本發明涉及藥物領域(yu)，特別是(shi)一種虻蟲多肽及其制備(bei)方法和應用(yong)。
背景技術：
腫瘤是當今(jin)世界直接危及人(ren)類(lei)生命(ming)的一(yi)(yi)種最常(chang)見、最嚴重的疾病(bing)，傳統的手(shou)術、放(fang)化(hua)療(liao)方法(fa)只是在延長(chang)腫瘤患者(zhe)生命(ming)，在此同時(shi)會產生內臟器官損傷、免疫功能抑制等副作用，使病(bing)人(ren)的生活質量明顯下降。如何有(you)效地預防和治療(liao)腫瘤，已成為醫(yi)學領域(yu)研(yan)究的一(yi)(yi)個熱點。
虻(meng)蟲，傳(chuan)統中(zhong)藥(yao)之一，屬雙翅目(mu)短角亞目(mu)虻(meng)科(ke)昆蟲；為中(zhong)形到(dao)大形的種類，強壯而有軟毛，通常稱為牛虻(meng)。多用其(qi)干燥雌虻(meng)入藥(yao)，具有破積(ji)、逐瘀、通經之功效(xiao)(xiao)，主(zhu)治瘕、積(ji)聚、少腹蓄血、血滯經閉等癥狀。此外(wai)，也是治療跌(die)打損傷、瘀滯腫痛的特效(xiao)(xiao)藥(yao)。經國內(nei)外(wai)學(xue)者對(dui)虻(meng)蟲的研究，其(qi)化學(xue)成分(fen)主(zhu)要可(ke)(ke)分(fen)為蛋(dan)白(bai)質、多糖、微量(liang)元素及有機酸四大類。其(qi)中(zhong)蛋(dan)白(bai)質含量(liang)最高，可(ke)(ke)達(da)50％以(yi)上(shang)。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一(yi)種對腫(zhong)瘤有抑制(zhi)作(zuo)用的虻蟲多肽。
本發明的另(ling)一(yi)個目(mu)的是提供上(shang)述虻蟲多肽的制備方法。
本發明的還有一個目的是提供上(shang)述(shu)虻蟲(chong)多肽的應(ying)用。
本發(fa)明的目的是(shi)這(zhe)樣實現(xian)的：一種虻蟲多肽(tai)的制備方(fang)法，其特征(zheng)在于(yu)包括以下步驟：(1)將(jiang)虻蟲研磨成漿，加入水(shui)稀(xi)釋，離心(xin)去除沉(chen)淀(dian)，加入復合酶(mei)水(shui)解(jie)(jie)；(2)水(shui)解(jie)(jie)后離心(xin)去除沉(chen)淀(dian)；(3)水(shui)解(jie)(jie)液減壓旋轉蒸(zheng)(zheng)發(fa)濃(nong)縮，采用10000Da透(tou)析(xi)袋(dai)透(tou)析(xi)；然后將(jiang)袋(dai)外溶液減壓旋轉蒸(zheng)(zheng)發(fa)濃(nong)縮后，濃(nong)縮液利用5000Da透(tou)析(xi)袋(dai)透(tou)析(xi)，取袋(dai)內(nei)溶液，經低(di)溫冷凍干燥，即(ji)為虻蟲多肽(tai)。
所述的步驟(1)、(2)中(zhong)，離心去除沉淀的工藝條件為(wei)：溫度3-5℃，轉速10000-14000rpm，時間(jian)12-18min。
所述的步(bu)驟(zou)(3)中，減(jian)壓旋轉蒸發濃(nong)縮(suo)的溫度在40-60℃。
所述的步驟(1)中(zhong)，加入復合酶(mei)水(shui)解的條件為：酶(mei)解溫度為45-55℃，pH為7.5±0.2，酶(mei)水(shui)解時間為7-9h；然(ran)后75-85℃水(shui)浴12-18min滅活酶(mei)，反應結束。
所述的步驟(zou)(1)中，復(fu)合(he)酶(mei)的加入量為(wei)9000-11000U/g，配比(bi)為(wei)蝸牛酶(mei):木瓜酶(mei):胃蛋白酶(mei):胰蛋白酶(mei)＝8-12:4-6:13-17:18-22。
上述(shu)制(zhi)備(bei)方法制(zhi)得的(de)對腫瘤有抑制(zhi)作用的(de)虻(meng)蟲(chong)多肽。
所(suo)述的虻(meng)蟲多(duo)肽的分子量為(wei)5000-10000Da。
上(shang)述(shu)虻(meng)蟲多肽在制備抑制腫瘤的藥物上(shang)的應用(yong)。
上(shang)述虻蟲多肽在(zai)制備(bei)抑(yi)制肝癌(ai)(ai)(ai)、胃癌(ai)(ai)(ai)、乳(ru)腺(xian)癌(ai)(ai)(ai)、肺癌(ai)(ai)(ai)或結(jie)腸癌(ai)(ai)(ai)的藥物上(shang)的應用(yong)。
本發明(ming)的制備(bei)方(fang)法簡單易得，制得的虻蟲多肽經(jing)驗證具(ju)有(you)抑制腫瘤的作用，因此開拓(tuo)了虻蟲多肽的適用癥，也給腫瘤的治療提供了新的治療藥物和方(fang)向。
具體實施方式
本發明(ming)是一(yi)種(zhong)虻蟲多肽的(de)制備方法(fa)，其(qi)特征在(zai)于包括以下步驟：
(1)將虻蟲(chong)研(yan)磨(mo)成(cheng)漿(jiang)，加(jia)入(ru)(ru)水(shui)稀釋，離(li)心去除沉淀(dian)，加(jia)入(ru)(ru)復合酶(mei)水(shui)解(jie)(jie)。優(you)選(xuan)的(de)，離(li)心去除沉淀(dian)的(de)工藝條件為(wei)：溫度(du)3-5℃，轉(zhuan)速10000-14000rpm，時(shi)(shi)間(jian)12-18min。優(you)選(xuan)的(de)，加(jia)入(ru)(ru)復合酶(mei)水(shui)解(jie)(jie)的(de)條件為(wei)：酶(mei)解(jie)(jie)溫度(du)為(wei)45-55℃，pH為(wei)7.5±0.2，酶(mei)水(shui)解(jie)(jie)時(shi)(shi)間(jian)為(wei)7-9h；然后75-85℃水(shui)浴(yu)12-18min滅(mie)活酶(mei)，反應結(jie)束。復合酶(mei)的(de)加(jia)入(ru)(ru)量優(you)選(xuan)為(wei)9000-11000U/g，配比為(wei)蝸牛酶(mei):木瓜酶(mei):胃蛋白酶(mei):胰蛋白酶(mei)＝8-12:4-6:13-17:18-22。
(2)水解后離(li)心去除沉淀(dian)。優選的，離(li)心去除沉淀(dian)的工(gong)藝條件為：溫度(du)3-5℃，轉速10000-14000rpm，時間12-18min。
(3)水解液減壓旋(xuan)轉蒸發(fa)濃(nong)縮(suo)(suo)(suo)，采用(yong)10000Da透(tou)(tou)析袋(dai)透(tou)(tou)析；然后將袋(dai)外溶(rong)液減壓旋(xuan)轉蒸發(fa)濃(nong)縮(suo)(suo)(suo)后，濃(nong)縮(suo)(suo)(suo)液利用(yong)5000Da透(tou)(tou)析袋(dai)透(tou)(tou)析，取袋(dai)內溶(rong)液，經(jing)低溫(wen)冷凍(dong)干燥，即為虻(meng)蟲多肽(tai)。優選的，減壓旋(xuan)轉蒸發(fa)濃(nong)縮(suo)(suo)(suo)的溫(wen)度在(zai)40-60℃。
上述制(zhi)備(bei)方(fang)法制(zhi)得(de)的虻(meng)蟲多肽(tai)，其(qi)分子量為5000-10000Da。
上述虻蟲(chong)多肽(tai)在制備抑制腫瘤(例(li)如抑制肝癌細(xi)胞(bao)(bao)、胃癌細(xi)胞(bao)(bao)、乳腺癌細(xi)胞(bao)(bao)、肺癌細(xi)胞(bao)(bao)或結腸癌細(xi)胞(bao)(bao)等等)的藥(yao)物上的應用。
實施例1
制備方法：
將虻蟲研(yan)磨成漿，加(jia)入(ru)適量的水稀(xi)釋，離心(4℃，12000rpm，15min)去(qu)除沉淀(dian)，加(jia)入(ru)復合酶(mei)(mei)(mei)(mei)水解(jie)。酶(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)溫度為50℃，加(jia)酶(mei)(mei)(mei)(mei)量為10000U/g，酶(mei)(mei)(mei)(mei)配比為蝸牛酶(mei)(mei)(mei)(mei):木瓜酶(mei)(mei)(mei)(mei):胃蛋(dan)白酶(mei)(mei)(mei)(mei):胰蛋(dan)白酶(mei)(mei)(mei)(mei)＝10:5:15:20，酶(mei)(mei)(mei)(mei)水解(jie)時間(jian)為8h，pH為7.5，之后80℃水浴15min滅活酶(mei)(mei)(mei)(mei)。反應結束。
水(shui)解后離心(4℃，12000rpm，15min)去除沉淀(dian)。
水解液減(jian)壓(ya)(ya)旋(xuan)轉蒸(zheng)發(fa)濃(nong)縮(suo)(50℃)，采(cai)用10000Da透析(xi)袋(dai)(dai)透析(xi)；將(jiang)袋(dai)(dai)外(wai)溶液減(jian)壓(ya)(ya)旋(xuan)轉蒸(zheng)發(fa)濃(nong)縮(suo)(50℃)后，濃(nong)縮(suo)液利用5000Da透析(xi)袋(dai)(dai)透析(xi)，取袋(dai)(dai)內溶液，經低(di)溫冷凍干燥，即為虻蟲活(huo)性多肽粉(分子量(liang)5000-10000Da)。
以下通過(guo)體外細胞實驗(yan)(yan)研(yan)究本(ben)發明(ming)(ming)(ming)活性多肽(tai)粉(fen)對幾種常見腫瘤(liu)的體外抑(yi)制(zhi)作用，結果表明(ming)(ming)(ming)本(ben)發明(ming)(ming)(ming)多肽(tai)粉(fen)對實驗(yan)(yan)的腫瘤(liu)細胞有(you)抑(yi)制(zhi)作用，例舉的體內實驗(yan)(yan)結果表明(ming)(ming)(ming)，本(ben)發明(ming)(ming)(ming)活性多肽(tai)對荷(he)瘤(liu)小(xiao)鼠腫瘤(liu)有(you)一定的抑(yi)制(zhi)作用。
一(yi)、體外(wai)抗腫(zhong)瘤實驗(yan)(MTT比(bi)色法)
1.材料與方法
1)癌(ai)細胞的(de)選(xuan)取：人肝癌(ai)細胞Hep G-2、人胃癌(ai)細胞SGC-7901、人乳腺(xian)癌(ai)細胞MCF-7、人肺癌(ai)細胞A549和人結腸(chang)癌(ai)細胞HT-29。
2)取上述對數生長期的細胞，經0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后重懸細胞，用血球平板計數調整細胞懸液的濃度至5×104個/mL，加至96孔板中，每孔100μL，于37℃恒溫CO2培養箱中培養；
3)培養24h后吸出廢舊培養液，加入終體積為200μL的含有不同濃度本發明實施例1(低、中、高組的濃度分別為0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml)的活性多肽粉和陽性藥物(5-氟尿嘧啶，5-FU終濃度為0.5mg/ml)的新鮮基礎培養基，并以PBS為陰性對照，每組設置5個平行樣品，于CO2培(pei)(pei)養(yang)箱37℃恒溫培(pei)(pei)養(yang)。
4)48h后(hou)吸出(chu)藥液，加(jia)入5mg/mL的(de)MTT溶液(Sigma)20μl和新鮮基礎培(pei)養(yang)(yang)基180μL；繼續恒溫培(pei)養(yang)(yang)4h，棄去含有MTT的(de)培(pei)養(yang)(yang)液，加(jia)入150μl DMSO后(hou)振蕩均(jun)勻，于(yu)490nm波長(chang)處測(ce)定光密(mi)度值。
5)癌細(xi)胞生(sheng)長(chang)抑制率計算方法：
抑制率(％)＝[(OD對照—OD空白)—(OD給藥—OD空白)]/(OD對照—OD空白)
6)結果(guo)統計：以均數±標準差表示，采用SPSS 15.0軟件進行統計處理，多組(zu)均數比較采用單因素方差分析(xi)。
2.實驗結果
本實(shi)(shi)驗(yan)通(tong)過MTT比色(se)法分(fen)析(xi)各多肽(tai)組分(fen)對(dui)(dui)肝癌(ai)(ai)(ai)(ai)細(xi)胞(bao)(bao)Hep G-2、乳腺癌(ai)(ai)(ai)(ai)細(xi)胞(bao)(bao)MCF-7、胃癌(ai)(ai)(ai)(ai)細(xi)胞(bao)(bao)SGC-7901、肺癌(ai)(ai)(ai)(ai)細(xi)胞(bao)(bao)A549和結腸癌(ai)(ai)(ai)(ai)細(xi)胞(bao)(bao)HT-29的(de)生長抑(yi)制(zhi)作(zuo)用(yong)。表1結果可以(yi)看出，不同濃度的(de)本發(fa)明活性多肽(tai)對(dui)(dui)實(shi)(shi)驗(yan)5種癌(ai)(ai)(ai)(ai)細(xi)胞(bao)(bao)均有抑(yi)制(zhi)作(zuo)用(yong)，其中高劑量組與陽性對(dui)(dui)照組(5-FU藥(yao)(yao)物組)相比，除對(dui)(dui)肺癌(ai)(ai)(ai)(ai)細(xi)胞(bao)(bao)A549的(de)抑(yi)制(zhi)活性有明顯差(cha)異(yi)(p<0.01)，其他各組均無明顯差(cha)異(yi)。而本發(fa)明活性多肽(tai)源(yuan)于(yu)傳統中藥(yao)(yao)虻(meng)蟲，毒副作(zuo)用(yong)更少，應(ying)用(yong)將(jiang)更廣泛(fan)。
表1各組對(dui)不同癌細胞的抑制(zhi)率
注：※：高劑量組與(yu)5-FU藥(yao)物組相比p<0.01。
二、荷瘤小鼠實驗
1材料與方法
1.1動物及瘤株SPF級雄性昆明種(KM)小鼠，體質量(20±2)g；小鼠H22肝(gan)癌細胞由廣東(dong)藥科大學(xue)提供。
1.2藥物及制(zhi)備本發明活(huo)性(xing)多肽粉(按實(shi)施例1制(zhi)備方(fang)法制(zhi)得)，4℃冰箱保存備用；5-氟尿嘧啶(5-FU；美國Sigma公司)。
1.3荷H22小鼠肝癌模型復制(zhi)
將腹部隆起明顯的H22肝癌腹水瘤小鼠，無菌條件下從腹腔抽出瘤液，以生理鹽水稀釋，1000r/min離心3min，調整瘤細胞濃度為5×106/mL，于小鼠右腋下行皮下無菌接種，接種量為0.2mL/只(即每只1×106個細胞)。
1.4動物分組與(yu)給藥
50只小鼠隨機分為模型組，化療藥物組(陽性對照組)，本發明活性多肽粉(實驗組)高、中、低劑量組，每組10只。接種24h后，實驗組分別以20、40、80mg·kg-1·d-1劑量灌胃給藥；陽性對照組以5-FU 25mg·kg-1·d-1劑量腹(fu)腔注射(she)，隔日(ri)1次；模(mo)型組給(gei)予(yu)等容積生理鹽水灌胃；連(lian)續給(gei)藥14d。
1.5瘤(liu)指數(shu)(shu)檢測(ce)稱取瘤(liu)體質量(liang)并(bing)計算瘤(liu)指數(shu)(shu)：p瘤(liu)指數(shu)(shu)＝m瘤(liu)體/m體質量(liang)。用免(mian)疫組織化學法檢測(ce)腫瘤(liu)組織VEGF、MMP-9蛋(dan)白的表達水平。
1.6統(tong)(tong)計方法實驗結(jie)果以均數±標(biao)準差表示，采用SPSS 15.0軟件進行統(tong)(tong)計處(chu)理，多組均數比較采用單(dan)因素方差分析。
2.實驗結果
表2結果顯示：發(fa)明活性多肽粉高(gao)、中劑量(liang)組(zu)(zu)及(ji)化療藥物組(zu)(zu)均能顯著減小(xiao)荷(he)瘤(liu)小(xiao)鼠(shu)瘤(liu)體質量(liang)及(ji)瘤(liu)指(zhi)數，中劑量(liang)、高(gao)劑量(liang)實驗(yan)組(zu)(zu)與模型組(zu)(zu)比較，差異(yi)有統計學(xue)意義(P＜0.01)。
各組(zu)(zu)對荷H22小鼠(shu)瘤(liu)組(zu)(zu)織VEGF、MMP-9蛋(dan)白表(biao)達的影響結果見(jian)表(biao)3：高劑(ji)量(liang)活性(xing)多肽粉實驗(yan)(yan)組(zu)(zu)能顯(xian)著減少VEGF蛋(dan)白的表(biao)達，高劑(ji)量(liang)活性(xing)多肽粉實驗(yan)(yan)組(zu)(zu)及(ji)陽性(xing)對照組(zu)(zu)均能顯(xian)著減少MMP-9蛋(dan)白的表(biao)達，與(yu)模型組(zu)(zu)比較，差異均有統計(ji)學意義(P<0.01)。
表2各組(zu)對荷H22小鼠瘤體質量(liang)(m)與(yu)瘤指數(shu)(p)的影響
注：※：與模型組相比p<0.01。
表3各組(zu)荷(he)瘤小(xiao)鼠肝(gan)癌組(zu)織VEGF、MMP-9表達比較
注：※：與模型組相比(bi)p<0.01。
實施例2
制備方法：
將虻(meng)蟲研磨(mo)成漿，加(jia)入適量的水(shui)(shui)稀釋，離(li)心(xin)(5℃，11000rpm，15min)去除沉(chen)淀，加(jia)入復合酶(mei)(mei)水(shui)(shui)解(jie)。酶(mei)(mei)解(jie)溫度(du)為(wei)45℃，加(jia)酶(mei)(mei)量為(wei)11000U/g，酶(mei)(mei)配比為(wei)蝸(gua)牛酶(mei)(mei):木瓜酶(mei)(mei):胃蛋白(bai)酶(mei)(mei):胰蛋白(bai)酶(mei)(mei)＝10:5:15:20，酶(mei)(mei)水(shui)(shui)解(jie)時(shi)間(jian)為(wei)8h，pH為(wei)7.5，之后80℃水(shui)(shui)浴15min滅(mie)活酶(mei)(mei)。反應結(jie)束。
水(shui)解后離心(xin)(5℃，11000rpm，15min)去(qu)除(chu)沉(chen)淀。
水解液減壓旋轉(zhuan)蒸發濃(nong)縮(45℃)，采用10000Da透(tou)析(xi)袋透(tou)析(xi)；將袋外溶液減壓旋轉(zhuan)蒸發濃(nong)縮(45℃)后，濃(nong)縮液利用5000Da透(tou)析(xi)袋透(tou)析(xi)，取(qu)袋內溶液，經低溫冷凍干燥，即(ji)為虻蟲活性多(duo)肽粉(分子(zi)量(liang)5000-10000Da)。
實施例3
酶(mei)配比為蝸牛酶(mei):木瓜酶(mei):胃蛋白酶(mei):胰蛋白酶(mei)＝8:4:13:18，其(qi)他同實施例1。
實施例4
酶配比為蝸牛酶:木瓜酶:胃(wei)蛋(dan)白酶:胰(yi)蛋(dan)白酶＝12:6:17:22，其他同實施例1。
實施例5
酶解溫度為(wei)55℃，其他同實施(shi)例(li)1。
實施例6
減(jian)壓旋(xuan)轉蒸發濃(nong)縮的溫度在60℃，其他同實施例1。