Ace抑制肽及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體涉及ACE抑制肽及其應用。
【背景技術】：
[0002] 高血壓是全球最常見的慢性病，是導致心血管病和腎臟病等發生以及死亡的 最主要危害因素。人體的血壓調節主要是受到血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS)和激肽系統（kallikreinkininsystem，KKS)控制，而血管緊張素轉化酶 (Angiotensinconvertingenzyme，ACE)在這兩個系統中起著關鍵作用。ACE是一種羧基 二肽酶，廣泛分布于哺乳動物的組織中，主要以膜結合胞外酶的形式存在于血管上皮細胞。 在RAS系統中，ACE能夠使沒有生理活性的血管緊張素I(AngiotensinI，AngI)轉化 為具有升壓活性的血管緊張素II(AngiotensinII，AngII)。在KKS系統中，ACE可將血管 舒緩激肽降解為失活片段，導致血管收縮，引起血壓升高。目前高血壓的藥物治療主要是對 ACE進行抑制，阿利吉侖、卡托普利、依那普利、阿拉普利和賴諾普利都是廣泛應用的抗高血 壓藥物。然而，這些藥物會引發諸如咳嗽、過敏、味覺紊亂和皮疹等副作用，因此，尋找安全 可靠、毒副作用小的ACE抑制劑成為抗高血壓藥物研究的熱點。
[0003] 近年來，相關研究表明一些從動物、植物以及乳制品中分離得到的天然生物活性 肽具有抑制ACE活性、降低血壓的作用。相比傳統降壓藥物這些天然活性肽具有特異性高、 毒副作用小、療效好、可用藥劑量更大等優點。在這其中二肽和三肽可以在小肽轉運蛋白 (peptidetransporter)的幫助下被腸粘膜完整的吸收，因此，這些二肽和三肽對ACE的抑 制作用以及降壓效果也較為明顯。目前尚未有研究對二肽的氨基酸構成以及其ACE抑制活 性進行系統的分析研究。

【發明內容】
：
[0004] 本發明的第一個目的是提供對ACE(血管緊張素轉化酶）的活性具有持續穩定的 抑制作用，具有良好降血壓效果的ACE抑制肽。
[0005] 本發明的ACE抑制肽，其氨基酸序列為CA(Cys_Ala，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1 所示）或CH(CyS-His，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示）。
[0006] 本發明的第二個目的是提供上述ACE抑制肽在制備ACE抑制藥物中的應用。
[0007] -種ACE抑制藥物，其含有上述ACE抑制肽作為活性成份。
[0008] 本發明的第三個目的是提供上述ACE抑制肽在制備降血壓藥物中的應用。
[0009] -種降血壓藥物，其含有上述ACE抑制肽作為活性成份。
[0010] 本發明的二肽CA或CH對ACE的活性具有持續穩定的抑制作用，并經動物試驗發 現，二肽CA在大鼠體內具有良好的降血壓效果，為合成高血壓治療藥物提供參考。
【附圖說明】：
[0011] 圖1是二肽CA和CH的ACE抑制活性；
[0012] 圖2是CA灌胃后2小時SHR大鼠血壓改變情況。血壓變化數據以"平均值土標 準誤"形式表示。*P〈〇. 05, **p〈0. 01表示給藥前后血壓發生顯著變化；
[0013] 圖3是CA灌胃后4小時SHR大鼠血壓改變情況。血壓變化數據以"平均值土標 準誤"形式表示。*P〈〇. 05, **p〈0. 01表示給藥前后血壓發生顯著變化；
[0014] 圖4是灌胃后2小時SHR大鼠SBP隨CA劑量增加呈線性下降趨勢。
【具體實施方式】：
[0015] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0016] 實施例1 :
[0017] 1?實驗部分
[0018] 1.1實驗材料和儀器
[0019]實驗材料：35種合成二肽（由吉爾生化上海有限公司合成）、卡托普 利（Captoril)、呋喃丙烯酰三肽（FAPhe-Gly-Gly，FAPGG)、ACE、原發性高血壓大鼠 (SpontaneouslyHypertensiveRats，SHR)、生理鹽水
[0020] 儀器設備：酶標儀、移液器、大小鼠無創血壓儀，注射器，灌胃針，SPF實驗室
[0021] 1.2實驗方法：
[0022] 1. 2. 1ACE抑制率的測定
[0023] 二肽的ACE抑制率使用可見分光光度法進行測定。具體方法是利用FAPGG作為ACE 作用的底物，FAPGG最大吸收峰在340nm附近，用ACE將FAPGG水解成FAP和GG可使340nm 附近處吸光度降低，降低的速率與ACE活性成正比。通過測定FAPGG在340nm附近處吸光 度下降速度可計算出ACE的活性，進而根據添加抑制劑前后ACE酶活的變化間接反映不同 ACE抑制劑的抑制活性。本實驗將二肽樣本用超純水溶解后配置20mg/mL原液，然后稀釋 成20yg/mL濃度的樣品作為實驗組，以0. 002yg/mL的卡托普利溶液為陽性對照，以生理 鹽水為陰性對照。實驗于37°C下，以340nm為主波長，405nm為參比波長，檢測吸光度值的 變化，連續檢測1小時。根據公式：
計算樣品的抑制率。其中E為 樣品孔的ACE酶活（U/L)，計算公式為
；\為樣品孔ACE動力學曲線直線段 的斜率，Sp為未加抑制劑孔的ACE動力學曲線直線段的斜率，Sb為空白孔ACE動力學曲線 直線段的斜率。
[0024] 1.2. 2大鼠降壓實驗
[0025] 購買31周齡的原發性高血壓大鼠，飼養一周適應環境后進行分組實驗。按照如 下劑量：卡托普利（l〇〇mg/kg)、生理鹽水、CA(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg、lmg/ kg)將相應藥品溶于生理鹽水中利用灌胃方式進行給藥。利用無創血壓儀分別測量大鼠灌 胃前、灌胃后2小時、灌胃后4小時后的舒張壓（DiastolicBloodPressure，DBP)、收縮壓 (SystolicBloodPressure，SBP)和平均動脈壓（MeanBloodPressure，MBP)，取其平均值 作為相應的血壓值。
[0026] 1. 2. 3統計分析
[0027] 數據統計采用R進行兩樣本均值單尾t檢驗，數值均以均值土標準誤表示。
[0028] 2?結果與討論
[0029] 2. 1 35種二肽的ACE抑制率
[0030] 本研究用可見光分光光度法連續監測35種二肽在一小時內對ACE的抑制活性，結 果發現除IL、IV和KD外，其余32種二肽都對ACE有不同程度的抑制（表1)，在這其中CA 和CH的ACE的抑制率分別達到了 84. 38%和70. 79% (圖1)，顯著高于其他二肽。
[0031] 表1 35種二肽的ACE的抑制率
[0032]
[0033]
[0034] 如圖1所示1小時連續檢測發現CA和CH對ACE的活性有持續穩定的抑制作用， 其抑制效果與〇. 002yg/mL的卡托普利的作用效果相近。
[0035] 2. 2CA和CH1(：5。測定
[0036] 研究對二肽CA和CH的ACE抑制活性進行更加精確的測定，濃度梯度實驗結果顯 示CA的IC5。值為 23. 22yM，CH的 1C5。值為 61. 17yM。
[0037] 2. 3CA體內降血壓實驗
[0038] 相關研究表明部分ACE抑制劑的ACE抑制活性與實際降血壓作用之間存在出入， 因此，體外檢測所得到的具有高ACE抑制率的二肽是否能在生物體內擁有好的降血壓效果 還需要進一步的動物實驗來驗證。在本研究中我們選用CA進行SHR大鼠降血壓實驗。用 CA、生理鹽水和卡托普利對SHR大鼠進行灌胃，并分別于給藥后2小時、4小時監測大鼠的血 壓變化。
[0039] 如圖2所示當CA劑量為lmg/kg時，給藥后2小時SHR大鼠血壓無明顯 改變；當CA劑量達到10mg/kg時SHR大鼠血壓開始呈下降趨勢，其中SBP下降 16. 1±4. 73mmHg(p〈0. 05)，下降較為明顯。隨著CA劑量不斷提高，給藥后2小時SHR大鼠 血壓下降幅度進一步增大，當CA劑量達到100mg/kg時SBP下降49. 26± 10. 42mmHg，DBP下 降45. 58±9. 27mmHg，MBP下降47. 01 ±9. 64mmHg，各指標均顯著低于給藥前（p〈0. 01)，降壓 效果與同等濃度的卡托普利持平。
[0040] 我們在給藥后4小時繼續檢測SHR大鼠血壓變化。發現當CA劑量為10mg/kg時 給藥后4小時降壓作用基本消失（圖3)。而當CA劑量達到25mg/kg時，其降壓效果則要優 于給藥后2小時。以SBP為例，用25mg/kg的CA灌胃SHR大鼠后4小時的SBP比給藥前下 降 50. 86±3. 16mmHg(p〈0. 01)，比給藥后 2 小時下降 27. 67±11. 02mmHg(p= 0? 09);當CA 濃度達到50mg/kg和100mg/kg時給藥后4小時各血壓指標血壓也較給藥后2小時低。DBP 和MBP的變化與SBP-致。
[0041] 由圖2和圖3可以看出SBP、DBP、MBP下降幅度隨著CA劑量的增加整體呈上升趨 勢。但我們發現灌胃后2小時以上各指標下降值與CA劑量呈很好的正相關，而在灌胃后4 小時以上各指標變化值與CA劑量呈非線性關系。利用pearson相關系數分析CA劑量與血 壓指標灌胃前后的改變量之間的相關性，得到CA對應的各項指標的相關系數。如表2所示， CA灌胃后2小時的各項血壓指標的平均改變量與劑量的相關系數R2>0. 8,說明CA急性藥效 與劑量呈線性正相關，CA急性藥效的研究適宜在灌胃后2小時進行采樣。圖4反映了SHR 大鼠給藥后2小時SBP下降幅度隨CA劑量增加呈線性增長。以上結果同時顯示當CA劑量 達到25mg/kg后，給藥后4小時SHR大鼠血壓下降幅度不再隨劑量增加發生明顯改變，SBP 下降水平維持在50mmHg左右。
[0042]
[0043] 針對生物活性肽降血壓效果的研究曾顯示，不同長度的短肽在SHR大鼠體內的有 效作用時間不同。二肽和三肽（如：IW、VW、LW、IY及LKP)因為較容易被腸粘膜完整的吸 收，其達到最大藥效的時間一般在給藥后2小時左右，當時間超過2小時后其降壓效果就逐 步降低。而相對長一些的LKPNM、LVGRPRHQG和卡托普利的最大藥效時間則是在給藥后4~ 8小時不等。在本研究中我們發現CA在給藥4小時后的降壓效果優于給藥后2小時。分析 其原因可能與CA在體內吸收相較其他二肽更慢，或作用半衰期更長有關。
[0044] 此外，從植物、動物或奶制品中分離得到的具有高ACE抑制活性的生物肽C端多為 色氨酸（W)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)和脯氨酸（P)，而N端多為脂肪類支鏈氨基酸如纈氨 酸（V)和異亮氨酸（I)。氨基酸的構成與短肽和ACE的親和能力緊密相關。而在本研究中 我們對35種二肽進行了系統的篩選，發現僅有的兩個N端為半胱氨酸的二肽CA和CH的 ACE抑制活性明顯高于其他二肽。提示N端為Cys同樣有利于二肽和ACE結合，從而提高短 肽的ACE抑制活性。這一發現為進一步的生物活性肽的降壓研究提供了新的線索。
【主權項】
1. ACE抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列為CA或CH。2. 權利要求1所述的ACE抑制肽在制備ACE抑制藥物中的應用。3. -種ACE抑制藥物，其特征在于，含有權利要求1所述的ACE抑制肽作為活性成份。4. 權利要求1所述的ACE抑制肽在制備降血壓藥物中的應用。5. -種降血壓藥物，其特征在于，含有權利要求1所述的ACE抑制肽作為活性成份。
【專利摘要】本發明公開了ACE抑制肽及其應用。所述的ACE抑制肽，其氨基酸序列為CA或CH。本發明的二肽CA或CH對ACE的活性具有持續穩定的抑制作用，并經動物試驗發現，二肽CA在大鼠體內具有良好的降血壓效果，為合成高血壓治療藥物提供參考。
【IPC分類】A61K38/05, A61P9/12, C07K5/062
【公開號】CN105111279
【申請號】CN201510465867
【發明人】潘武廣, 朱威
【申請人】廣州世優生物科技有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年7月30日