本(ben)發明(ming)涉(she)及(ji)生(sheng)物(wu)醫藥技術領域，特別是涉(she)及(ji)一種新(xin)生(sheng)血管生(sheng)成抑(yi)制(zhi)肽及(ji)其(qi)透(tou)明(ming)質酸修飾物(wu)的制(zhi)備方法與應用(yong)。

背景技術：

內皮(pi)抑素(endostatin，es)是一(yi)(yi)種(zhong)從血(xue)管(guan)內皮(pi)瘤(liu)中(zhong)分(fen)離(li)得(de)到(dao)的(de)(de)(de)20kda的(de)(de)(de)多(duo)肽(tai)，被確認為膠原蛋白xviii的(de)(de)(de)c端(duan)部分(fen)。內皮(pi)抑素能夠直接靶(ba)向腫瘤(liu)附近的(de)(de)(de)內皮(pi)細胞(bao)而不(bu)會對正(zheng)常細胞(bao)產生明(ming)顯毒性(xing)。它同樣(yang)能抑制內皮(pi)細胞(bao)增(zeng)生、遷移，引起細胞(bao)凋亡。其抗血(xue)管(guan)增(zeng)殖活性(xing)通過調節血(xue)管(guan)內皮(pi)生長因子vegf的(de)(de)(de)表(biao)達而實現。es-2(ivrradraavp)是es結構(gou)中(zhong)一(yi)(yi)個具有明(ming)顯抗新生血(xue)管(guan)生成、抗腫瘤(liu)活性(xing)的(de)(de)(de)短(duan)肽(tai)段，更容易進(jin)(jin)入細胞(bao)內部，且更容易獲得(de)和(he)改造，但是同es一(yi)(yi)樣(yang)，es-2也存在體內半衰期短(duan)和(he)穩定(ding)性(xing)差等缺(que)點，這些(xie)缺(que)點大大的(de)(de)(de)限制了es-2進(jin)(jin)一(yi)(yi)步(bu)的(de)(de)(de)應用。

anti-flt1肽(tai)(tai)(ggnqwfi)能(neng)夠特(te)異性地與(yu)vegfr1(fms-liketyrosinekinase-1orflt1)結合，從(cong)而起拮抗作(zuo)用阻止vegfr1與(yu)vegfa、vegfb、胎盤生長因子(zi)pigf等的(de)(de)(de)結合。與(yu)其(qi)他vegfr1的(de)(de)(de)單(dan)克隆(long)抗體或rna拮抗劑不同，anti-flt1肽(tai)(tai)是(shi)一種合成成本較(jiao)低(di)的(de)(de)(de)非免疫原(yuan)性的(de)(de)(de)短(duan)肽(tai)(tai)。但是(shi)與(yu)es-2等其(qi)他多(duo)肽(tai)(tai)相比，anti-flt1肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)水溶性較(jiao)差(cha)，這很(hen)大程度地影(ying)響了其(qi)作(zuo)用的(de)(de)(de)發揮。

綜上，現有的(de)多(duo)肽(tai)類(lei)新(xin)(xin)(xin)生血管抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑多(duo)存(cun)在體內半衰期短、穩定性差(cha)等(deng)問題，限制(zhi)(zhi)(zhi)了(le)多(duo)肽(tai)類(lei)藥物(wu)在制(zhi)(zhi)(zhi)備新(xin)(xin)(xin)生血管抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑中的(de)應用(yong)。因此，本領域迫(po)切(qie)需要(yao)開發(fa)一種新(xin)(xin)(xin)型的(de)多(duo)肽(tai)類(lei)新(xin)(xin)(xin)生血管抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑。

技術實現要素：

針對上述現有(you)技術的不足，本發(fa)明(ming)的目(mu)的在(zai)(zai)于提供一種(zhong)es-2-af肽(tai)，該es-2-af肽(tai)在(zai)(zai)活性、溶解性、穩定性和(he)半衰期(qi)等方面得到了改善，具有(you)明(ming)顯的抗新(xin)生血管生成作用。

本發明(ming)的另(ling)一目的在(zai)于提(ti)供(gong)一種(zhong)es-2-af肽的透明(ming)質酸化修飾物。

為實現上(shang)述目的，本(ben)發(fa)明(ming)采用如下技術方案：

本發明的(de)第一(yi)方面，提供一(yi)種es-2-af肽(tai)，其氨基酸(suan)序列如序列表中seqidno.1所(suo)示，具體(ti)如下：

es-2-af肽：ivrradraavpggggggnqwfi；(seqidno.1)。

本發明將anti-flt1肽(tai)與es-2肽(tai)融(rong)合在一起(qi)，所得到的es-2-af肽(tai)在活性(xing)(xing)、溶解性(xing)(xing)、穩定性(xing)(xing)和(he)半衰期(qi)等方面得到了很好的改善。

本發明(ming)的es-2-af肽經fmoc固相(xiang)合成，由高效液(ye)相(xiang)進(jin)行純(chun)化，并質譜、高效液(ye)相(xiang)色譜等手(shou)段進(jin)行了結構(gou)的確(que)證，純(chun)度均可達95％以(yi)上。

本發明(ming)的(de)第二方(fang)面，提供一(yi)種es-2-af肽的(de)透明(ming)質酸化修飾物，由es-2-af肽上的(de)氨基與透明(ming)質酸分子上的(de)羧基通過酰胺鍵(jian)結(jie)(jie)合(he)，結(jie)(jie)構式如(ru)下(xia)：

ha-co-nh-(es-2-af)n；

式(shi)中，n＝30～60；es-2-af的分子量為2197.5da，ha的分子量為240000da。

es-2-af的供給量(liang)(即上(shang)述(shu)結構(gou)式中n的取值)會(hui)影響與透明(ming)質(zhi)酸(ha)的結合(he)度(du)，本發明(ming)對(dui)es-2-af的供給量(liang)進行(xing)了優化考察，綜合(he)考慮(lv)了對(dui)ha空間構(gou)象的影響以及es-2-af與透明(ming)質(zhi)酸的結合(he)度(du)，優選(xuan)n＝60。

本發明的(de)第三(san)方面，提(ti)供上述es-2-af肽(tai)的(de)透明質酸(suan)化修飾(shi)物(wu)的(de)制(zhi)備方法。

本發(fa)明提供的es-2-af肽的透(tou)明質酸化修飾物(wu)的制備方(fang)法，步(bu)驟如下：

(1)制(zhi)備ha-tba結合(he)物，改善ha的溶解(jie)性，使ha能夠溶于有(you)機溶劑；

(2)將ha-tba結合物溶于(yu)有(you)機溶劑中，加入卡特縮合劑，以活化(hua)ha的(de)(de)羧基(ji)；然(ran)后將活化(hua)羧基(ji)后的(de)(de)ha-tba、es-2-af肽(tai)(tai)和n,n-二異丙基(ji)乙(yi)胺(an)(dipea)混合，反應(ying)24h后，加入naoh溶液；再(zai)調節反應(ying)體(ti)系(xi)(xi)的(de)(de)ph降(jiang)至(zhi)3.0以終止反應(ying)；然(ran)后將反應(ying)體(ti)系(xi)(xi)的(de)(de)ph再(zai)升至(zhi)7.0，反應(ying)產物經透(tou)析、干燥，即得(de)es-2-af肽(tai)(tai)的(de)(de)透(tou)明質酸化(hua)修飾(shi)物。

步驟(1)中，所(suo)述ha-tba結(jie)合物(wu)的制備(bei)方法為(wei)：向dowex離子交(jiao)換樹(shu)(shu)脂中加(jia)入(ru)過(guo)量的四丁基氫氧化銨(tba-oh)，混(hun)勻，得(de)到dowex-tba樹(shu)(shu)脂，過(guo)濾(lv)除去(qu)上清；將透明質酸鈉naha溶(rong)(rong)于水中，倒入(ru)制備(bei)的dowex-tba樹(shu)(shu)脂中，混(hun)勻，過(guo)濾(lv)除去(qu)dowex樹(shu)(shu)脂，得(de)到澄清的ha-tba溶(rong)(rong)液，凍(dong)干，即得(de)ha-tba結(jie)合物(wu)。

步驟(2)中(zhong)，所述有機(ji)溶劑為dmso。

步驟(2)中，ha-tba與es-2-af摩爾比為1:(4～100)。

步(bu)驟(2)中，所(suo)述naoh溶液的濃度為(wei)1m。

步驟(2)中(zhong)，采用1m的hcl調節ph降至(zhi)3.0；采用1mnaoh將ph升至(zhi)7.0。

步驟(2)中，反(fan)應產(chan)物透(tou)(tou)析(xi)的方法(fa)為：將(jiang)反(fan)應產(chan)物倒入預處(chu)理(li)的透(tou)(tou)析(xi)袋(10kda)，分別用(yong)nacl溶液、25％乙醇和水透(tou)(tou)析(xi)。

本發明通過(guo)(guo)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)ha-tba結合(he)物(wu)，改善(shan)了ha的(de)(de)(de)(de)(de)溶解性，使本不溶于有(you)機溶劑的(de)(de)(de)(de)(de)ha能(neng)夠(gou)溶于dmso。過(guo)(guo)量的(de)(de)(de)(de)(de)bop使ha的(de)(de)(de)(de)(de)羧基(ji)充分活化，使之與肽鏈的(de)(de)(de)(de)(de)氨基(ji)反(fan)應形成(cheng)酰(xian)胺(an)鍵。卡特縮合(he)劑是(shi)蛋白(bai)質、肽鏈反(fan)應中常用的(de)(de)(de)(de)(de)方法，但是(shi)反(fan)應溫度(du)、反(fan)應體(ti)系的(de)(de)(de)(de)(de)ph、反(fan)應時間等(deng)因素(su)都對反(fan)應效(xiao)率(lv)有(you)很大影響。本發明通過(guo)(guo)優化卡特縮合(he)劑的(de)(de)(de)(de)(de)供給(gei)量、反(fan)應溫度(du)、反(fan)應體(ti)系的(de)(de)(de)(de)(de)ph、反(fan)應時間等(deng)條(tiao)件，成(cheng)功制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)出(chu)半衰期(qi)增(zeng)長、活性更強的(de)(de)(de)(de)(de)透明質酸化es-2-af肽修(xiu)飾物(wu)。

本發明(ming)的(de)(de)第四方(fang)面，提供上述es-2-af肽和(he)/或es-2-af肽的(de)(de)透明(ming)質酸化(hua)修飾物在制備抑制新生血管生成的(de)(de)藥物中的(de)(de)用途。

進一(yi)步的，本(ben)發明還提供(gong)上述es-2-af肽和(he)/或(huo)(huo)es-2-af肽的透明質酸化修(xiu)飾物在制備伴隨(sui)新生(sheng)血管生(sheng)成(cheng)疾病的治療(liao)藥(yao)物和(he)/或(huo)(huo)抗(kang)腫瘤藥(yao)物中的用途。

所述伴隨(sui)新生(sheng)血管生(sheng)成疾病(bing)包括糖尿病(bing)視(shi)網(wang)膜病(bing)變、老年性黃斑病(bing)變和關節炎等。

本發明的有益效果：

(1)本發明通過調整es-2-af肽的供給量、反應(ying)溫度、反應(ying)體系(xi)的ph、反應(ying)時間等(deng)條件，可(ke)以制備得到不同結(jie)合度的透(tou)明質(zhi)酸－es-2-af肽結(jie)合物。

(2)本發明(ming)制備的(de)es-2-af肽與anti-flt1、es-2肽相比，其分子(zi)水平與細胞水平抗新生血管生成的(de)作用均優(you)于(yu)后兩者。

(3)本發明制(zhi)備的es-2-af肽透明質酸化修飾物與es-2-af肽相比(bi)，其穩定性更高、生物活性更強。

附圖說明

構(gou)(gou)成(cheng)本(ben)申請(qing)的一部分的說明書附圖(tu)用來提供對本(ben)申請(qing)的進一步理解，本(ben)申請(qing)的示意性(xing)實(shi)施(shi)例及其說明用于解釋本(ben)申請(qing)，并(bing)不構(gou)(gou)成(cheng)對本(ben)申請(qing)的不當限定。

圖1：es-2-af肽透明質酸化修飾物的核磁共振¹h圖譜；

圖2：anti-flt1、es-2、es-2-af對(dui)內皮細(xi)胞(bao)增殖的抑制作用；

圖3：anti-flt1、es-2、es-2-af可抑制vegf及其受體vegfr1(flt-1)結合；

圖4：es-2-af、ha&es-2-af、ha-es-2-af對內皮細胞增殖(zhi)抑制作用；

圖5：es-2-af、ha&es-2-af、ha-es-2-af可抑制(zhi)vegf及其受體vegfr1(flt-1)結合；

圖6：es-2-af、ha&es-2-af、ha-es-2-af內皮細胞轉(zhuan)移的抑制(zhi)作用。

具體實施方式

應該(gai)指出，以下詳細說明都是例(li)示性的，旨在對本(ben)(ben)申(shen)請(qing)提供進一步(bu)的說明。除非另有指明，本(ben)(ben)文使(shi)用的所(suo)有技術(shu)和科學術(shu)語具有與(yu)本(ben)(ben)申(shen)請(qing)所(suo)屬技術(shu)領域的普(pu)通(tong)技術(shu)人員通(tong)常理(li)解的相同含義。

需(xu)要注(zhu)意的(de)是(shi)，這里所使(shi)用的(de)術語(yu)僅是(shi)為(wei)了描述(shu)具體實(shi)施方式(shi)(shi)，而(er)非意圖(tu)限(xian)制(zhi)根據本(ben)(ben)申請的(de)示(shi)例性實(shi)施方式(shi)(shi)。如在(zai)這里所使(shi)用的(de)，除(chu)非上下文(wen)另外(wai)明確指出，否則單數形(xing)(xing)式(shi)(shi)也意圖(tu)包(bao)(bao)(bao)括(kuo)復數形(xing)(xing)式(shi)(shi)，此(ci)外(wai)，還應當理解的(de)是(shi)，當在(zai)本(ben)(ben)說明書中使(shi)用術語(yu)“包(bao)(bao)(bao)含”和/或(huo)“包(bao)(bao)(bao)括(kuo)”時，其指明存在(zai)特征、步驟、操作(zuo)、器件、組件和/或(huo)它們的(de)組合(he)。

正如背景(jing)技術所介紹(shao)的(de)，現(xian)有的(de)多肽類(lei)新生血管抑(yi)制劑多存在體內半衰(shuai)期短(duan)、穩定(ding)性(xing)差(cha)和水溶性(xing)差(cha)等問題(ti)。基于此，本發明(ming)提出了一種新生血管生成抑(yi)制肽及其透明(ming)質酸(suan)修飾物。

在(zai)本申請的一(yi)(yi)種實施方案中，提供了一(yi)(yi)種es-2-af肽，其(qi)等電(dian)點為(wei)11.54，其(qi)氨基酸序列(lie)如下：

es-2-af肽：ivrradraavpggggggnqwfi。

由于anti-flt1和es-2在活性(xing)方面既有(you)相似之處，又(you)有(you)諸多不同(tong)，將anti-flt1和es-2進(jin)行融合的(de)(de)難點在于：如何保證(zheng)將anti-flt1和es-2各自的(de)(de)優點融合在同(tong)一個肽(tai)(tai)中，同(tong)時克服融合前各條(tiao)多肽(tai)(tai)固有(you)的(de)(de)缺點。本(ben)申(shen)請通過設計(ji)linker(gggg)實(shi)現了anti-flt1和es-2的(de)(de)融合，融合后的(de)(de)es-2-af肽(tai)(tai)具(ju)有(you)更(geng)好(hao)的(de)(de)生物(wu)活性(xing)、更(geng)明確的(de)(de)作用(yong)機制(zhi)、更(geng)好(hao)的(de)(de)穩定性(xing)和更(geng)長的(de)(de)半衰(shuai)期。

在(zai)本申請(qing)的另一種實施方(fang)式中(zhong)，還提供了一種es-2-af肽(tai)的透明質酸(suan)化修飾物(wu)，由(you)es-2-af肽(tai)上的氨基與透明質酸(suan)分子上的羧(suo)基通過酰胺鍵結合，結構式如下(xia)：

ha-co-nh-(es-2-af)n；

式中，n＝30～60；es-2-af的(de)分(fen)子量為2197.5da，ha的(de)分(fen)子量為240000da。

本發明的(de)es-2-af肽(tai)的(de)透(tou)明質酸(suan)化(hua)修(xiu)飾(shi)物與(yu)es-2-af肽(tai)相比，保留了es-2-af肽(tai)抗(kang)新生血管生成(cheng)與(yu)抗(kang)腫瘤活(huo)性(xing)，整(zheng)合了大(da)分子(zi)透(tou)明質酸(suan)抗(kang)新生血管生成(cheng)等(deng)特性(xing)，使其具(ju)有(you)穩定性(xing)更(geng)高、親水性(xing)更(geng)強(qiang)、靶向(xiang)性(xing)更(geng)強(qiang)等(deng)特性(xing)，因此具(ju)有(you)更(geng)好的(de)使用效(xiao)果和(he)應用價值。

為了(le)使(shi)得本(ben)(ben)領域技(ji)術(shu)人員能夠更加清楚地(di)了(le)解本(ben)(ben)申請的(de)(de)技(ji)術(shu)方案，以下將結合具體的(de)(de)實施(shi)例詳(xiang)細說明本(ben)(ben)申請的(de)(de)技(ji)術(shu)方案。

本(ben)(ben)發明實施例中(zhong)所用的試驗材(cai)料(liao)均為本(ben)(ben)領域(yu)常規的試驗材(cai)料(liao)，均可通過商(shang)業(ye)渠(qu)道購買得(de)到。

實施例1：es-2-af肽的制備

本發明的(de)es-2-af肽的(de)分子量為2197.5da，采用(yong)fmoc固相(xiang)合成(cheng)，由高效液(ye)相(xiang)進行純(chun)化，并質譜、高效液(ye)相(xiang)色(se)譜等(deng)手段進行了結構的(de)確證，純(chun)度均可達(da)95％以(yi)上。

實施例2：es-2-af肽透(tou)明質酸化修飾物(ha-es-2-af)的制備(bei)

制備步驟如下：

(1)將dowex離子(zi)交換樹脂用水清洗，加入(ru)過(guo)(guo)(guo)量的(de)四丁(ding)基氫氧化胺tba-oh(24.5ml)，混勻。得到(dao)dowex-tba樹脂，過(guo)(guo)(guo)濾(lv)除去(qu)上清。將透明質酸鈉naha(1g)溶(rong)于水中，倒入(ru)準備(bei)好的(de)dowex-tba樹脂(10g)中。混勻3h后，用0.45μm針頭濾(lv)器過(guo)(guo)(guo)濾(lv)以(yi)除去(qu)dowex樹脂得到(dao)澄清的(de)ha-tba溶(rong)液，凍干(gan)3天。

(2)將(jiang)步驟(zou)(1)中制得的(de)ha-tba與es-2-af肽分別溶(rong)于(yu)dmso。ha-tba充分溶(rong)解后(hou)(hou)，加(jia)入過量的(de)卡特縮合(he)劑bop以活化(hua)ha羧(suo)基，混勻(yun)30min。然后(hou)(hou)將(jiang)ha-tba溶(rong)液與肽溶(rong)液、等摩(mo)爾量的(de)dipea混合(he)溶(rong)于(yu)dmso，反(fan)(fan)應(ying)(ying)24h后(hou)(hou)，加(jia)入等體積1mnaoh水溶(rong)液。用(yong)1mhcl將(jiang)ph降至3.0以終止(zhi)反(fan)(fan)應(ying)(ying)，然后(hou)(hou)用(yong)1mnaoh將(jiang)ph升至7.0。反(fan)(fan)應(ying)(ying)產(chan)物倒入預(yu)處理的(de)透析袋(10kda)，用(yong)大(da)量的(de)nacl溶(rong)液、25％乙醇、水透析。凍干3天。

采用¹h核磁共振鑒定結(jie)構，結(jie)果如(ru)圖(tu)1所示，結(jie)果表明(ming)透明(ming)質酸成功地修飾了es-2-af肽，平均連結(jie)率為93.75％。

試驗例1：es-2-af肽抗細胞(bao)增(zeng)殖作用與anti-flt1、es-2肽的比較(jiao)

實驗過程如下：

(1)試驗藥(yao)物：anti-flt1肽(tai)、es-2肽(tai)與實施例1制備的(de)es-2-af肽(tai)，三組藥(yao)物中肽(tai)濃度一致。

(2)試驗方法：

收集(ji)對數期人臍靜脈內皮細(xi)胞eahy926，調整細(xi)胞懸液(ye)濃(nong)度(du)(du)(du)為7000/孔(kong)，分于(yu)96孔(kong)板，每孔(kong)200μl(含10％fbs的dmem培養基)，置(zhi)于(yu)37℃、5％co2的恒溫培養箱中培養使細(xi)胞貼壁；加入不同濃(nong)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)的試驗藥物(wu)，每種藥物(wu)5個復(fu)(fu)孔(kong)，繼續培養48h；每孔(kong)加入mtt溶液(ye)20μl，37℃繼續培養4h后終止培養，酶聯免疫檢測(ce)(ce)儀于(yu)波長490nm處測(ce)(ce)定各孔(kong)吸光度(du)(du)(du)(od)值，并計算其抑(yi)制率：抑(yi)制率＝1-[(實驗組(zu)-空(kong)白(bai)組(zu))/(對照-空(kong)白(bai)組(zu))。重復(fu)(fu)實驗三(san)次(ci)，取平均(jun)值。

抗(kang)內皮細胞增(zeng)殖試驗的結果(guo)見(jian)圖(tu)2，由圖(tu)2可(ke)以看出，不同濃度(du)梯度(du)的anti-flt1肽(tai)、es-2肽(tai)和(he)es-2-af肽(tai)在(zai)作用(yong)48h后，es-2-af肽(tai)的抗(kang)細胞增(zeng)殖作用(yong)效(xiao)果(guo)總體高(gao)于anti-flt1肽(tai)和(he)es-2肽(tai)。

試驗例2：體(ti)外(wai)anti-flt1、es-2、es-2-af肽抑制vegf及其(qi)受體(ti)vegfr1(flt-1)結合能(neng)力的測試(elisa法)

(1)試驗(yan)藥(yao)物(wu)：anti-flt1肽(tai)、es-2肽(tai)與實施例1制備的(de)es-2-af肽(tai)，三組(zu)藥(yao)物(wu)中(zhong)肽(tai)濃度一致。

(2)試驗方法：

vegf165溶于pbs配成0.5μg/ml，敷于96孔(kong)板(ban)中(zhong)(zhong)每孔(kong)50μl，4℃過夜。磷酸鹽緩沖液pbs洗(xi)(xi)板(ban)，300μl*3次，每次5分(fen)鐘(zhong)(zhong)。3wt％bsainpbs250μl/孔(kong)，37℃封閉(bi)2小(xiao)時。磷酸鹽緩沖液pbs洗(xi)(xi)板(ban)，300μl*3次，每次5分(fen)鐘(zhong)(zhong)。加(jia)入待測樣品。每濃度3個重復。室(shi)溫(wen)孵(fu)(fu)育(yu)(yu)(yu)1小(xiao)時。陽性對照(zhao)：500ng/mlflt-fcinbsa1wt％inpbs。實驗組(zu)：500ng/mlflt-fc+anti-flt1組(zu)、es-2組(zu)、es-2-af組(zu)，三組(zu)中(zhong)(zhong)肽濃度均(jun)為5，25，50，100，200μg/ml。含(han)0.05wt％tween20的pbs洗(xi)(xi)板(ban)300μl*3次，每次5分(fen)鐘(zhong)(zhong)。加(jia)入二(er)抗anti-humanigg-hrp-fcin0.3wt％bsainpbs(1:1000，50μl)，室(shi)溫(wen)孵(fu)(fu)育(yu)(yu)(yu)1小(xiao)時。含(han)0.05wt％tween20的pbs洗(xi)(xi)板(ban)300μl*2次，每次5分(fen)鐘(zhong)(zhong)，然后pbs洗(xi)(xi)板(ban)300μl*1次，5分(fen)鐘(zhong)(zhong)。吸(xi)水布上(shang)輕敲(qiao)吸(xi)干(gan)水分(fen)。tmb顯色液每孔(kong)200μl，避光(guang)孵(fu)(fu)育(yu)(yu)(yu)，10分(fen)鐘(zhong)(zhong)后酶免儀450nm測試。

實驗(yan)結(jie)果見圖3，當(dang)濃度大于25μg/ml時，es-2-af抑制vegf及其受體結(jie)合的能力均優于anti-flt1、es-2肽。

試(shi)驗例3：es-2-af肽(tai)透明質酸化(hua)修飾物抗細胞增(zeng)殖作用與es-2-af肽(tai)的比較實(shi)驗過程如下：

(1)試驗藥(yao)物：實(shi)施例(li)(li)2制(zhi)備的es-2-af肽(tai)(tai)透明質(zhi)酸(suan)化(hua)修飾物(ha-es-2-af)、實(shi)施例(li)(li)1制(zhi)備的es-2-af肽(tai)(tai)以(yi)及es-2-af肽(tai)(tai)與透明質(zhi)酸(suan)按連結比混(hun)合(he)的混(hun)合(he)物(ha&es-2-af)，三組藥(yao)物中肽(tai)(tai)濃度一致。

(2)試驗方法：

收(shou)集對數(shu)期人臍靜脈內皮細(xi)胞eahy926，調整細(xi)胞懸液(ye)濃度(du)為7000/孔(kong)(kong)，分于96孔(kong)(kong)板，每(mei)孔(kong)(kong)200μl(含10％fbs的dmem培(pei)養基)，置(zhi)于37℃、5％co2的恒溫(wen)培(pei)養箱中培(pei)養使細(xi)胞貼壁；加入(ru)不同(tong)濃度(du)梯度(du)的試驗(yan)藥物，每(mei)種(zhong)藥物5個復孔(kong)(kong)，繼續培(pei)養48h；每(mei)孔(kong)(kong)加入(ru)mtt溶液(ye)20μl，37℃繼續培(pei)養4h后(hou)終止培(pei)養，酶聯免(mian)疫檢測(ce)儀于波長490nm處測(ce)定(ding)各孔(kong)(kong)吸光度(du)(od)值，并計算其抑(yi)制率(lv)：抑(yi)制率(lv)＝1-[(實驗(yan)組-空(kong)白(bai)組)/(對照-空(kong)白(bai)組)。重復實驗(yan)三次，取平均值。

抗(kang)內皮細胞增殖(zhi)試驗的結(jie)果見圖(tu)4，由圖(tu)4可以看出(chu)，不同(tong)濃度(du)(du)梯度(du)(du)的es-2-af肽(tai)透(tou)明(ming)質酸(suan)化(hua)修(xiu)飾物(wu)和es-2-af肽(tai)在作用48h后，es-2-af肽(tai)透(tou)明(ming)質酸(suan)化(hua)修(xiu)飾物(wu)的抗(kang)細胞增殖(zhi)作用效果明(ming)顯比相同(tong)肽(tai)濃度(du)(du)的es-2-af肽(tai)以及兩者混合物(wu)要強(qiang)很多。

試(shi)驗例4：體(ti)外ha-es-2-af結(jie)合(he)物抑制vegf及其受體(ti)vegfr1(flt-1)結(jie)合(he)能(neng)力的測試(shi)(elisa法)

(1)試驗(yan)藥物(wu)：實施(shi)例(li)2制備的(de)(de)es-2-af肽透(tou)明質酸(suan)化(hua)修飾物(wu)(ha-es-2-af)、實施(shi)例(li)1制備的(de)(de)es-2-af肽以及(ji)es-2-af肽與透(tou)明質酸(suan)按連結比混(hun)合的(de)(de)混(hun)合物(wu)(ha&es-2-af)，三組藥物(wu)中肽濃(nong)度一致。

(2)試驗方法：

vegf165溶于(yu)pbs配(pei)成0.5μg/ml，敷于(yu)96孔(kong)板(ban)(ban)中每(mei)(mei)(mei)(mei)孔(kong)50μl，4℃過夜(ye)。磷(lin)酸(suan)鹽緩沖液pbs洗(xi)板(ban)(ban)，300μl*3次(ci)(ci)，每(mei)(mei)(mei)(mei)次(ci)(ci)5分(fen)(fen)鐘。3wt％bsainpbs250μl/孔(kong)，37℃封閉2小(xiao)(xiao)時。磷(lin)酸(suan)鹽緩沖液pbs洗(xi)板(ban)(ban)，300μl*3次(ci)(ci)，每(mei)(mei)(mei)(mei)次(ci)(ci)5分(fen)(fen)鐘。加入待測(ce)樣品。每(mei)(mei)(mei)(mei)濃度3個重復。室(shi)溫(wen)孵育(yu)1小(xiao)(xiao)時。陽性(xing)對照：500ng/mlflt-fcinbsa1wt％inpbs。實驗(yan)組(zu)(zu)：500ng/mlflt-fc+es-2-af組(zu)(zu)、ha&es-2-af組(zu)(zu)、ha-es-2-af組(zu)(zu)，三組(zu)(zu)中肽濃度均(jun)為5，25，50，100，200μg/ml。含(han)0.05wt％tween20的pbs洗(xi)板(ban)(ban)300μl*3次(ci)(ci)，每(mei)(mei)(mei)(mei)次(ci)(ci)5分(fen)(fen)鐘。加入二抗anti-humanigg-hrp-fcin0.3wt％bsainpbs(1:1000，50μl)，室(shi)溫(wen)孵育(yu)1小(xiao)(xiao)時。含(han)0.05wt％tween20的pbs洗(xi)板(ban)(ban)300μl*2次(ci)(ci)，每(mei)(mei)(mei)(mei)次(ci)(ci)5分(fen)(fen)鐘，然后(hou)pbs洗(xi)板(ban)(ban)300μl*1次(ci)(ci)，5分(fen)(fen)鐘。吸(xi)水(shui)布上輕敲吸(xi)干水(shui)分(fen)(fen)。tmb顯色液每(mei)(mei)(mei)(mei)孔(kong)200μl，避光孵育(yu)，10分(fen)(fen)鐘后(hou)酶(mei)免儀450nm測(ce)試(shi)。

實(shi)驗結(jie)果見圖5，es-2-af肽、ha&es-2-af混合物(wu)、ha-es-2-af結(jie)合物(wu)的(de)抑(yi)(yi)制作(zuo)用(yong)均呈濃度(du)依賴性增加(jia)。且當肽濃度(du)高于(yu)25μg/ml時混合物(wu)組抑(yi)(yi)制作(zuo)用(yong)優于(yu)es-2-af肽，ha-es-2-af結(jie)合物(wu)組的(de)抑(yi)(yi)制作(zuo)用(yong)為(wei)三者中最明顯。

試驗例(li)5：transwell小室法測(ce)定對于細胞(bao)轉(zhuan)移的抑(yi)制作用

(1)試(shi)驗藥物(wu)(wu)(wu)：實(shi)施例2制備的(de)es-2-af肽(tai)透(tou)明質酸化修飾(shi)物(wu)(wu)(wu)、實(shi)施例1制備的(de)es-2-af肽(tai)以(yi)及es-2-af肽(tai)與透(tou)明質酸按(an)連結比混合的(de)混合物(wu)(wu)(wu)，三(san)組藥物(wu)(wu)(wu)中(zhong)肽(tai)濃(nong)度一致。

(2)試驗方法：

將無(wu)(wu)菌黃(huang)槍頭放入4℃冰箱(xiang)中(zhong)冷藏過(guo)夜。將matrigel膠(jiao)移至(zhi)4℃冰箱(xiang)中(zhong)融(rong)化約40min。matrigel膠(jiao)用無(wu)(wu)fbs無(wu)(wu)抗生(sheng)素(su)的dmem稀(xi)釋1:6，于(yu)(yu)transwell小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)上(shang)層(ceng)(ceng)(ceng)每孔加50μl，放入孵(fu)箱(xiang)孵(fu)育1h，取出(chu)transwell小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)，吸(xi)出(chu)上(shang)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)中(zhong)未凝固的液(ye)體(ti)，用雙無(wu)(wu)得(de)培養(yang)(yang)(yang)基dmem沖洗(xi)小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)一(yi)次。小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)倒置(zhi)，半透膜下(xia)(xia)層(ceng)(ceng)(ceng)均(jun)勻涂抹(mo)fn(纖粘蛋白(bai))10μl，置(zhi)于(yu)(yu)超凈臺中(zhong)風干。24孔板(ban)每孔加600μl(含dmem完全培養(yang)(yang)(yang)基)，將小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)放入其中(zhong)；收集對數生(sheng)長期的內皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)eahy926，調整細(xi)(xi)(xi)胞(bao)懸液(ye)濃度為(wei)5×104/孔，取細(xi)(xi)(xi)胞(bao)100μl接(jie)種(zhong)于(yu)(yu)transwell小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)的上(shang)層(ceng)(ceng)(ceng)小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)內，并(bing)(bing)加入藥物處(chu)理細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，于(yu)(yu)培養(yang)(yang)(yang)箱(xiang)中(zhong)孵(fu)育24h，取出(chu)小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)，吸(xi)去上(shang)層(ceng)(ceng)(ceng)培養(yang)(yang)(yang)基，用棉(mian)棒拭去matrigel膠(jiao)和未穿過(guo)膜的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，pbs浸洗(xi)一(yi)遍。小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)于(yu)(yu)固定(ding)液(ye)(甲醇(chun)：冰醋(cu)酸＝3:1)中(zhong)固定(ding)25min，pbs洗(xi)一(yi)遍，用0.1％結晶紫(zi)染液(ye)染色(se)25min，pbs洗(xi)兩遍，晾干，置(zhi)于(yu)(yu)倒置(zhi)熒光顯微鏡下(xia)(xia)拍照，計數穿過(guo)matrigel膠(jiao)至(zhi)小(xiao)室(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)(shi)下(xia)(xia)層(ceng)(ceng)(ceng)被染色(se)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，并(bing)(bing)作統計圖。實驗重復(fu)5次，取平均(jun)值。

實(shi)驗結果見圖(tu)6，各加藥組(zu)與對照組(zu)比(bi)(bi)較均有明(ming)顯抑制內皮細(xi)胞(bao)(bao)遷移的(de)作用(yong)。與es-2-af肽(tai)、ha&es-2-af混合物相比(bi)(bi)ha-es-2-af結合物組(zu)發生遷移的(de)細(xi)胞(bao)(bao)數量最(zui)少(shao)，說明(ming)ha-es-2-af抑制細(xi)胞(bao)(bao)遷移的(de)作用(yong)最(zui)強(qiang)。

以上所(suo)述僅為本(ben)申(shen)請(qing)的優選實施例而已，并不用于限制本(ben)申(shen)請(qing)，對于本(ben)領域的技(ji)術人員來(lai)說，本(ben)申(shen)請(qing)可以有(you)各種(zhong)更(geng)改(gai)和(he)變化(hua)。凡在(zai)本(ben)申(shen)請(qing)的精神和(he)原則之內(nei)，所(suo)作(zuo)的任何修改(gai)、等同替換、改(gai)進等，均(jun)應包含在(zai)本(ben)申(shen)請(qing)的保護范圍之內(nei)。