專利名稱：一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞制劑及其制備方法，具體地，這種細胞制劑中的 細胞來自臍帶、胎盤組織的干細胞，移植入人體后可以用于治療肝組織損 傷性的疾病。
背景技術：
肝纖維化是許多肝臟疾病的共同病理變化，晚期肝纖微化可以進展為 肝硬化、門脈高壓、肝功能衰竭，最終需要進行肝移植。目前的治療手段 主要包括支持治療、對證治療和抗纖維化治療，然而目前的抗纖維化治療 的缺點是抗纖維化藥物對激活的肝臟衛星細胞引起的纖維化無效，會產生 多種副作用。可是最近研究表明即使是晚期肝纖維化也是可以逆轉的，這 已經引起許多研究者的興趣。
近年來，關于干細胞制劑的研究不斷深入，干細胞制劑對某些疾病的 獨特療效逐步受到重視。干細胞是人體各種組織器官的起源細胞，具有自 我復制和多向分化的特征。目前研究表明骨髓來源的干細胞可以跨胚層分 化為多種細胞類型包括肝細胞、膽管細胞、血管內皮細胞和心肌細胞。干 細胞移植治療對許多慢性疾病和退化性疾病有很好的治療前景，可以分化 為多種組織細胞從而重建損傷組織和器官。由于從人臍帶中分離純化的組 織干細胞，具有增殖能力強、來源豐富、采集方便等優點，引起研究者的 很大重視。目前已經有報道人臍帶組織干細胞移植治療心臟病，血液血管 疾病有一定療效。盡管有學者證明臍帶組織干細胞能夠減輕肝纖維化，但 是尚無應用來源于臍帶細胞移植促進肝細胞再生同時修復肝臟微血管治 療肝損傷性疾病和改善肝功能的先例。因此，開發用于治療肝組織損傷的 細胞制劑及其制備方法具有特別重要的臨床意義。

發明內容
為了克服上述現有技術中的不足，本發明的目的是提供一種新型的用 于治療肝臟損傷和肝硬化等疾病的細胞制劑及其制備方法，能夠克服上述 肝損傷、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病治療方法的缺點，以及目前已有的 治療肝纖維化干細胞制劑的局限性，移植進體內后可參與肝細胞的再生和 微血管的修復。
為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案是提供一種用于肝臟損
傷和肝硬化的細胞制劑，所述的細胞制劑包含肝細胞樣細胞和PBS溶液。
所述肝細胞樣細胞是由胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑經體外誘導 培養而成。
所述胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑是由從胎盤、臍帶分離得到的 組織制成的細胞制劑。
所述組織干細胞呈成纖維細胞樣貼壁生長，該細胞群表達(陽性率^ 50%) OCT3/4, SSEA-4, CD13, CD73、 CD105,不表達或低表達(陽性率 ^2%) CD34,CD45,CD117，CD133，CD31，vWF,FLK-l以及HLA-DR。
所述肝細胞樣細胞的濃度為每毫升0.5-2><107個細胞。
一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑的制備方法，包括以下步驟
(1) 從胎盤和臍帶中將組織干細胞分離純化、培養，制成細胞懸液， 制成胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑；
(2) 將步驟(1)中的組織干細胞在體外誘導，分化成肝細胞樣細胞；
(3) 將步驟(2)中的肝細胞樣細胞用無菌PBS緩沖溶液稀釋，制成 細胞制劑。
所述步驟(1)具體包括以下步驟
第一，將臍帶和胎盤機械剪切成lmm"j、組織塊，采用濃度為lmg/mL 膠原酶I在37'C消化1小時，再用濃度為0.25%胰酶37'C消化30分鐘， 期間溫和震蕩；第二，加胎牛血清(FBS)中和胰酶后將組織懸液通過細胞篩，離心收 集細胞懸液；
第三，將所得細胞懸液接種于包被4pg/cr^纖連蛋白的T75cn^培養 瓶中，在添加了 10ng/ml表皮生長因子的D/F12+10。/。胎牛血清(FBS)體系 中培養5到7天；
第四，將得到的呈成纖維樣細胞的組織干細胞再消化傳代純化、擴增， 濃縮成單個核細胞混懸液，得到胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑。
所述步驟(2)具體包括以下步驟
第一，取5-10代分離的組織干細胞，采用D/F12培養體系，血清饑 餓24小時；
第二，第一階段培養采用IMDM補充20 ng/mL肝細胞生長因子和 10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，nicotinamide 20ng/L培養體系持續14 天；
第三，第二階段處理IMDM加入20 ng/mL oncostatin M, 1 Hmol/L dexamethasone, and 50 mg/mL ITS+ premix培養體系持續14天，每周換液 兩次。
本發明的有益效果是
1、 按照本發明提供的制備技術，可以將所需細胞從臍帶、胎盤組織 中分離出來，制備成單個核細胞懸液，該細胞制劑在合適的體外誘導條件 下可以分化為肝細胞樣細胞；
2、 按照本發明技術制備的細胞制劑可以通過病變局部注射或靜脈全 身移植治療肝損傷、肝纖維化、肝硬化肝損傷性疾病；
3、 按照本發明制備技術制備的細胞制劑移植到體內不僅能分化為肝 細胞而且能分化為內皮細胞，同時分泌多種生長因子，修復肝臟微血管， 參與肝細胞增生，改善肝功能。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步的詳細說明，以下各實施方式 僅僅是用于說明而不是限制本發明。
從臍帶和胎盤中分離細胞的方法是將臍帶和胎盤機械剪切成lmm3 小組織塊，采用膠原酶I (lmg/mL) 37t:消化1小時，胰酶(0.25%) 37°C 消化30分鐘，期間溫和震蕩數次，加胎牛血清(FBS)來中和胰酶后將組 織懸液通過細胞篩，離心收集細胞懸液，接種于包被4pg/cmS纖連蛋白 (Fibronectin)的T75培養瓶中，在添加了 10ng/mL表皮生長因子(簡稱 EGF)的D/F12+10。/。胎牛血清(FBS)體系中培養5到7天，呈成纖維樣細 胞為組織干細胞，消化傳代純化、擴增細胞。收獲濃縮成單個核細胞混懸 液，供移植用；根據細胞數將多余的細胞按每袋3><109細胞數，嚴格按低 溫保存步驟，貯存于液氮中供多次使用。
所述的細胞呈成纖微樣貼壁生長，流式細胞儀檢測該細胞群表達(陽 性率^50%) OCT3/4， SSEA-4， CD13, CD73、 CD105;但不表達或低表達 (陽性率^2°/。)造血和內皮細胞的標志CD34, CD45, CD117, CD133， CD31, vWF, FLK-1,HLA-DR; RT-PCR證明表達特征性標志OCT-4和 REX-1;體外在合適的誘導條件下可以向骨，脂肪分化。體內移植后可快 速到達損傷的肝臟組織。本發明專利中所述的細胞群表達是指陽性率^ 50%，不表達或低表達是指陽性率^2%。
上述制備所得的細胞制劑在體外適當的誘導條件下可以分化為肝細 胞，該誘導條件是取5-10代培養的細胞，采用D/F12培養體系，血清 饑餓24小時后，第一階段培養采用IMDM補充20ng/mL肝細胞生長因 子和10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，nicotinamide 20 ng/mL，持續 14天，接下來第二階段處理IMDM加入20 ng/mL oncostatin M, 1 Mn0i/L dexamethasone, and 50 mg/mL ITS+ premixl4天，每周換液兩次。
本發明從基因表達和蛋白質兩個水平證明該細胞在肝纖維化動物模 型中分化為肝細胞和內皮細胞。體內移植后表達人特異性白蛋白，甲胎蛋 白，CD31， FLK-1。將該細胞培養擴增后酶消化收集細胞，移植前用無菌的PBS緩沖液稀釋至每毫升0.5-2xl(f個細胞，優選為每毫升lxl(^個細 胞，移植到體內后①能分化為肝細胞，表現為經CC14損傷的肝臟組織 細胞移植后移植的細胞表達人源性的甲胎蛋白和白蛋白；②能分化為內皮 細胞表現為移植細胞表達FLK-1， VEGF和CD31蛋白；③分泌多種生 長因子包括IGF、 VEGF、 FGF、 BB-肝細胞生長因子等，參與肝臟細胞 增生和肝臟竇內皮修復；④肝功能的恢復表現為接受細胞移植動物的血 漿AST、 ALT和TBIL水平的有效降低。
目前細胞移植在治療肝臟疾病中，國內外都沒有促進肝細胞再生的同 時，改善肝臟血液微循環的細胞制劑。所以該發明在肝臟的細胞治療方面 均具有廣闊的應用前景。
初步的的肝功能檢查表明，移植組較未移植組有顯著改善。
動物試驗實例
對NOD/SCID小鼠移植臍帶來源細胞制劑的試驗
1) 、按照上述實施方式所述的制備方法，制成臍帶來源細胞制劑備用。
2) 、小鼠肝纖維化模型的建立及細胞移植將NOD/SCID小鼠(雄性， 8-9周，18-21g)詞養于SPF級層流架中；動物模型的制作過程為應用 CC14 0.5ml/kg體重皮下注射，每周一和四注射兩次；當注射8次后第二天， 0.25%胰酶消化培養的臍帶組織干細胞，1,000 rpm離心8 min, PBS重懸 細胞lxl07個細胞/mL;實驗組動物經尾靜脈移植0.1mL細胞懸液即1><106 臍帶組織干細胞，對照組注射0.1mlPBS。為跟蹤注射入體內的細胞去向， 取10只小鼠，其移植細胞先用熒光染料CM-Dil標記，即細胞在消化離心 后重懸于2嗎/mlCM-DilPBS溶液中，37。C下孵育8分鐘，4。C下孵育20 分鐘，PBS洗兩遍后，PBS重懸細胞lxl07個細胞/ml。
3) 、肝臟標本的采集及制備在手術后第7天、14天、21天、28天， 每組各取2~4只NOD/SCID小鼠，用摘除眼球法取小鼠外周血500ul， 8,000 rpm離心20min分離收集血漿檢測肝功能；脫臼處死后取動物肝臟，一 部分組織用作4%多聚甲醛固定，制備常規石蠟切片；另一部分肝臟組織 用OCT膠固定常規制備冰凍切片。4) 、肝臟標本的免疫化學染色組織常規脫蠟水化，兔抗人Alb多克 隆抗體(DAKO)和兔抗人AFP多克隆抗體(Neo Markers),兔抗人VEGF、 CD31和Flk-1多克隆抗體(1:100, Santa Cruz biotechnology)作一抗，按 PV6000組化試劑盒說明進行二抗孵育，DAB顯色，2%蘇木精復染胞核， 常規脫水封片。在光學顯微鏡下，細胞膜或細胞質為棕色表示陽性。
5) 肝臟標本的免疫熒光染色:冰凍切片復溫，PBS浸泡，兔抗人VEGF、 CD31和Flk-l多克隆抗體(I:IOO， Santa Cruz biotechnology)作一抗，FITC
連接羊抗兔二抗孵育，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，綠色為抗體染色陽性， 紅色為DIL標記的臍帶組織干細胞。黃色為臍帶組織干細胞陽性細胞。
6) 、小鼠肝臟血管新生的監測小鼠肝臟血管密度被計數由計數連續 10張肝組織切片上(每只小鼠)vWF和CD31 (兔抗人和小鼠多克隆抗體) 免疫組化染色陽性血管數目。
7) 、肝功能測定8,000 rpm離心20 min分離血漿，用生理鹽水稀釋 (血槳生理鹽水=1: 4)，用生化檢測儀連續監測法檢測谷丙轉氨酶(ALT)
和谷草轉氨酶(AST),用礬酸氧化法檢測總膽紅素(TBil)。
8) 、統計學分析所有計量型資料以均值±標準誤表示，進行ANOVA 分析，計數型資料用Fisher's精確概率檢驗分析。
試驗結果表現為
1) 、按照上述實施方式所述的制備方法制備細胞呈成纖微樣貼壁生 長，流式細胞儀檢測發現該細胞群表達(陽性率^50%) OCT3/4, SSEA-4, CD13, CD73、 CD105;但不表達或低表達(陽性率^2°/。)造血和內皮細 胞的標志CD34, CD45, CD117, CD133, CD31, vWF, FLK畫1,HLA畫DR; RT-PCR證明表達(陽性率^ 50%)胚胎干細胞特征性標志OCT-4、 SSEA-4 和REX-1。體內移植后可快速到達損傷的肝臟組織。
2) 、在體外誘導培養過程中，這些細胞在肝細胞生長因子、堿性成纖 維細胞生長因子作用下1周后失去成纖微樣細胞的兩極，細胞逐漸回縮呈 扁平樣形態，2周后細胞繼續回縮呈立方形，到4周后逐漸呈多角形成熟 肝細胞樣細胞。貼壁細胞消化后流式檢測，發現這些細胞不同程度上表達肝卵原細胞特異性抗原CD-117 (18.5 ± 3.4%), Thy-l的表達亦明顯增強， 但不表達內皮細胞的特異標志vWF ， CD31。免疫熒光研究也表明面分化2 周后的細胞高表達(陽性率^50%) ALB蛋白。RT-PCR分析表明誘導分 化后細胞表達(陽性率^50%) AFP、 AK-19和ALB。這表明誘導出的多 角形貼壁細胞是分化中的肝細胞樣細胞。
3) 、細胞移植后的小鼠肝臟組織免疫學分析顯示移植上述臍帶組織 細胞的小鼠肝組織表達(陽性率^50%)人的肝細胞特異性抗原AFP。同 時也表達(陽性率^50%)人的內皮細胞特異性標志CD31。肝臟冰凍組 織切片在熒光顯微鏡下觀察，發現血管周圍有散布的能激發出紅色(代表 CM-Dil)和綠色(代表FITC-CD31、 FITC-VEGF或FITC-FLT-1)雙熒光 的細胞。RT-PCR表明了人肝細胞特異性蛋白Alb和AFP轉錄，同時也表 明了人內皮細胞特異性標志蛋白CD31、 FLT-1、 VEGF的轉錄。這些結果 說明移植的臍帶細胞能整合到損傷肝組織中去。
4) 、觀察小鼠肝臟血管新生程度發現，細胞移植組第四周血管密度較 對照組明顯增加。細胞移植組vWF陽性血管密度均較對照組明顯增加。 同時發現小鼠肝組織CD31陽性血管密度和vWF陽性血管密度二者變化 不一致，移植后第一周CD31陽性血管密度高于vWF陽性血管密度。而 晚期第四周則相反。
5) 、參見表l:為該細胞制劑移植到肝纖維化模型的NOD/SCID小鼠 后肝功能測定結果。肝功能恢復情況
細胞移植組血槳谷丙轉氨酶(ALT)(對照組205.00±60.00 U/1，細 胞移植組138.50±34.16U/1， P<0.05)，血漿谷草轉氨酶(AST)(對照組 AST271.50士51.64U/1、細胞移植組193.00±37.8 U/l ， P<0.01)，血漿總 膽紅素(TBil)(對照組14.00士2.67umo1/1，細胞移植組9.1±2.83 umo1/1, P<0.01 )較對照組明顯降低。表明細胞移植后動物的肝功能有明顯的改 善。
上述動物試驗證明體內移植該細胞可以快速到達損傷的肝組織，應 用RT-PCR技術表明損傷的肝組織有人特異性肝細胞標志AFP、 Alb和肝細胞生長因子mRNA和人特異性內皮細胞標志CD31、 Flt-l、 IGF、和 VEGF mRNA的表達(陽性率^50%)。免疫組織化學和免疫熒光方法分 析表明移植的細胞在損傷的肝組織不僅分化為肝細胞樣細胞而且可以分 化為內皮細胞樣細胞，修復肝臟微血管，參與肝細胞增生，改善肝功能， 表明該細胞制劑的移植是有效的。
權利要求
1、一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑，其特征在于，所述的細胞制劑包含肝細胞樣細胞和PBS溶液。
2、 根據權利要求1所述的一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑， 其特征在于，所述肝細胞樣細胞是由胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑經 體外誘導培養而成。
3、 根據權利要求2所述的一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑， 其特征在于，所述胎盤、臍帶來源的組織干細胞制劑是由從胎盤、臍帶分 離得到的組織干細胞制成的細胞制劑。
4、 根據權利要求3所述的一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞制劑， 其特征在于，所述細胞呈成纖維細胞樣貼壁生長，該細胞群表達OCT3/4, SSEA-4, CD13, CD73、 CD105，不表達或低表達CD34, CD45, CD117， CD133,CD31, vWF,FLK-l以及HLA-DR。
5、 根據權利要求l、 2、 3或4所述的一種用于肝臟損傷和肝硬化的 細胞制劑，其特征在于，所述細胞制劑的肝細胞樣細胞濃度為每毫升 0.5-2xl()7個細胞。
6、 權利要求l、 2、 3或4所述的一種用于肝臟損傷和肝硬化的細胞 制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 從胎盤和臍帶中將組織干細胞分離純化、培養，制成細胞懸液， 得到胎盤、臍帶來源的組織干細胞；(2) 將步驟(1)中的組織干細胞在體外誘導，分化成肝細胞樣細胞；(3) 將步驟(2)中的肝細胞樣細胞用無菌PBS緩沖溶液稀釋，制成 細胞制劑。
7、 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)具 體包括以下步驟第一，將臍帶和胎盤機械剪切成1皿3小組織塊，采用濃度為lmg/mL膠原酶I在37'C消化1小時，再用濃度為0.25%胰酶37'C消化30分鐘， 期間溫和震蕩；第二，加胎牛血清(FBS)中和胰酶后將組織懸液通過細胞篩，離心 收集細胞懸液；第三，將所得細胞懸液接種于包被4^ig/cn^纖連蛋白的T75ci^培養 瓶中，在添加了 10ng/mL表皮生長因子的D/F12+10。/。胎牛血清(FBS)體系 中培養5到7天；第四，將得到的呈成纖維樣細胞的組織干細胞再消化傳代純化、擴增， 濃縮成單個核細胞混懸液，得到胎盤、臍帶來源的組織干細胞。
8、根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)具 體包括以下步驟第一，取5-10代分離的組織干細胞，采用D/F12培養體系，血清饑 餓24小時；第二，第一階段培養采用IMDM補充20ng/mL肝細胞生長因子和 10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，nicotinamide 20ng/L培養體系持續14 天；第三，第二階段處理IMDM加入20 ng/mL oncostatin M, 1 Hmol/L dexamethasone, and 50 mg/mL ITS+ premix培養體系持續14天，每周換液 兩次。
全文摘要
本發明涉及一種細胞制劑及其制備方法，具體公開了一種用于治療肝臟損傷疾病的胎盤、臍帶組織來源的干細胞制劑及其制備方法。該細胞制劑包含肝細胞樣細胞和PBS溶液，其肝細胞樣細胞是由胎盤、臍帶組織來源的干細胞經體外誘導培養而成。其制備方法包括以下步驟(1)從臍帶和胎盤中將組織干細胞分離純化、培養，制成細胞懸液；(2)將步驟(1)中的組織干細胞在體外誘導，分化成肝細胞樣細胞；(3)將步驟(2)中的肝細胞樣細胞用無菌PBS緩沖溶液稀釋，制成細胞制劑。該細胞制劑移植到體內不僅能分化為肝細胞而且能分化為內皮細胞，同時分泌多種生長因子，修復肝臟微血管，參與肝細胞增生，改善肝功能。
文檔編號C12N5/08GK101469322SQ200710304710
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者劉麗芝 申請人:北京漢氏聯合生物技術有限公司