本發明涉及用于預防或治療諸如視網膜水腫、黃斑變性和靜脈曲張的血管性水腫的組合物，其包含芍藥根的提取物或芍藥根和甘草的混合提取物作為活性成分。
背景技術：
：血管性水腫是指由于皮膚最深處的凹陷中或皮膚下或粘膜下方的血管的通透性升高，流體從血管流出并在周圍組織中匯集(即，引起水腫)導致的疾病，并且通常發生在相對疏松的組織中，其中在眼或嘴唇周圍或在手中是常見的，并且還發生在舌、口、喉、粘膜如胃腸道壁中，特別是血-視網膜屏障由于血管性水腫而損壞，引起黃斑水腫、視網膜水腫或黃斑變性，或靜脈曲張。黃斑變性(年齡相關性黃斑變性：AMD)是不可逆的疾病之一，其是老年人并發的代表性眼科疾病，并導致失明。由于世界范圍內的人口老齡化，發達國家的發病率尤其升高。在美國，黃斑變性是失明的主要原因，并且還受環境因素和遺傳因素的影響，并且尤其是吸煙被報導為最致命的疾病因素。除此之外，肥胖和過量攝取抗氧化劑和膳食脂肪也引起黃斑變性和影響進一步發展。因此，健康的飲食攝入、體重控制、適度運動和不吸煙減少黃斑變性的發病。在美國，早期(干性)黃斑變性的患病率在40-50年齡組中為約3.9％，但在超過75歲的年齡組中為22.8％，其顯示具有非常高的發病率(BeaverDamEyeStudy)。此外，在超過75歲的老年組中的發病率為5.4％，其中7.1％為終末黃斑變性。1.9％的居住在澳大利亞的高加索人是終末黃斑變性患者，在55歲或以下的青年組中顯示0％的發病率，但在五年中在超過85歲的老年組中顯示18.5％的發病率。此外，對于亞洲的馬來人也是類似的(BlueMountainEyeStudy)(Progressinretinalandeyeresearch,1-15,2014)。對于韓國，韓國視網膜學會(KoreanRetinaSociety)報導在過去的一年，濕性黃斑變性患者增加了7.4倍，并且在40、50歲的中年和老年人中的發病率增加了9倍(2011)。但最嚴重的是沒有黃斑變性治療劑。來自瑞士Novartis的Lucentis是抗體治療劑并且非常昂貴，并且不可能使疾病進展停止到恢復視力的程度。黃斑變性分為干性黃斑變性和濕性黃斑變性。干性黃斑變性是由于損傷的黃斑而并發的，所述損傷的黃斑是由于廢物質玻璃疣堆積在黃斑上，破壞脈絡膜和黃斑上部之間的代謝連接，從而損傷黃斑。如果該進展繼續，其進展到濕性黃斑變性。也就是說，由于血管通過在黃斑區域積累廢物而不起作用，從而不提供諸如營養物的必需品，則其開始產生新的異常血管(脈絡膜新生血管：CNV)。這些產生的血管具有非常薄弱的壁，將血管中的蛋白或紅血細胞滲漏到黃斑區域和視網膜中，由此最終由于血管出血，發生各種因素如殺死視桿和視錐感光細胞和視網膜色素上皮細胞，最終導致失明(NutritionResearch,34,95-105,2014；Plosone,8,e71064,2013)。視網膜色素上皮細胞(RPE)通過維持非增殖狀態并支持布魯赫膜(BrM)而在維持健康的眼睛中起重要作用。由視網膜色素上皮細胞分泌的胱抑素C是強力的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，并且在正常控制蛋白在BrM中的循環中起重要作用，等等。然而，如果晚期糖基化終產物過度積累，則胱抑素C蛋白的表達和分泌降低，導致RPE基底部分中的蛋白水解作用的不平衡，致使黃斑變性發生(IOVS,2014,55(2),926-34)。因此，當晚期糖基化終產物的產生被抑制時，也可以預防(治療)黃斑變性。VEGF(血管內皮生長因子)由視網膜色素上皮細胞層分泌，以正常調節布魯赫膜(BrM)周圍的部分，并控制脈絡膜毛細血管內皮細胞的生長和緊密度。在正常條件下，VEGF分泌是非常嚴格地被調節的，以防止血管生成。然而，如果VEGF分泌未被嚴格調節，則其充當導致黃斑變性的終末期的關鍵因素。如果VEGF分泌異常升高，則出現在黃斑變性中的異常和薄弱的血管產生并被破壞(J.Cell.Mol.Med.,17,7,833-843,2013)。視網膜水腫是這樣發生的，當視網膜毛細血管壁在異常環境中損傷使存在于視網膜毛細血管中的蛋白、紅血細胞等滲漏到視網膜中，所述蛋白、紅血細胞在視網膜中匯集導致水腫。靜脈曲張是靜脈出現在皮膚外部的疾病，其中分布在手臂和腿中的靜脈被分類為位于肌肉之間的大深靜脈、出現在皮膚下面的淺靜脈和連接這兩種靜脈的交通靜脈，意味著其中淺靜脈伸展并且看起來突出皮膚外，并且所述靜脈曲張是這樣患上的：當使靜脈內部的血流總是朝向心臟保持恒定的瓣膜被破壞時，當靜脈曲張中的壓力升高時靜脈壁變薄弱，從而通向心臟的血液回流使靜脈伸張。芍藥根是毛茛科(Ranunculaceae)的多年生植物，其中白芍(Radixpaeoniaealba)和赤芍(Radixpaeoniaerubra)通過殼的存在或不存在來確定，其中具有殼的稱為赤芍，且殼被剝去的另一種稱為白芍(Altern.Med.Rev.6(5),495-499,2001)。白芍與赤芍具有對胃腸平滑肌和子宮平滑肌的收縮的抑制作用，冠狀動脈擴張作用以及預防血管疾病的動脈粥樣硬化、降低血壓和改善血流的作用。芍藥根提取物的這些作用似乎源自抗氧化作用(J.Ethnopharmacol.67,111-119,1999)、血小板抗聚集作用(PlantaMed,65,595-599,1999)、抗血栓作用(Chem.Pharm.Bull,35(2),849-852,1987)、高脂血癥預防(Fitoterapia,75(1),45-49,2004)等。此外，據報導，芍藥根的一些組分糖苷在治療腦梗塞中有效(ZhongYaoCai,23(2),95-97,2000)。甘草是光果甘草(Glycyrrhizaglabra)和烏拉爾甘草(G.uralensis)和其他同屬植物的干燥根和根莖，其為屬于豆科的草本多年生植物，并且包含黃酮類化合物作為主要成分，如甘草苷，包括三萜皂苷的甘草甜素。藥理作用包括腎上腺皮質激素樣作用、抗胃潰瘍功效、平滑肌松弛作用、肝保護作用、抗炎、抗過敏作用、抗病毒作用(Orientalmedicinepharmacology,JipmoonDang,434-436,2001)。此外，目前施用的抗體(蛋白質)藥物僅部分調節抑制引起黃斑變性或視網膜水腫的許多因素的新血管的機制。此外，眾所周知的事實是，它們不能完全控制該機制。對于包含芍藥根提取物或芍藥根和甘草的提取物的組合的天然提取物材料是未知的，其可以克服目前施用的治療劑的局限，并且同時控制與視網膜水腫和黃斑變性相關的病因。因此，本發明人已經努力開發了用于預防和治療包括視網膜水腫、黃斑變性和靜脈曲張的血管性水腫的組合的天然提取物材料，因此發現芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物抑制晚期糖基化終產物的產生，抑制在各種動物模型中導致視網膜水腫的血-視網膜屏障破壞，保護或治療導致干性黃斑變性的視網膜下區域，抑制導致濕性黃斑變性的血管生成，因此所述提取物可以有效地用作用于預防和治療包括黃斑變性、黃斑水腫、視網膜水腫或靜脈曲張的血管性水腫的組合物的活性成分，并完成了本發明。發明詳述技術問題本發明的目的是提供用于預防和治療血管性水腫的組合物，其包含芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物作為活性成分。技術方案為了實現以上目的，本發明提供了用于預防和治療血管性水腫的藥物組合物，其包含芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物作為活性成分。此外，本發明提供了用于預防和改善血管性水腫的健康功能食品，其包含芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物作為活性成分。此外，本發明提供了用于治療血管性水腫的方法，包括給予患有血管性水腫的個體藥學有效量的芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物的步驟。此外，本發明提供了用于改善血管性水腫的方法，包括給予患有血管性水腫的個體藥學有效量的芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物。此外，本發明提供了芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物用作用于預防和治療血管性水腫的藥物組合物的用途。此外，本發明提供了芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物用作用于預防和改善血管性水腫的健康功能食品的用途。發明效果根據本發明的芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物抑制晚期糖基化終產物的過度產生，抑制在各種動物模型中導致視網膜水腫的血-視網膜屏障破壞，保護或治療導致干性黃斑變性的視網膜下區域，抑制導致濕性黃斑變性的血管生成，因此可以有效地用作用于預防和治療包括黃斑變性、黃斑水腫、視網膜水腫或靜脈曲張的血管性水腫的組合物的活性成分。附圖簡要描述圖1是顯示通過HPLC(高效液相色譜)測量的芍藥根和甘草的混合提取物的色譜圖的圖表(CJG30R(a)和CJGT(b))。圖2是確定用糖醛處理的ECM(細胞外基質)中的晚期糖基化終產物產生的抑制作用的圖表。圖3是確定在高血糖環境下在人視網膜色素上皮細胞系中芍藥根和甘草的混合提取物(CJG30R)對晚期糖基化終產物產生的抑制作用的圖表。圖4是確定在動物模型引起視網膜水腫的血-視網膜屏障破壞的抑制作用的圖表：Nor：正常對照組；VEGF：VEGF(血管內皮生長因子)治療組；CJGT-lμg/ml：使用lμg/ml本發明的芍藥根和甘草的熱水提取物的治療組；CJGT-50μg/ml：使用50μg/ml本發明的芍藥根和甘草的熱水提取物的治療組；和CJGT-100μg/ml：使用100μg/ml本發明的芍藥根和甘草的熱水提取物的治療組。圖5是在MNU(N-甲基-N-亞硝基脲)誘導的黃斑變性動物模型中通過感光細胞的損傷預防來確定黃斑變性的預防作用的圖表：NOR：C57BL/6正常小鼠；MNU：MNU誘導的黃斑變性動物模型；CJGT-50：MNU誘導的黃斑變性動物模型+CJGT50mg/kg/天給藥組；和CJGT-100：MNU誘導的黃斑變性動物模型+CJGT100mg/kg/天給藥組。圖6是在NaIO3動物模型中通過視網膜色素上皮細胞的損傷預防來確定黃斑變性的預防作用的圖表：NOR：C57BL/6正常小鼠；NaIO3：NaIO3誘導的動物模型；CJG30R-50：NaIO3誘導的動物模型+CJG30R50mg/kg/天給藥組；CJG30R-100：NaIO3誘導的動物模型+CJG30R100mg/kg/天給藥組；CJGT-50：MNU誘導的動物模型+CJGT50mg/kg/天給藥組；和CJGT-100：MNU誘導的動物模型+CJGT100mg/kg/天給藥組。圖7是確定在Vldlr-/-黃斑變性動物模型中的視網膜血管損傷的抑制作用的圖表：NOR：C57BL/6正常小鼠；Vldlr-/-：濕性黃斑變性小鼠；和CJG30R-100：NaIO3誘導的動物模型+CJG30R100mg/kg/天給藥組。圖8是確定在Vldlr-/-黃斑變性動物模型中的視網膜新血管生成的抑制作用的圖表：NOR：C57BL/6正常小鼠；Vldlr-/-：濕性黃斑變性小鼠；和CJG30R-100：NaIO3誘導的動物模型+CJG30R100mg/kg/天給藥組。圖9是確定在Vldlr-/-黃斑變性動物模型中的色素上皮細胞損傷的抑制作用的圖表：NOR：C57BL/6正常小鼠；Vldlr-/-：濕性黃斑變性小鼠；和CJG30R-100：NaIO3誘導的動物模型+CJG30R100mg/kg/天給藥組。圖10是確定在Vldlr-/-小鼠的視網膜中的VEGF表達(深紫色染色：由箭頭表示)的抑制作用的圖表：Nor：C57BL/6正常小鼠；Vldlr-/-：濕性黃斑變性小鼠；和CJG30R-100：Vldlr-/-小鼠+CJG30R100mg/kg/天給藥組。圖11是確定在激光誘導的脈絡膜新生血管(CNV)大鼠模型中的視網膜新血管生成的抑制作用的圖表：CNV：使用激光處理的濕性黃斑變性小鼠模型；和CJG30R：使用激光處理的濕性黃斑變性小鼠模型+CJG30R100mg/kg/天給藥組。圖12是比較和分析CGJ30R和芍藥苷(PF)在MNU-誘導的年齡相關性黃斑變性嚙齒動物模型中的黃斑變性的預防和治療的圖表：NOR：C57BL/6正常小鼠；MNU：N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)誘導的動物模型；CGJ30R-100：MNU誘導的動物模型+CGJ30R100mg/kg/天給藥組；和PF-6.5：MNU誘導的動物模型+芍藥苷(PF)6.5kg/天給藥組。發明的實施方式在下文中，將詳細描述本發明。本發明提供了用于預防和治療血管性水腫的藥物組合物，其包含芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物作為活性成分。所述芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物顯示以下作用：抑制晚期糖基化終產物的過度產生，抑制在各種動物模型中導致視網膜水腫的血-視網膜屏障破壞，保護或治療導致干性黃斑變性的視網膜下區域，抑制導致濕性黃斑變性的血管生成。此外，所述血管性水腫優選地為選自黃斑變性、黃斑水腫、視網膜水腫和靜脈曲張中的任一種，但不限于此。所述芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物優選地通過包括以下步驟的制備方法制備，包括但不限于：1)通過將提取溶劑添加到芍藥根或芍藥根和甘草來提取的步驟；2)過濾步驟1)的提取物的步驟；和3)在減壓下濃縮步驟2)的過濾的提取物后，對其進行干燥的步驟。在該方法中，作為步驟1)中的芍藥根和甘草，可以沒有限制地使用栽培的那些或市售的那些。作為所述芍藥根，白芍和赤芍二者是可用的。所述芍藥和甘草優選地以10:1至1:1的重量比，更優選地以10:1、8:1和4:1的重量比，和最優選地以2:1的重量比混合。作為提取溶劑，優選地使用水、醇或其混合物。作為所述醇，優選地使用C1至C2低級醇，并且作為低級醇，優選地使用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇或甲醇。優選地，提取方法包括減壓和高溫提取、沸水提取、回流提取、熱水提取、冷提取、常溫提取、超聲提取或蒸汽提取，但不限于此。優選的是添加芍藥根和甘草的量的1至10倍的提取溶劑用于提取。提取溫度優選地為30至100℃，但不限于此。此外，提取時間優選地為2至48小時，但不限于此。此外，提取次數優選地為2至5次，但不限于此。在該方法中，步驟3)的減壓下濃縮使用真空減壓濃縮器或真空旋轉蒸發器，但不限于此。此外，干燥包括優選地減壓干燥、真空干燥、泡騰干燥、噴霧干燥或凍干，但不限于此。在本發明的具體實施例中，考慮到氨基胍作為陽性對照組是合成的單一化合物，本發明人已經使用熱水和乙醇制備了芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物，然后測定了晚期糖基化終產物產生的抑制作用，并因此發現本發明的芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物顯示比陽性對照組更顯著的晚期糖基化終產物產生的抑制作用，并且特別地具有非常優異的晚期糖基化終產物產生的抑制作用(參見表2、圖2和圖3)。此外，證實了通過驗證提取物抑制在各種動物模型中導致視網膜水腫的血-視網膜屏障破壞，保護或治療導致干性黃斑變性的視網膜下區域和抑制導致濕性黃斑變性的血管生成的事實，其可以有效地用作用于預防和治療血管性水腫的組合物的活性成分(圖2至圖6)。包含本發明的提取物或混合提取物的組合物除了以上成分以外可以包含一種或多種顯示相同或相似功能的活性成分。本發明的組合物還可以包含藥學上可接受的添加劑，其中作為藥學上可接受的添加劑，可以使用淀粉、糊化淀粉、微晶纖維素、乳糖、聚維酮、膠體二氧化硅、磷酸氫鈣、乳糖、甘露醇、太妃糖、阿拉伯樹膠、預膠化淀粉、玉米淀粉、粉末纖維素、羥丙基纖維素、歐巴代、羥基乙酸淀粉鈉、,巴西棕櫚蠟、合成硅酸鋁、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、蔗糖等。優選地相對于所述組合物以0.1至90重量份包含根據本發明的藥學上可接受的添加劑，但不限于此。也就是說，當在實踐中臨床給予時，本發明的組合物可以以各種口服或腸胃外劑型給予，并且當配制時使用稀釋劑或賦形劑，如普通填充劑、增量劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑和表面活性劑配混。用于口服給予的固體制劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑等，并且這樣的固體制劑可以通過將混合提取物與至少一種或多種賦形劑，例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠等混合來配混。此外，除了簡單的賦形劑以外，還可以使用潤滑劑如硬脂酸鎂和滑石。用于口服給予的液體制劑包括混懸劑、內服溶液劑、乳劑和糖漿劑，其中可以包含除了作為簡單稀釋劑的水或液體石蠟以外的各種賦形劑，例如，潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。用于腸胃外給予的制劑可以包括無菌水溶液、非水溶劑、混懸劑、乳劑、凍干制劑和栓劑。在非水溶劑和用于懸浮的溶劑中，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射的酯如油酸乙酯等。作為栓劑的基質，可以使用witepsol、macrogol、tween61可可脂、sevumlaurin、甘油明膠等。本發明的組合物可以根據希望的方法經口給予或腸胃外給予，并且優選選擇皮膚外用或腹膜內注射、直腸內注射、皮下注射、靜脈內注射、肌內注射或胸腔內注射的注射方法。根據患者的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥時間、給藥方法、排泄率和疾病嚴重程度，劑量具有各種范圍。根據患者的體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥時間、給藥方法、排泄率和疾病嚴重程度，本發明的組合物的劑量具有各種范圍，其中每日劑量可以基于本發明的提取物或混合提取物的量為0.0001至100mg/kg，優選地0.001至10mg/kg，并且可以每天給予1-6次。本發明的組合物可以單獨使用，或與手術、放射治療、激素治療、化學治療和使用生物反應調節劑的方法組合使用，用于預防和治療血管性水腫。此外，本發明提供了用于預防和改善血管性水腫的健康功能食品，其包含芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物作為活性成分。在優選地以10:1至1:1的重量比，更優選地以10:1、8:1和4:1的重量比和最優選地以2:1的重量比混合所述芍藥根和甘草之后制備混合提取物，但不限于此。血管性水腫優選地為選自黃斑變性(水腫)、視網膜水腫和靜脈曲張中的任一種，但不限于此。所述芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物抑制晚期糖基化終產物的產生(表2、圖2和圖3)，抑制在各種動物模型中導致視網膜水腫的血-視網膜屏障破壞，保護或治療導致干性黃斑變性的視網膜下區域，以及抑制導致濕性黃斑變性的血管生成，因此顯示抗血管性水腫作用，使得所述提取物可以有效地用作用于預防和治療血管性水腫的組合物的活性成分(圖4至圖10)。在下文中，將通過實施例和實驗實施例詳細描述本發明。然而，以下實施例和實驗實施例僅用于詳細說明本發明，本發明的內容不受其限制。實施例1芍藥根和甘草的混合提取物和芍藥根提取物的制備為了制備芍藥根和甘草的混合提取物，2013年3月從BaekjeDang(Daejeon,Korea)購買和使用芍藥根和甘草，并儲存在韓國東方醫學研究所(KoreaInstituteofOrientalMedicine)(Daejeon,Korea)的糖尿病并發癥研究組的冷凍室中。1-1芍藥根和甘草的30％乙醇提取物的制備通過混合6g芍藥根和3g甘草(2:1)，將總共9g添加到54ml的30％乙醇中，并在50℃下在3小時內回流兩次重復提取，來制備芍藥根和甘草在30％乙醇中的混合提取物(CJG30R)。1-2芍藥根和甘草的50％乙醇提取物的制備通過混合6g芍藥根和3g甘草(2:1)，將總共9g添加到54ml的50％乙醇中，并在50℃下在3小時內回流兩次重復提取，以與以上實施例1-1相同的方式來制備芍藥根和甘草在50％乙醇中的混合提取物(CGJ50R)。1-3芍藥根和甘草的70％乙醇提取物的制備通過混合6g芍藥根和3g甘草(2:1)，將總共9g添加到54ml的70％乙醇中，并在50℃下在3小時內回流兩次重復提取，以與以上實施例1-1相同的方式來制備芍藥根和甘草在70％乙醇中的混合提取物(CGJ70R)。產率為23.5％。1-4芍藥根和甘草的熱水提取物的制備為了制備芍藥根和甘草的熱水提取物，將6g芍藥根和3g甘草(2:1)混合，將10倍的蒸餾水添加到總共9g中，然后通過高速真空冷濃縮提取器或煎煮裝置振蕩約2小時以減壓濃縮，干燥，制得芍藥根和甘草的熱水提取物(CJGT)。1-5芍藥根提取物的制備為了制備芍藥根的熱水提取物，將約6倍的蒸餾水添加到芍藥根中，通過煎煮裝置振蕩約2小時以減壓濃縮，干燥，制得芍藥根的熱水提取物(CJ)。實施例2通過HPLC分析芍藥根和甘草的混合提取物中的指標成分(CJG30R和CJGT)為了分析芍藥根和甘草的混合提取物中的指標成分(CJG30R和CJGT)，從CJG30R和CJGT中各取10微升，注入柱中并進行HPLC(高效液相色譜)以獲得色譜圖。使用的HPLC系統配備有來自Agilent的1200HPLC、DAD檢測器和Chemstation軟件，以及來自PhenomenexInc.的Luna5C-18(4.0x250mm)分析柱。使用樣品自動進樣器注射樣品，流動相使用水和甲醇的混合溶液，流速為1.0ml/min，并且波長設置在230和250nm下。梯度從水:甲醇(70:30)開始，并且35分鐘后必須是水:甲醇(0:100)，用100％甲醇洗脫10分鐘。所有使用的分析溶劑均為HPLC級溶劑(Fisherscientific)。因此，如表1和圖1所示，確證CJG30R和CJGT的指標成分為沒食子酸、氧化芍藥苷、白芍苷、芍藥苷、甘草苷、苯甲酸、甘草甜素(圖1)。表1通過HPLC分析得到的CJG30R和CJGT中的芍藥苷的含量芍藥苷含量(％)CJG30R6.5CJGT6.1實驗實施例1對晚期糖基化終產物(AGE)產生的抑制作用的確定為了確定芍藥根提取物或芍藥根和甘草的混合提取物對晚期糖基化終產物產生的抑制作用，本發明人分別使用10mg/ml溶于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的牛血清蛋白(Sigma,St.Louis,MO,USA)作為蛋白質源，以及0.2M果糖和0.2M葡萄糖的混合液作為糖源。將實施例1的提取物和陽性對照組(氨基胍)溶于30μl的0.2％DMSO，然后再溶于15％的tween80中。將蛋白質源、糖源和如上制備的本發明的提取物混合并配混成總共1ml，然后各自在37℃下培養7天以允許糖基化。此時向其中添加0.02％的疊氮化物(疊氮化鈉)以防止在培養期間產生細菌。在培養后，測量熒光(熒光分光檢測器；Bio-TEK,SynergyHT,USA；Ex：350nm；Em：450nm)并然后使用以下公式1計算，結果示于表2中。公式1(FS為熒光強度)因此，如下表2所示，證實了與陽性對照組的氨基胍(AG)相比，在芍藥根和甘草的熱水提取物的晚期糖基化終產物產生的抑制作用優異1.2倍。還證實了與陽性對照組相比，芍藥根和甘草的30％、50％和70％乙醇提取物的作用分別優異1.7倍至2.3倍，并且實施例1-5的芍藥根提取物的作用優異12倍(表2)。因此，考慮到作為陽性對照組的氨基胍是合成的單一化合物，證實了本發明的混合提取物對晚期糖基化終產物產生具有非常優異的抑制作用。表2樣品IC50(μg/ml)實施例1-1的提取物(CJG30R)46.77±0.88實施例1-2的提取物(CJG50R)41.66±1.22實施例1-3的提取物(CJG70R)35.26±1.16實施例1-4的提取物(CJGT)69.44±1.66實施例1-5的提取物(CJ)6.84±0.09氨基胍(AG：陽性對照組)81.38±2.70實驗實施例2在使用糖醛處理的ECM中的晚期糖基化終產物產生的抑制作用在使用糖醛處理后，證實了在上述實施例1中制備的CJG30R和CJGT的晚期糖基化終產物產生的抑制作用。以10μg/cm2分配細胞外基質(ECM,Sigma-Aldrich,目錄號c-3867)，然后在4℃下包被過夜。第二天，將包被的板的ECM去除，在室溫下完全干燥，然后與具有預稀釋的不同濃度(1、5、10、20、50μg/ml)的100mM糖醛(Sigma-Aldrich)和CJG30R和CJGT一起配制成100μl的總量，并在37℃下反應4小時，借以證實是否抑制晚期糖基化終產物(AGE)的產生。在陽性對照組中，通過僅添加100mM乙醇醛(Sigma-Aldrich)證實AGE的產生。將所得物用PBS洗滌兩次，然后向其中添加100μl的50mM硼氫化鈉(Sigma-Aldrich)以中和剩余的醛基5分鐘。中和后，使用PBS洗滌所得物兩次，并使用熒光分析儀(Ex.370nm/Em440nm)確證，同時再次添加100μlPBS。在使用Prism5.0程序(GraphPad)的統計學處理中，p<0.05或更大的值是有義值。因此，如圖2所示，證實了CJG30RCJGT以濃度依賴性方式顯著抑制晚期糖基化終產物產生(**p<0.01vs非-AGE；***p<0.001vs非GE；##p<0.01vsAGE；###p<0.001vsAGE；圖2)。實驗實施例3CJG30R在高血糖環境下在人視網膜色素上皮細胞系中對晚期糖基化終產物產生的抑制作用的確定證實了在上述實施例1中制備的CJG30R在高血糖環境下在人視網膜色素上皮細胞系中顯示晚期糖基化終產物產生的抑制作用。具體地，使用杜氏改良伊格爾培養基(DMEM,Gibco,USA)在5％CO2-培養箱中培養在高血糖環境下的人視網膜色素上皮細胞系(ARPE-19：ATCC號CRL-2302)。在500μg/ml的BSA的終濃度下以及在25mM的高血糖條件下培養后，在(10、20μg/ml)濃度下處理本發明的CJG30R。此外，使用氨基胍(AG，10mM)處理陽性對照組。使用1xPBS洗滌樣品，使用Laemmli樣品緩沖液(目錄號161-0737,Bio-RadLaboratories,CA,USA)處理，在100℃下煮沸5分鐘，使用BCA(PierceBiotechnology,IL,USA)定量蛋白質，然后使用。蛋白在包含SDS的10％聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)中進行電泳(120V,2小時)后，使用轉移緩沖液(0.25MTris,1.92M甘氨酸,pH8.3-8.4)(250mA,1.5)將蛋白轉移到PVDF膜(Bio-RadLaboratories,CA,USA)。在使用5％脫脂牛奶封閉TBS-T(200mMTris,1.37MNaCl,0.05％Tween20)溶液后，在4℃下反應AGE抗體(抗-AGE單克隆Ab，克隆號6D12)。在洗滌后，使HRP-綴合的第二抗體反應，再次洗滌，然后使用增強的化學發光(ECL)反應，使用LAS-3000(Fujifilm,JPN)分析，然后使用GraphPadPrism5(SanDiego)進行統計學處理。因此，如圖3所示，證實了本發明的CJG30R濃度依賴性地(10μg/ml，20μg/ml)抑制晚期糖基化終產物產生，甚至在高血糖環境下的人視網膜色素上皮細胞中抑制晚期糖基化終產物產生(##P<0.01vsHG)(圖3)。實驗實施例4晚期糖基化終產物的交聯斷裂能力的確定證實了上述實施例1中制備的混合提取物(CJG30R，CJGT)對基質蛋白與晚期糖基化終產物的交聯的斷裂效應。使用的陽性對照組為ALT-711(AlteonInc.,Ramsey,NJ)。具體地，將1.0μgAGE-BSA(TransgenicInc.,Kobe,Japan)分配到膠原包被的96孔微量滴定板(GreinerBio-One,Germany)，并隨后在37℃下培養4小時以交聯AGE-BSA和膠原。在通過洗滌0.05％PBST三次去除未結合的AGE-BSA后，向其添加混合提取物和ALT-711并在37℃下培養4小時。然后，用0.05％PBST洗滌所得物，并檢測與膠原交聯的剩余的AGE-BSA，將小鼠單克隆抗-AGE-BSA抗體(6D12,TransgenicInc.,Kobe,Japan)以1:250稀釋，分配，然后在37℃下培養1小時。1小時后，使用0.05％PBST洗滌所得物，并使HRP-連接的山羊抗小鼠IgG抗體(SantaCruz,USA)反應以使用基質染色TΜΒ(3,3',5,5-四甲基聯苯胺)，然后在450nm下測量吸光度。AGE-BSA的交聯的斷裂效應(％)如以下等式2計算。等式2因此，如表2所示，證實了與陽性對照組的ALT-711相比，芍藥根和甘草的熱水提取物的晚期糖基化終產物的交聯斷裂能力優異2198倍，芍藥根和甘草的30％、50％和70％乙醇提取物的作用分別為53.5倍、66.8倍和72.9倍，并且與陽性對照組的ALT-711相比，芍藥根提取物的作用也是16891倍(表3)。表3總之，證實了本發明的材料抑制晚期糖基化終產物的產生，抑制包被有糖醛的ECM中的晚期糖基化終產物的產生，還使基質蛋白與已經產生的晚期糖基化終產物的交聯斷裂，并顯著抑制在高血糖環境下在人視網膜色素上皮細胞系中晚期糖基化終產物的產生。實驗實施例5在動物模型中由血-視網膜屏障的破壞引起的視網膜水腫的抑制作用的確定5-1實驗動物育種和實驗設計作為實驗動物，出生后使7周齡雄性SD大鼠適應環境并使用。自由進食飼料和飲用水。為了誘導血-視網膜屏障破壞，將大鼠VEGF蛋白(血管內皮生長因子，R&Dresearch,USA)給予左眼，并將對照組或本發明的CJGT注射到右眼中。在給藥后24小時麻醉大鼠，并將50mg/ml熒光素-葡聚糖注射到左心室中。10分鐘后，摘出眼睛并分離視網膜。將分離的視網膜使用水性封固劑封固，然后觀察并分析。為了定量分析，在將50mg/ml熒光素-葡聚糖注射到左心室之后抽血，在以60ml/min的速率除去血管中剩余的熒光素-葡聚糖后摘出眼睛并分離視網膜。測量分離的視網膜的重量并在離心后使用ELISA酶標儀測量上清液的熒光。5-2實驗結果如圖4所示，證實了在正常組中沒有觀察到熒光的滲漏現象，但在VEFG給藥組的所有個體中，熒光材料由于血-視網膜屏障破壞而顯著(P<0.05)流出血管(血-視網膜屏障破壞越多，看起來就越亮)。然而，在給予100μg/ml的上述實施例1制備的CJGT的組中，由于血-視網膜屏障破壞的抑制而產生的血管性水腫的作用通過顯著(P<0.05)抑制VEFG引起的熒光材料從血管的滲漏現象得到證實(圖4)。實驗實施例6MNU-誘導的年齡相關性黃斑變性的預防性和治療性作用的確定6-1實驗動物育種和實驗設計在適應1周后使用6周齡雄性C57BL/6小鼠。為了誘導在黃斑變性中出現的視網膜組織的形態學變化中的感光細胞損傷和變性，將1％(0.05％乙酸)N-甲基-N-亞硝基脲(MNU,Sigma,USA)經腹膜內注射到7周齡雄性C57BL/6小鼠中(60mg/kg)。將相同量的0.05％乙酸經腹膜注射到正常組。將測試藥物懸浮并配混在0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)中，在MNU給藥之前一天以50mg/kg和100mg/kg的濃度口服給予一次，并在MNU給藥之后每天口服給予一次，持續7天。僅將相同量的0.5％CMC口服給予MNU-誘導組和正常組。在完成測試藥物的給予后，通過對小鼠進行尸體解剖來摘出眼，然后封固在10％中和福爾馬林中一天，并包埋在石蠟中，以制備載玻片切片。使用蘇木精&曙紅(H&E)對載玻片切片染色，并在光學顯微鏡下觀察。通過視網膜組織的外核層的厚度變化測量和評價感光細胞的損失和變性。6-2實驗結果如在圖5的視網膜切片圖中，證實了由感光細胞的核緊湊組成的外核層的厚度變薄，這是因為細胞數量由于MNU給藥引起的損傷降低。然而，證實了測試藥物CGJT-50和CGJT-100通過顯著抑制MNU對感光細胞的損傷來抑制(治療)黃斑變性的誘導(#p<0.05vsMNU：圖5)。實驗實施例7在NaIO3誘導的動物模型中的視網膜色素上皮細胞損傷的預防性作用7-1實驗動物育種和實驗設計在適應1周后使用6周齡雄性SD大鼠。為了誘導作為在黃斑變性中出現的視網膜組織的形態學變化之一的視網膜色素上皮細胞損傷和變性，將3.5％的NaIO3(Sigma,USA)注射到7周齡大鼠的舌下靜脈中(35mg/kg)。僅將相同量的生理鹽水給予正常組和NaIO3誘導組。將測試藥物(CJG30R、CJGT)懸浮并配混在0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)中，在NaIO3給藥之前一天以50mg/kg和100mg/kg的濃度口服給予一次，并在NaIO3給藥之后每天口服給予一次，持續7天。僅將相同量的0.5％CMC口服給予正常組和對照組。通過對大鼠進行尸體解剖來摘出眼，然后封固在10％中和福爾馬林中并包埋在石蠟中，以制備載玻片切片。使用蘇木精&曙紅(H&E)對載玻片切片染色，并在光學顯微鏡下觀察和評價視網膜組織的外核層的折疊數。7-2實驗結果色素上皮細胞由于NaIO3給予而損傷，使得目視觀察到恰好位于色素上皮細胞上方的由感光細胞的核緊湊組成的外核層彎曲的現象。然而，測試藥物CGJ30R-50、CGJ30R-100、CGJT-50和CGJT-100均抑制NaIO3誘導的色素上皮細胞的損傷，從而顯著抑制彎曲外核層的現象(圖6)。實驗實施例8在VLDLR9(極低密度脂蛋白受體)敲除小鼠中的黃斑變性的治療作用8-1實驗動物育種和實驗設計顯示作為濕性黃斑變性的臨床征兆的視網膜下新血管形成的模型動物Vldlr-/-小鼠購自Jacksonlaboratory，并育種以獲得2周齡幼齡小鼠，其用于實驗。作為正常動物，使用相同周齡的C57BL/6小鼠。將測試藥物(CGJ30R)懸浮并配混在0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)中，以100mg/kg的濃度每天口服給予一次，持續7天。僅將相同量的0.5％CMC口服給予正常組和對照組。8-2視網膜血管腫脹的測量在尸體解剖中，通過以3:2的比例混合Zoletil50(Virbac30mg/kg)和Rompun(BayerKorea,10mg/kg)并稀釋混合物10倍(鹽水)，然后腹膜內注射50μl來麻醉小鼠。切開腹部后，將5mg異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FD40S-lG,sigma)溶解在PBS中的100μl溶液注入心臟，并在5分鐘后摘出眼，其中將一只眼封固在10％中和福爾馬林中，用于制備視網膜組織切片，并且將另一只眼封固在4％多聚甲醛中10分鐘，從其中分離視網膜以制備平面封固的視網膜載玻片，在熒光顯微鏡下觀察(BX51,Olympus,Japan)。8-3染色和觀察在從尸體解剖摘出的眼組織中分離視網膜后，將結膜組織封固在4％多聚甲醛中3小時，使用PBS洗滌并在包含5％TritonX-100和1％BSA的PBS中攪拌3小時。再次對其進行洗滌后，將其在4℃下用以1mg/ml溶解在PBS中的凝集素(L2140,sigma)孵育，以1:50稀釋。在使用含0.05％Tween20的PBS洗滌2小時后，使其與鏈霉親和素TRITC反應，以在37℃下以1:500稀釋4小時，使用PBS洗滌30分鐘，并使用熒光顯微鏡觀察(BX51,Olympus,Japan)。8-4組織病理學評價將在尸體解剖時封固在10％中和福爾馬林中一天的眼包埋在石蠟中以制備載玻片切片。使用蘇木精&曙紅(H&E)對載玻片切片染色，并在光學顯微鏡下定量分析視網膜下位點的新血管形成病變。8-5實驗結果(1)Vldlr-/-小鼠中的視網膜血管損傷的抑制作用使用視網膜組織切片證實了抑制視網膜毛細血管損傷的現象，因此熒光材料大部分從Vldlr-/-小鼠的視網膜血管流出。然而，這樣的損傷視網膜血管的現象被CJG30R給藥顯著抑制(圖7)。(2)視網膜下新血管形成的抑制作用使用視網膜組織切片證實了黃斑變性中出現的視網膜下位點中的新血管形成現象，因此在Vldlr-/-小鼠中觀察到通過在外核層以下的視網膜下位點中產生新血管而向上彎曲視網膜組織的現象。然而，這樣的血管生成被CJG30R給藥顯著抑制(圖8)。(3)對視網膜色素上皮細胞損傷的抑制作用為了評價視網膜色素上皮細胞的完整性，評價細胞的形態學結構是否改變。使用ZO-1對正常小鼠的視網膜色素上皮細胞染色，并觀察為均勻排列的形式，而Vldlr-/-小鼠細胞被損傷并且新血管生長，使得觀察到許多改變的位點(箭頭)。然而，視網膜色素上皮細胞的變性被CJG30R的給予顯著抑制(圖9)。(4)對視網膜中的VEGF表達的抑制作用的確定使用上述的實驗實施例8-1的動物模型，以與上述實驗實施例8-4相同的方式制備載玻片切片。使用H&E對載玻片切片染色，并在光學顯微鏡下定量分析視網膜下位點的新血管形成病變。因此，如圖10所示，通過觀察作為參與新血管和血管的通透性的重要因子的VEGF在Vldlr-/-小鼠中重度表達(染成深紫色)，而通過給予本發明的CJG30R顯著抑制所述表達的事實，證實了本發明的CJG30FR顯示對視網膜中的VEGF表達的抑制作用(圖10)。實驗實施例9CJG30R對激光誘導的脈絡膜新生血管大鼠模型中的新血管形成的抑制作用9-1實驗動物育種和實驗設計通過腹膜內注射Zoletil50(Virbac30mg/kg)和Rompun(BayerKorea,10mg/kg)來麻醉7周齡雄性Long-Evans大鼠(SLCJapan,Tokyo,Japan)。然后，使用1％托吡卡胺滴眼液使瞳孔擴大，使用二極管激光器(波長：532nm，直徑：100μm，功率：150mW，持續時間：0.1sec)在視神經乳頭周圍的四個位置處形成光凝固點。通過形成特征氣泡證實了布魯赫膜的破壞。將從麻醉恢復的大鼠隨機分組以給藥。將測試藥物懸浮并配混在0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)中，以100mg/kg的濃度每天口服給予一次，持續10天。在對照組中僅口服給予相同量的0.5％CMC。9-2脈絡膜新生血管的評價10天后，在尸體解剖中，通過腹膜內注射比例為3:2的Zoletil50(Virbac30mg/kg)和Rompun(BayerKorea,10mg/kg)的混合溶液來麻醉大鼠。切開腹部后，將5mg異硫氰酸熒光素-葡聚糖(MW2x106,sigma)溶解在PBS中的100μl溶液注入心臟，并在10分鐘后摘出眼并封固在4％多聚甲醛中10分鐘，從其中分離視網膜，并將含有視網膜下位點的結膜組織制備成平面封固的載玻片，在熒光顯微鏡下觀察(BX51,Olympus,Japan)。使用ImageJ軟件(NIH,USA)分析新血管形成位點的尺寸。9-3對視網膜下新血管形成的抑制作用使用視網膜組織切片證實了在黃斑變性中出現的視網膜下位點中的新血管形成的現象，因此CJG30R顯示抑制新血管形成的傾向(圖11)。實驗實施例10CGJ30R和芍藥苷(PF)在MNU-誘導的年齡相關性黃斑變性模型中的預防和治療作用的比較實驗已經報導，由于芍藥苷(PF)在人視網膜色素上皮細胞系(ARPE-19)中對由于H2O2和氧化應激引起的細胞死亡具有抑制作用，因此其在眼部疾病如黃斑變性中將是有效的(MolecularVision2011；17：3512-3522)。然而，未證實其在動物模型中是否具有黃斑變性的預防和治療作用，但僅在視網膜色素上皮細胞系中，僅在添加作為毒性物質的H2O2而不是作為黃斑變性的一般原因的老化條件后證實抗氧化作用和細胞死亡抑制，因此未在動物模型中證實其是否確實對黃斑變性有作用。因此，雖然在本發明人發明的材料中包含芍藥苷，但是為了證實本發明的材料不僅僅具有芍藥苷的單一作用的事實，對芍藥苷(PF-6.5)進行了實驗，其具有包含在如下的100mg的CJG30R和CJG30R(100mg)的含量。10-1實驗動物育種和實驗設計在適應1周后使用6周齡雄性C57BL/6小鼠。為了誘導在黃斑變性中出現的視網膜組織的形態學變化中的感光細胞損傷和變性，將1％(0.05％乙酸)N-甲基-N-亞硝基脲(MNU,Sigma,USA)經腹膜內注射到7周齡雄性C57BL/6小鼠中(60mg/kg)。將相同量的0.05％乙酸經腹膜給予正常組。將作為測試藥物的CGJ30R(100mg/kg)和PF-6.6(6.5mg/kg)懸浮并配混在0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)中，在MNU給藥之前一天口服給予，并在MNU給藥之后每天口服給予一次，持續7天。將相同量的0.5％CMC口服給予正常組和MNU-誘導組。10-2組織病理學評價在完成測試藥物的給予后，通過對小鼠進行尸體解剖來摘出眼，然后封固在10％中和福爾馬林中一天，并包埋在石蠟中，以制備載玻片切片。使用蘇木精&曙紅(H&E)對載玻片切片染色，并在光學顯微鏡下觀察。通過視網膜組織的外核層的厚度變化測量和評價感光細胞的損失和變性。10-3實驗結果與MNU給藥組相比，證實了CGJ30R給藥組的顯著作用，但具有包含在100mgCGJ30R中的芍藥苷的含量的給藥組(PF-6.5)根本沒有作用(表4和圖12)。也就是說，如圖11的視網膜切片圖那樣，在視網膜中的由感光細胞的核緊湊組成的外核層的損傷程度中，MNU給藥組惡化了幾乎50％或更多(1.99±0.21->0.92±0.17AU：*p<0.05vsNOR)。但在CJG30R給藥組中，作用與MNU給藥組相比提高了35％(0.92±0.17AU->1.19±0.29AU：#p<0.05vsMNU)，但是本身是單一化合物的芍藥苷(PF-6.5)根本沒有作用(參見表4和圖11)。表4CGJ30R對MNU-誘導的動物模型中的外核層(ONL)損傷的抑制作用組ONL厚度(AU)ONL厚度(％)NOR1.99±0.21100.00±27.72MNU0.92±0.17*0.00±25.55*CJG30R1.19±0.29#35.27±14.86#PF-6.50.96±0.173.52±16.11(*p<0.05vsNOR；#p<0.05vsMNU)雖然CJG30R和CJGT分別包含含量為6.5％和6.1％的芍藥苷(PF)，但是證實CJG30R和CJGT的作用不僅是由于芍藥苷的單一化合物，而是由于存在于CJG30R和CJGT中的許多單一成分的協同作用。工業適用性本發明不僅在藥學上可用作有效預防和治療血管性水腫的天然提取物組合物，而且還有效地用作健康功能食品。當前第1頁1 2 3