一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，具體涉及一種抗氧化效果顯著的羅非魚魚皮抗氧化活性肽的制備方法，屬于食品加工技術領域。
【背景技術】
[0002]現有研究表明，魚皮的蛋白質含量比魚體的其他部位高，且魚皮中膠原含量最高可占其蛋白質總量的80%以上。尤其是羅非魚皮，其蛋白質含量達23%，僅次于草魚皮(29.80%)，約占其干重的88.5%ο所以羅非魚皮是一種很好的膠原蛋白原料。而從前人的研究情況看，膠原蛋白酶解產物中至少包括了抗菌肽、ACE抑制肽、抗氧化肽等。這些特性使膠原蛋白及其水解產物在醫療、保健及美容方面具有良好的應用前景，同時也為從羅非魚皮魚皮膠原蛋白酶解液中制備抗氧化肽奠定了基礎。針對此現象，中國專利CN101225104開發了羅非魚魚皮小分子肽螯合鋅鹽的制備方法，但沒有涉及到抗氧化活性肽的制備方法，更沒有涉及到發酵法制備羅非魚魚皮抗氧化活性肽的方法。因此，目前發酵法制備羅非魚魚皮抗氧化活性肽的研究是一個新的領域。
[0003]微生物發酵法是以底物蛋白作為發酵培養基的組成成分之一，選擇優良的發酵菌種，利用微生物在生長過程中產生的蛋白酶水解底物蛋白制備生物活性肽。微生物發酵法制備生物活性肽具有有機溶劑使用量少、高效等特點。
[0004]本專利選擇羅非魚魚皮為原料，針對目前羅非魚加工業中加工利用率低，產品形式單一，精深加工及研究少等現狀，運用生物發酵技術制備具有抗氧化活性的多肽。不僅能夠回收利用魚皮中的膠原蛋白，擴大膠原蛋白和抗氧化肽的資源，拓寬膠原蛋白的應用范圍，實現羅非魚皮等加工下腳料的潔凈(環保型)利用，豐富產品結構，提高我國水產養殖業的可持續發展能力，增強在國際市場的競爭力，縮短與發達國家在海洋生物資源綜合利用技術和理論上的差距有重大意義；同時還能填補發酵法制備羅非魚皮抗氧化肽的相關空白，為抗氧化類產品的研發和作為功能性食品、藥品及化妝品輔料和功能因子積累有效的參考數據，具有重大的經濟價值和良好的社會效益。

【發明內容】

[0005]本發明針對現有技術存在的不足，提供一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，能充分滿足市場上對抗氧化活性肽的需求，最大限度的為人類提供健康的食品原料，并在此基礎上實現羅非魚加工下腳料一魚皮的高值化利用。
[0006]為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案是:
一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，包括如下步驟:
(1)預處理:清洗后的羅非魚魚皮經脫脂后，依次用0.1-0.13mol/L的鹽酸溶液和0.l-ο.12mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡1_2小時； (2)水提:預處理后的魚皮經洗滌至中性后，在45-50°C條件下，用1-2倍體積的蒸餾水恒溫勻漿8-10小時后，抽濾提取上清液；
(3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
(4)枯草芽孢桿菌發酵:種子液添加量為1_8%，在溫度為33-37°C，pH為6_8條件下發酵20-50小時；
(5)離心超濾:將上述發酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進行處理，得到超濾液；
(6)冷凍干燥:將超濾液于-40?_50°C，真空度0~20Pa下進行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽產品。
[0007]本發明的顯著優點是:
(1)通過生物發酵法制備羅非魚魚皮抗氧化活性肽；
(2)本發明制備的羅非魚魚皮抗氧化活性肽抗氧化效果顯著，其DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.01 mg/mL和1.12mg/mL，是一種極具潛力的生物活性肽原料；
(3)生物活性肽由于其安全、易吸收、成本低等特點，具有良好的市場前景。本發明采用酶法水解米渣蛋白制備抗氧化活性肽，不僅原料成本低廉，而且所得到的活性肽具有氨基酸組成合理、低過敏性、安全可靠等特點，特別是具有較強的抗氧化性，是極具潛力的一種功能性食品基料；
(4)本發明是以羅非魚加工下腳料一魚皮為原料，提供一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，大大提高了羅非魚下腳料的附加值，且生產成本低，工藝簡便，綠色環保，實現了羅非魚下腳料的高值化利用，具有很好的應用價值。
【具體實施方式】
[0008]下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，并不限制本發明的范圍。
[0009]實施例1
一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，包括如下步驟:
(1)預處理:清洗后的羅非魚魚皮經脫脂后，依次用0.lmol/L的鹽酸溶液和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡2小時；
(2)水提:預處理后的魚皮經洗滌至中性后，在45°C條件下，用1倍體積的蒸餾水恒溫勻漿10小時后，抽濾提取上清液；
(3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
(4)枯草芽孢桿菌發酵:種子液添加量為1%，在溫度為33°C，pH為6條件下發酵20小時；
(5)離心超濾:將上述發酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進行處理，得到超濾液；
(6)冷凍干燥:將超濾液于_40°C，真空度10Pa下進行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽
τ?: 口廣PR ο
[0010]實施例2
一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，包括如下步驟: (1)預處理:清洗后的羅非魚魚皮經脫脂后，依次用0.13mol/L的鹽酸溶液和0.12mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡2小時；
(2)水提:預處理后的魚皮經洗滌至中性后，在50°C條件下，用2倍體積的蒸餾水恒溫勻漿10小時后，抽濾提取上清液；
(3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
(4)枯草芽孢桿菌發酵:種子液添加量為8%，在溫度為37°C，pH為8條件下發酵50小時；
(5)離心超濾:將上述發酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進行處理，得到超濾液；
(6)冷凍干燥:將超濾液于_50°C，真空度20Pa下進行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽
τ?: 口廣PR ο
[0011]實施例3
稱取900.8g沖洗干凈的羅非魚魚皮，脫脂處理后依次用700ml的0.llmol/L的鹽酸溶液和0.llmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡2小時，蒸餾水洗滌至中性后，在48°C條件下，用1500ml的蒸餾水恒溫勻漿10小時，抽濾提取得到上清液；
滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
枯草芽孢桿菌發酵:種子液添加量為5%，在溫度為36°C，pH為7條件下發酵30小時；離心超濾:將上述發酵液于5000 r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進行處理，得到超濾液；
冷凍干燥:將超濾液于_45°C，真空度10Pa下進行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽產品Ο
[0012]DPPH自由基清除活性的測定:清除穩定的DPPH自由基的能力已被廣泛用來測試各種抗氧化物的抗氧化能力。不同濃度的羅非魚魚皮發酵產物的DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增長。經計算，當發酵產物的濃度達到7.5mg/mL時其DPPH自由基清除率可達99.91%，表現出與Vc相似的自由基清除能力。
[0013]用IC50值(清除率為50%時的抗氧化劑濃度)來評估清除能力，IC50值越低表示自由基清除能力越高。羅非魚魚皮發酵產物的IC50值為1.01mg/mL。
[0014]羥自由基清除活性測定:細胞中發生的許多生化反應均與羥自由基有關，它可導致DNA斷裂、突變、脂質氧化、蛋白質變性等多種病理性變化，羥自由基是已知的最強氧化劑。羅非魚魚皮發酵產物的羥自由基清除能力隨著發酵產物濃度的增加而增加。經計算當發酵產物濃度為8.6 mg/mL時米渣蛋白發酵產物的羥自由基清除率為99.78%，表現出與Vc相似的自由基清除能力。羅非魚魚皮產物的IC50值為1.12 mg/mL。
【主權項】
1.一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)預處理:清洗后的羅非魚魚皮經脫脂后，依次用0.1-0.13mol/L的鹽酸溶液和.0.1-0.12mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡1_2小時； (2)水提:預處理后的魚皮經洗滌至中性后，在45-50°C條件下，用1-2倍體積的蒸餾水恒溫勻漿8-10小時后，抽濾提取上清液； (3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用； (4)枯草芽孢桿菌發酵:種子液添加量為1_8%，在溫度為33-37°C，pH為6_8條件下發酵20-50小時； (5)離心超濾:將上述發酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進行處理，得到超濾液； (6)冷凍干燥:將超濾液于-40?_50°C，真空度0~20Pa下進行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽產品。
【專利摘要】本發明涉及一種利用枯草芽孢桿菌發酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，屬于食品加工技術領域；以羅非魚魚皮為原料，經預處理、提取后，以枯草芽孢桿菌為發酵菌株對羅非魚魚皮進行發酵、而后經離心、超濾、冷凍干燥得到羅非魚魚皮抗氧化活性肽；其發酵條件為：以枯草芽孢桿菌為發酵菌株，種子液添加量為1-8%，在溫度為33-37℃，pH為6-8條件下發酵20-50小時；本發明制備的羅非魚魚皮抗氧化活性肽抗氧化效果顯著，其DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.01mg/mL和1.12mg/mL，是一種極具潛力的生物活性肽原料。
【IPC分類】C12P21/02
【公開號】CN105255974
【申請號】CN201510776301
【發明人】潘發全
【申請人】潘發全
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月13日