用Nutlin-3a和肽抑制肺纖維化的制作方法
【專利說明】用NutIin-3a和化抑制肺纖維化
[000。 發明背景 發明領域
[0002] 本發明在生物化學和醫學領域設及用于增加纖維化肺（FL)成纖維細胞中的p53 蛋白水平、減少uPA和uPARW及增加PAI-1表達和減少其增殖、和用于使用nutlin-3a和 膚治療特發性肺纖維化（IP巧的方法和組合物。
【背景技術】 [0003] 說明
[0004] 特發性肺纖維化（IP巧是了解甚少的進行性和致命性肺病，除肺移植之外尚不 存在針對所述疾病的治療方法（MasonDP等，AnnThoracSurg84:1121-8,2007)。在 診斷之后五年的中值存活率小于20%。大多數形式的間質性肺病和其它形式的肺纖維化 特征在于纖維化病變，發生肺泡結構的進行性變形且被具有過量細胞外基質巧CM)沉積 的纖維化或癒痕組織置換（AmericanThoracicSociety,AmJRespirGritCareMed 161:646-664, 2000;NoblePW等，ClinChestMed25:749-758, 2004;SelmanM等，Ann InternMed134:136-151,2001)。運導致進行性呼吸困難和肺功能損失。標志形態學病 變是與已完全形成的纖維化的區域直接相鄰的正常肺的空間和時間異質性并入區域、微觀 蜂窩現象、W及進化含有活躍增殖和產生膠原的成纖維細胞/成肌纖維細胞的纖維化區域 (所謂的"纖維化"病灶）。
[0005]IPF是病因不明的最常見的慢性、進行性和致命性間質性肺病，在美國，估計發病 率為100, 000名個體中有40-50例。增加的纖維化肺Γ卞L")成纖維細胞（或成肌纖維細 胞））存活力、活化、產生和ECM沉積是IPF肺的典型特征（SelmanΜ等，Expert化in血erg Drugs16:341-62,2011 ;Shetty，S等.AmJRespirCellMolBiol15:78-87，1996;Zhu S等，AmJF*hysiol:LungCellMolPhysiol297:L97-108, 2009;SuganumaH等，Thorax 50:984-9, 1995 ;Ame;ricanThoracicSociety,同上；NoblePW等，同上）。
[0006] 本發明人（及其它）的先前工作顯示肺成纖維細胞（包括來自IPF患者的肺 的化成纖維細胞）表達尿激酶型纖溶酶原活化劑（uPA)、uPA受體（uPAR)和纖溶酶原 活化劑抑制劑-l(PAI-l)(Shetty等，1996,同上；ShettyS和IdellS.AmJPhysiol 274:L871-L882, 1998;ChangW等，JBiolChem285:8196-206,2010)。uPA對于正常肺 (化）和化成纖維細胞來說是促有絲分裂的，并且所述過程設及通過uPA生長因子結構域 結合uPAR的uPAakaclmkV等.ClinExpI^armacolPhysiol23:759-65, 1996;化化0T 等，JCellSci115:1961-71,2002;ShettyS等，AmJPhysiol268:L972-L982, 1995; 化ettyS等，AntisenseResDev5:307-314, 1995)。此外，uPA增強uPAR表達（Shetty S等，JBiolChem276:24549-56,2001;ShettyS等，AmJRespirCellMolBiol 30:69-75,2004)。幾年之前，本發明人報道，來自IPF肺的化成纖維細胞顯著表達更多 的uPA和uPAR，并且顯示比化成纖維細胞更高的基礎和uPA介導的增殖速率（Shetty 等，1996,同上；1998,同上）。其它組證實來自具有IPF的患者的由化成纖維細胞進行 的增加的uPAR表達促成遷移行為（MaceKA等，JCellSci118:2567-77,2005;BasireA 等，.Τ'虹ombHaemost95:678-88, 2006 ;Zhu,S.等，2009,同上
[0007] 本發明人和同事的研究發現uPA通過調控p53來調控上皮細胞調亡/存活 (化ettyS等，2005,同上），p53在轉錄后水平下控制uPA(ShettyP等，AmJRespCell MolBiol, 39:364-72, 2008)、其受體uPARGhettyS等MolCellBiol27:5607-18,2007) 和其主要抑制劑PAI-l(aiettyS等JBiol.Chem283:19570-80,2008)的相互表達，并且 設及uPA、uPAR、小窩蛋白-1( "Cav-1")與（β1-整聯蛋白）之間的新穎細胞表面信號傳 導互相作用（ShettyS等，2005,同上）。基于上文的了解，本發明人設想用于治療ALI及 其隨之發生的重塑反應的新型組合物和方法。
[0008] 在肺纖維化（所述術語可與"肺（pulmonary)纖維化"互換使用）期間，轉錄因 子p53(已知主要作為腫瘤抑制蛋白）的表達在纖維化成纖維細胞中嚴重受抑制，其進而在 PAI-1表達顯著受抑制時誘導uPA和uPAR的表達。由于p53表達纖維化成纖維細胞的抑制 造成的PAI-1表達的遏制W及uPA和uPAR表達的同時誘導引起成纖維細胞增殖和ECM沉 積，即，纖維化。與p53的增加的m血2相互作用和隨后的111血2-介導的p53的泛素化促成 纖維化成纖維細胞中的p53的抑制。
[000引 p53與NF-KB的活性之間的相互關系已在癌細胞證明，但幾乎不存在關于炎癥過 程中p53與NF-Kβ之間的相互作用的信息。LiuG等（JImmunol. 182:5063-71(2009))發 現缺乏p53(p53</>)的中性粒細胞和巨隧細胞對于用細菌脂多糖（LP巧刺激具有比ρ53^4 細胞更大的反應，并且它們產生更大量的促炎細胞因子（包括TNF-α、IL-6W及ΜΙΡ-2)， 并且展示增強的NF-kBDNA結合活性。ρ53</Μ、鼠比Ρ53 小鼠對LI^誘導的急性肺 損傷（ALI)更敏感。p53< / >細胞對LPS的增強的反應不設及與toll樣受體的接合即化R4 接合（例如，MAP激酶的活化、IKB-α或NF-KB的p65亞基的憐酸化或IKB-α的降解） 相關的細胞內信號傳導事件的改變。用nutlin-3a培養LI^刺激的中性粒細胞和巨隧細胞 使NF-KBDNA結合活性和促炎細胞因子的產生減弱。用nutlin-3a處理小鼠降低LPS誘 導的ALI的嚴重性。作者得出結論p53調控炎性細胞中的NF-KB活性并且表明調節p53 可在急性炎性病狀如ALI中具有潛在治療益處。 陽010]伽11111(或伽11111-3曰)(縮寫NTL)
[00川有機分子4-2-4, 5-二氨-1H-咪挫-1-贓嗦-2-酬佑化。CI2N4O4)(還被稱為nutlin或nutlin-3a)的化學結構在下文示出 [0012]
[001引 NTL是MDM2的括抗劑，其是p53活化劑和細胞調亡誘導劑。MDM2通過結合p53腫瘤 抑制蛋白起作用并且負調控其轉錄活性和穩定性。MDM-P53相互作用的抑制導致p53的穩 定、細胞周期停滯和細胞調亡。Nutlin-3已經顯示通過活化癌細胞中的p53途徑作為腫瘤 治療的潛力。燈0var，C.等，化OC化tlAcadSciUSA103:1888-1893(2006);化ssilev,L. T.等.Science303844-848(2004) ;E1-Dei巧，W.S.CancerJ11:229-236(1998))。
[0014] 美國專利7, 893, 278化al巧等）一般地和具體地公開了手性nutlin-3。美國專利 6, 734, 302描述外消旋nutlin-3。'278專利教導一種下式的化合物
[0015]
[0016]W上專利兩者均討論作為Μ血2-P53相互作用的抑制劑和在癌癥治療中的用途。
[0017] 美國專利公布2011/0301142化utchinson等）教導一種治療哺乳動物的特發性肺 纖維化的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的LPA1受體括抗劑。括抗劑 可W是某些咪挫衍生物但不是咪挫嘟型化合物如NTL。
[0018] 美國專利6, 596, 744 (Wagle等）公開一種用雜環化合物治療或改善某些纖維化疾 病的方法，所述化合物都明顯不同于NTL。所公開的疾病包括具有肺組織的纖維化肥大或纖 維化作為表現形式的纖維化肺病。運些疾病包括肺纖維化（或間質性肺病或間質性肺纖維 化）、特發性肺纖維化、塵肺病的纖維化要素、肺結節病、纖維化肺泡炎、囊性纖維化的纖維 化或肥大要素、慢性阻塞性性肺病、成人呼吸窘迫綜合征和肺氣腫。
[0019]D巧等在Cell切cle 6:2178-85(2007)中描述nutlin被鑒別為抑制P53-MDM2相 互作用的第一有效且特異性的小分子Mdm2括抗劑。
[0020] 前述文獻中沒有一個公開用nutlin-3a治療IPF。
[00引]小窩帝白-1祈牛化
[002引本發明人發現為小窩蛋白-l(Cav-l;SEQIDN0:3,W下所示）的支架結構域的 20個殘基的膚DGIWKASFTTFTVTKYWFYR(SEQIDN0:2)在體外和體內保護肺上皮細胞（LEC) 免于博來霉素（"BLM")誘導的細胞調亡并且通過減弱肺上皮損傷來預防隨后的肺纖維化 (aietty等，經獲準美國專利申請12/398, 757,其公布為U.S. A1 (2009年9 月10日），其特此W引用的方式整體并入。本發明人還發現被稱為PP-2的17個殘基的膚 NYHYLESSMTALYTLGH(SEQIDN0:4)，其也在體外和體內保護LEC免于BLM-誘導的細胞調亡 并且通過減弱肺上皮損傷來預防隨后的肺纖維化。
[0023] 化etty等，2009(同上）也描述運些膚W及膚多聚體和包含W上膚的可遞送多膚 的生物活性取代、添加和缺失變體，W及包含前述膚、變體和多聚體的藥物組合物。那些組 合物抑制受損的或損傷的肺上皮細胞的細胞調亡并且治療急性肺損傷和隨之發生的肺纖 維化/1PF。
[0024] 前述文獻未鑒別被稱為CSP-4的CSP的特定片段（下文公開為本發明的一部分）， 所述片段具有序列FTTFTVT(SEQIDN0:1)并且具有CSP的生物活性且構成本發明的主題 的一部分。
[00巧]鑒于IPF的不良預后和治療方法的缺乏，迫切需要用于逆轉或至少減緩疾病進展 的新的干預。此關鍵治療空白由本發明解決。
[0026] 本發明構成本發明人的早期發現僅化etty等，2007, 2008和2009,同上）并且 是本發明人的早期發現的延伸。如W下部分中所描述，p53調控uPA、uPAR和PAI-1的表 達。所述過程設及在翻譯后水平下p53蛋白表達的MDM2介導的控制而不會影響p53mRNA。 運些觀察結果證明p53的表達與纖維化修復中的uPA-纖溶系統之間的因果關系。
[0027] 發明概述
[0028] 使用NTL抑制p53蛋白與MDM2的相互作用增強p53和PAI-1，同時抑制uPA和 uPAR。運些變化導致纖維化成纖維細胞的細胞調亡和自具有IPF的患者的肺W及自具有 BLM誘導的加速的肺纖維化的小鼠的肺分離的纖維化成纖維細胞的增殖抑制。
[0029] 根據本發明，NTL通過在纖維化成纖維細胞中誘導或增強p53表達來抑制進行性 和已形成的肺纖維化。因此，所述化合物適用于治療有需要的受試者中的肺纖維化。
[0030] 本發明人設想化成纖維細胞中的uPA-纖溶系統的破壞的p53介導的控制是IPF 的祀向療法的基礎。在化成纖維細胞中，當ECM蛋白如膠原-I(Co^I)和α平滑肌肌動 蛋白（a-SMA)的水平增加時，ρ53的基線表達和微小RNA-34a(miR-34a)被顯著抑制。用 111血2抑制化合物nutlin-3a或CSP-4處理化成纖維細胞在uPA和uPAR的相互抑制情況 下增強p53和PAI-1表達。用nutlin-3a或CSP-4處理化成纖維細胞還抑制ECM的產生。 本發明人和同事的運些初步發現和最近公開證實用于恢復p53與uPA-纖溶系統之間的相 互作用（cross-talk)的干預方法，所述系統否則在化成纖維細胞中扭曲，從而導致肺纖維 化。p53具有超出uPA-纖溶系統的控制的多效性作用2。然而，PAI-1是成纖維細胞和其它 細胞中的p53的下游效應子。
[003。重要地，化成纖維細胞中的p53的恢復調節uPA、uPAR和PAI-1的表達、細胞存活 力和ECM的產生。化成纖維細胞中的p53-uPA纖溶系統祀向方法在圖1中示出。p53誘導miR-34a轉錄，而miR-34a通過抑制組蛋白去乙酷化酶sbtuinl(SIRTl)增強p53的乙酷 化。運導致由于抑制由mdm2介導的其降解所致的p53蛋白的穩定。然而，在化成纖維細 胞中，p53蛋白和miR-34a的基礎水平被顯著抑制，運是由于作為小窩蛋白-1的較低基線 表達的結果p53蛋白通過m血2的增加的泛素化所致。運導致uPA和uPAR的減少的p53介 導的抑制，或PAI-1的同時誘導。運些變化促成過量化成纖維細胞增殖和ECM的產生并且 通過CSP-4和nutlin-3a逆轉。CSP-4和nutlin-3a通過抑制p53蛋白的m血2介導的降解 來增加p53水平。化成纖維細胞中p53表達的恢復和uPA-纖溶系統中的p53介導的變化 導致存活力的衰減，并且限制ECM的產生和沉積。纖維化在具有已形成的肺纖維化的BLM 激發的小鼠中通過化成纖維細胞中的p53水平的恢復得W抑制，運進而抑制增殖信號uPA 和uPAR，同時誘導運些細胞的促細胞調亡信號；PAI-1。
[0032] 本發明人首次表明，uPA-纖溶系統的p53介導的變化調控對肺纖維化的發病機 制重要的肺成纖維細胞的促纖維化反應，并且此途徑可被祀向治療益處。與來自組織學上 "正常的"肺的化-成纖維細胞不同，來自纖維化肺組織的化成纖維細胞（包括成纖維細胞 /成肌纖維細胞）在uPA和uPAR表達較高時表達極低水平的基線p53、miR-34a和小窩蛋 白-1。用CSP-4或低分子量化合物nutlin-3a處理化成纖維細胞恢復p53和miR-34a表 達，并且誘導PAI-1。運些變化遏制uPA和uPAR表達并且抑制ECM沉積。運些藥劑還逆轉 BLM誘導的肺纖維化并且保護肺上皮，其同樣證明p53與纖溶系統的調控之間的相互作用。 因此，CSP-4介導的或nutlin-3a介導的肺纖維化減輕代表新穎的治療方法。
[0033]當前不存在有效治療來逆轉肺纖維化。本發明解決此重要空白并且提供用于祀向 化成纖維細胞和p53與uPA-纖溶系統之間的相互作用W有效地治療纖維化肺病的新穎化 合物和方法。
[0034] 本發明還設及物質組合物。在一個實施方案中，所述組合物是增加化成纖維細胞 中的p53蛋白水平、減少uPA并且增加PAI-1表達的膚化合物，所述膚化合物優選地選自由 W下組成的組：
[003引（a)指定為CSP-4 的膚，其序列是FTTFTVT(SEQIDNO: 1);
[0036] (b)最多約20個氨基酸長度的CSP-4膚的添加變體，并且其不是具有序列SEQID N0:3的小窩蛋白-iKav-l)的支架結構域（CSP);
[0037] (C) (a)的CSP-4膚的經共價修飾的化學衍生物，
[0038] (d)化）的變體的經共價修飾的化學衍生物，
[0039] 所述變體或化學衍生物在體外或體內測定中具有至少20%的CSP-4膚的生物或 生物化學活性。W上或W下所述的膚變體、化學衍生物或多聚體優選地相對于CSP-4的活 性具有W下活性：至少約 20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 約95%、97%、99%W及其中可推論出的任何范圍，例如像約70%至約80%，并且更優選約 81%至約90% ;或甚至更優選，約91%至約99%。所述膚變體化學衍生物或多聚體可具有 100%或大于100%的CSP-4的活性。運種相對活性可W是基于本文所公開的或本領域中已 知用于評價運種活性的任何方法。
[0040] 優選的化合物是被指定為CSP-4的屯膚，FTTFTVT(SEQIDNO: 1)。
[0041] 優選的膚多聚體包含至少兩個單體，每個單體是CSP-4膚、所述變體或所述化學 衍生物，所述多聚體：
[0042] (a)具有式pi。，其中
[0043] (i)pi是如上的膚、變體或化學衍生物，W及
[0044] (ii)n =2-5,或
[004引化）具有式（pi-Xm)"-p2,其中
[004引（i)P郝P2各自獨立地是如上的膚、變體或化學衍生物，
[0047] m)P郝P2各自是相同或不同的膚、變體或衍生物
[004引（iii)X是Ci-Cs烷基、Ci-Cs締基、Ci-Cs烘基、含有最多4個氧原子的Ci-Cs聚酸；
[0049] (：[￥)111 = 0或1;^及
[0050] (v)n = 1-7，
[005。（C)具有式（pi-Glyz)n-p2,其中：
[005引（i)P郝P2各自獨立地是所述膚、變體或衍生物，
[005引m)P郝P2各自是相同或不同的膚或變體或衍生物；
[0054](ii;〇Z= 0-6;W及[0(巧5] (iv)n = 1-25，
[0056] 其中所述膚多聚體優選地在體外或體內測定中具有至少20%的CSP-4膚的生物 活性。
[0057] 在另一個實施方案中，本發明設及一種可遞送的膚或多膚或膚多聚體組合物，所 述組合物包含：
[005引（a)W上膚、變體、衍生物、多膚或多聚體，化及
[0059] 化）與其結合或與其締合或混合的遞送或易位分子或部分。
[0060] 優選的易位分子或部分在下文進行描述。
[0061] 還提供一種抗纖維化藥物組合物，其包含：
[0062] (a)藥學上可接受的載體或賦形劑，W及，
[0063] 化）W上膚、膚變體、化學衍生物、多膚或膚多聚體作為活性成分，任選地與包含抑 制MDM2-P53相互作用的nutlin-3a(NTL)或NTL的手性順式-咪挫嘟類似物的藥物組合物 組合，所述NTL類似物在體外或體內測定中具有至少20%的NTL的生物或生物化學活性；
[0064] 最優選的是被配制用于注射或肺滴注的W上膚相關的藥物組合物，而經任選組