮，尿液再次懸浮于包含7M尿素、2M硫脲、(4%體積/體積)3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]-l-丙磺酸鹽、1%(col/col)DRR和0.5%Biolytes3/10的溶解ll沖液中。用Bradford分析試劑盒(Bio-rad)來確定蛋白的量，將清蛋白稀釋在溶解緩沖液中作為標準。使用100pg的總蛋白進行二維電泳(2DE)。第一維電泳使用Biorad的ProteanIEFCell,使用BioRad的17厘米IPG試紙條并且其經過活性重新水化，即施用50V電壓在20攝氏度進行12小時。使用制造商設計的電壓梯度在60,000Vh.跑膠。試紙條在50mMTRIS、pH7、6M尿素、30%甘油、2%SDS和痕量溴酚藍中平衡好。還原過程使用2%DTT進行以及另外的烷化過程使用2%硪乙酰胺。將試紙條直接放在12.5%聚丙烯酰胺凝膠(18cmx20cmxlmm)上，并使用1%瓊脂糖將其密封好。第二維在SDS-PAGE中進行15小時。使用Bio-rad的Spyro-Ruby熒光染色劑對凝膠進行染色。使用BioRad生產的MolecularImagerFX對圖^象進行數字化，并使用BioRad的PGQUEST7.1程序進行分析。通過以上方法，得到300種蛋白的平均分辨率，并且通過使用PDQUEST進行對比，其中增加或減少至少兩倍的數據被接受為有差異。以此標準，來自纖維化病人的尿液樣品中4種蛋白帶被檢測出，其增加和表觀(appearance)在所有的分一斤中都保4爭一致。根據下面描述的實驗方案，通過使用不同蛋白的胰蛋白酶消化，然后使用液相納米色譜法與使用電噴霧離子化源(ESI/MS/MS)的QTOFMicro質譜聯用，從而分析所選樣品。使用6ng/pl胰蛋白酶進行凝膠上消化，其再次懸浮于50mM碳酸氬鈉中，于37°C過夜。用1%蟻酸和2%乙腈提取胰蛋白酶水解后的肽產物。最后，使用經5%乙腈和0.2%蟻酸預平tf的Waters的反相Atlantis,C18,3|im，75pmx10cmNanoEaseTM毛細管柱將胰蛋白酶水解多肽進行分離。注射6pi樣品以后，使用相同緩沖液洗柱子5分鐘，并使用30分鐘內5-50%乙腈的線性梯度將肽洗提出來，流速保持在0.2pl/分鐘。柱子與Waters的Q-TOFMicro在線聯用，使用Waters的納米-噴霧型離子化源PicoTip。毛細管溫度是80。C,噴霧電壓為1.8-2-2kV。MS/MS圖譜依據數據被自動收集。使用2.5分離窗口和35%的相對碰撞能量將三個最強的離子依次通過碰撞誘導解離(CID)碎片化。數據處理使用Waters的MassLynx4.0和ProteinLynxGlobalServer2分析程序完成。使用二維電泳的尿液樣品分析允許大約700種不同的蛋白被分離開，如圖1中凝膠圖像所示。將病人樣品的每一個凝膠與對照個體的凝膠進行對比，四條帶被選出進行后續分析。這四條帶僅出現在病人的樣品中，其中的一條在那些個體中明顯增加。使用已在前面部分說明的實驗方案，將由11位病人和6位對照個體產生的凝膠的帶進行切除，并使用胰蛋白酶進行消化。然后使用MALDI-TOF質i普、肽指紋和LC-ESI-QUAD-TOF質譜對胰蛋白酶消化物進行分析以便能夠研究所述帶。所述蛋白被識別為尿調制素、MAC2BP、AGPl和組織蛋白酶A，在圖1中分別標記為1、2、3和4。在對照個體的二維湊是月交和/人病人獲得的二維凝膠中對所述蛋白的存在或缺失進行分析，所得到的分布如表1所示。從此表中可以看出，至少兩種標記出現在所有的纖維化病人的研究中，但并不能在對照個體中觀察到。表1不同蛋白的增加(對于尿調制素)或存在(對于AGP1、組織蛋<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求1.從尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A中選出的至少兩種標記的組合在纖維化改變的體外檢測中的用途。2.如權利要求l所述的用途，其特征在于其包含a)獲得生物樣品；和b)測量該樣品中所述標記的濃度。3.如權利要求2所述的用途，其特征在于所述生物樣品選自血液、血漿、血清和尿液。4.如權利要求2或3中任一項所述的用途，其特征在于所述生物樣品來自哺乳動物。5.如權利要求2至4中任一項所述的用途，其特征在于所述生物樣品來自男人或女人。6.如權利要求1至5中任一項所述的用途，其特征在于其進一步包含將標記水平與參考值相比較。7.如權利要求6所述的用途，其特征在于至少是參考值兩倍的水平與纖維化改變的存在相關聯。8.如權利要求1至7中任一項所述的用途，其特征在于所述纖維化改變選自肺部、骨髓、肝、胰腺、腎臟、心臟或多種器官的纖維化。9.如權利要求1至8中任一項所述的用途，其特征在于所述纖維化改變是肝纖維化。10.如權利要求1至9中任一項所述的用途，其特征在于所述標記濃度通過選自比色法、分光光度法、NMR、色i普法、電泳法、免疫分析方法或上述方法的組合的方法確定。11.如權利要求1至10中任一項所述的用途，其特征在于其包含所述權利要求1中指出的標記中的三種的組合。12.如權利要求1至11中任一項所述的用途，其特征在于其包含尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A四種標記的組合。13.如權利要求2至12中任一項所述的用途，其特征在于所述標記的濃度是使用對于至少兩種標記具有特異性的探針測量的。14.如權利要求12所述的用途，其特征在于至少一種探針為特異性抗體。15.—種用于確定選自尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A中的至少兩種標記的水平的試劑盒，其特征在于其包含對于兩種、三種或四種所述標記的任一組合的特異性探針。16.如權利要求15所述的試劑盒，其特征在于至少一種探針為特異性抗體。17.如權利要求15或16中任一項所述的試劑盒，其特征在于其是用于免疫分析的試劑盒。18.如權利要求15至17中任一項所述的試劑盒，其特征在于其是用于免疫色譜法的試劑盒。19.如權利要求15至17中任一項所述的試劑盒，其特征在于其是用于ELISA的試劑盒。20.如權利要求15至19中任一項所述的試劑盒，其特征在于其進一步包含選自二級抗體、示蹤劑、緩沖液、稀釋液、標準樣、校準對照物、測試藥筒、小瓶、色譜試紙條、微量培養板和使用說明書的其它組分。21.如權利要求15至20中任一項所述的試劑盒，其特征在于其包含帶有用于評估纖維化存在和嚴重性的指示或等效指示的標簽的包裝。22.如權利要求21所述的試劑盒，帶有用于評估肝纖維化的存在和嚴重性的指示。23.如權利要求21中所述的試劑盒，其中所述標簽還包含用于尿液中的測定的指示。全文摘要本發明涉及選自尿調制素、MAC2BP、AGP1和組織蛋白酶A中的至少兩種標記的組合在纖維化改變的體外檢測中的用途。此外，本發明還涉及用于確定在生物樣品中所述標記的水平的試劑盒。文檔編號G01N33/68GK101356439SQ200680031338公開日2009年1月28日申請日期2006年6月22日優先權日2005年7月1日發明者F·科拉爾斯伊茲奎爾多,J·弗南德茨伊里戈延,J·普里托瓦爾圖納,L·塞斯馬阿奎爾,M·阿維拉扎拉戈扎申請人:西馬生物醫學計劃公司