本發明屬于生物(wu)醫學領域，尤(you)其是涉及一種化合(he)物(wu)在(zai)制(zhi)(zhi)備抑制(zhi)(zhi)激肽(tai)釋放酶KLK7的(de)藥物(wu)上的(de)應用(yong)及合(he)成方(fang)法(fa)。

背景技術：

特應(ying)性(xing)(xing)(xing)(xing)皮(pi)(pi)(pi)炎(yan)(yan)(Atopic Dermatitis,AD)是(shi)一(yi)種廣泛(fan)傳播的(de)(de)(de)(de)(de)(de)慢(man)性(xing)(xing)(xing)(xing)炎(yan)(yan)癥性(xing)(xing)(xing)(xing)皮(pi)(pi)(pi)膚病(bing)，特點是(shi)干燥、鱗狀皮(pi)(pi)(pi)膚、炎(yan)(yan)癥、皮(pi)(pi)(pi)膚滲透性(xing)(xing)(xing)(xing)增加，AD病(bing)人的(de)(de)(de)(de)(de)(de)皮(pi)(pi)(pi)膚對環境中(zhong)常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)而(er)對正常(chang)人無害的(de)(de)(de)(de)(de)(de)因(yin)(yin)素也會很(hen)敏感(gan)從而(er)易(yi)于(yu)(yu)受到表面感(gan)染。在過(guo)(guo)去的(de)(de)(de)(de)(de)(de)30年(nian)間(jian)工(gong)業化國家(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特應(ying)性(xing)(xing)(xing)(xing)皮(pi)(pi)(pi)炎(yan)(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)病(bing)率(lv)(lv)增長了(le)2到3倍，據(ju)估計兒童(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特應(ying)性(xing)(xing)(xing)(xing)皮(pi)(pi)(pi)炎(yan)(yan)患病(bing)率(lv)(lv)達(da)到了(le)15-30％，成人的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特應(ying)性(xing)(xing)(xing)(xing)皮(pi)(pi)(pi)炎(yan)(yan)患病(bing)率(lv)(lv)達(da)到了(le)2-10％。由(you)(you)于(yu)(yu)發(fa)(fa)病(bing)機(ji)(ji)制(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)雜性(xing)(xing)(xing)(xing)，對AD的(de)(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)病(bing)機(ji)(ji)制(zhi)(zhi)了(le)解得不多，但皮(pi)(pi)(pi)膚屏(ping)障(zhang)(zhang)功能紊亂已經(jing)被證實是(shi)AD發(fa)(fa)展(zhan)過(guo)(guo)程中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)關鍵(jian)因(yin)(yin)素之一(yi)。皮(pi)(pi)(pi)膚屏(ping)障(zhang)(zhang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩定依賴于(yu)(yu)顆粒(li)層的(de)(de)(de)(de)(de)(de)角(jiao)(jiao)質形成細(xi)胞分化為角(jiao)(jiao)質細(xi)胞和皮(pi)(pi)(pi)膚表層角(jiao)(jiao)質細(xi)胞脫(tuo)落(即脫(tuo)屑)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)衡，皮(pi)(pi)(pi)膚的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脫(tuo)屑過(guo)(guo)程包(bao)括(kuo)由(you)(you)KLKs參與的(de)(de)(de)(de)(de)(de)橋(qiao)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)降(jiang)(jiang)解，由(you)(you)于(yu)(yu)橋(qiao)粒(li)是(shi)角(jiao)(jiao)質細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)粘連蛋白，橋(qiao)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)降(jiang)(jiang)解則會導(dao)致(zhi)角(jiao)(jiao)質細(xi)胞脫(tuo)落而(er)致(zhi)皮(pi)(pi)(pi)膚脫(tuo)屑。證據(ju)顯示，局部或暫時(shi)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)KLKs活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)控制(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)失(shi)調，是(shi)AD病(bing)人皮(pi)(pi)(pi)膚屏(ping)障(zhang)(zhang)穩定缺失(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要原(yuan)因(yin)(yin)之一(yi)。

KLKs(Kallikreins，激肽釋放(fang)酶(mei)(mei)(mei))是具有(you)胰蛋白(bai)酶(mei)(mei)(mei)或胰凝乳(ru)蛋白(bai)酶(mei)(mei)(mei)特(te)異(yi)性的(de)(de)絲氨(an)(an)酸(suan)蛋白(bai)酶(mei)(mei)(mei)，其編碼基(ji)因定位于19q13.4，編碼15個(ge)(ge)分泌型絲氨(an)(an)酸(suan)蛋白(bai)酶(mei)(mei)(mei)KLK 1-KLK 15。已經證明(ming)，KLKs存在(zai)(zai)于正常(chang)人的(de)(de)角質(zhi)層細胞中(zhong)，目前發現，至少有(you)8種KLK(KLK 5,KLK 6,KLK 7,KLK 8,KLK 10,KLK 11,KLK 13和(he)KLK 14)存在(zai)(zai)于人的(de)(de)角質(zhi)層和(he)汗液(ye)中(zhong)，其中(zhong)KLK7占總量的(de)(de)40％。KLK7可能(neng)是皮膚損傷的(de)(de)一個(ge)(ge)關(guan)鍵酶(mei)(mei)(mei)，而(er)且在(zai)(zai)AD病人中(zhong)它可能(neng)參與一個(ge)(ge)系(xi)統性炎癥反應，在(zai)(zai)AD的(de)(de)角質(zhi)層KLK7升高最(zui)為(wei)突出，這提示KLK7在(zai)(zai)AD的(de)(de)發病機制上(shang)可能(neng)是至關(guan)重要的(de)(de)，因此，抑制KLK7的(de)(de)活性對于AD的(de)(de)治療顯得(de)最(zui)為(wei)重要。

LEKTI(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor,LEKTI)是由SPINK5基因(yin)(yin)編碼的(de)(de)(de)絲氨(an)酸(suan)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)家族的(de)(de)(de)成員，LEKTI前體(ti)包(bao)含一個信號肽和彼此隔開(kai)的(de)(de)(de)15個絲氨(an)酸(suan)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶抑制(zhi)(zhi)(zhi)域(D1-D15)，表達后(hou)迅速被弗林蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶水(shui)解為幾個蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)片段(duan)， 其中包(bao)含D6-D9抑制(zhi)(zhi)(zhi)域的(de)(de)(de)LEKTI能抑制(zhi)(zhi)(zhi)胰蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶、胰凝乳蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶、KLK5和KLK7等酶的(de)(de)(de)活性(xing)。LEKTI的(de)(de)(de)內源(yuan)靶(ba)至少包(bao)括KLK5、KLK7和KLK14，它們共同參與皮膚的(de)(de)(de)脫屑過程。在(zai)AD病人，LEKTI表達水(shui)平嚴重(zhong)降(jiang)低，導(dao)致了(le)KLK7活性(xing)的(de)(de)(de)異常升高(gao)。盡管LEKTI是表皮內KLK7的(de)(de)(de)天然抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)，但作為治療(liao)AD的(de)(de)(de)外(wai)用藥，其不能透過皮膚角質層，而且其大分子蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)(de)特性(xing)也會導(dao)致吸收(shou)擴散(san)速度(du)過慢、降(jiang)解速度(du)過快的(de)(de)(de)問(wen)題，因(yin)(yin)而作用非(fei)常有限。到(dao)目前為止，還(huan)沒有一種(zhong)有效(xiao)的(de)(de)(de)KLK7抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)應用于臨床。

技術實現要素：

基(ji)于此，本發明提(ti)供化合(he)(he)物(wu)在制(zhi)備抑制(zhi)激肽釋放酶(mei)KLK7的藥物(wu)上的應用及(ji)其(qi)合(he)(he)成方法。

本發明技術方案為：

一種化合物在制備(bei)抑(yi)制激肽釋放(fang)酶KLK7的(de)藥物上的(de)應用(yong)，該化合物的(de)結構式為：

合(he)(he)(he)成(cheng)權利要求(qiu)1所(suo)述的(de)化合(he)(he)(he)物的(de)方法，所(suo)述合(he)(he)(he)成(cheng)路線(xian)如下(xia)：

其中：

物(wu)質(zhi)二十三(san)的合成：將物(wu)質(zhi)二十一、物(wu)質(zhi)二十二、冰醋(cu)酸(suan)加(jia)入到反(fan)應瓶，加(jia)熱(re)至回流反(fan)應4～8小時，冷卻，過濾，水洗(xi)，二氯甲烷洗(xi)，得物(wu)質(zhi)二十三(san)；

物(wu)(wu)質二(er)十四(si)的合成：向反(fan)(fan)應瓶中加(jia)入(ru)(ru)物(wu)(wu)質二(er)十三和吡啶的混合物(wu)(wu)，再滴(di)加(jia)三氯(lv)氧(yang)磷，加(jia)畢，升溫反(fan)(fan)應，反(fan)(fan)應結束后(hou)將(jiang)反(fan)(fan)應液冷(leng)卻(que)至(zhi)50℃，加(jia)入(ru)(ru)氯(lv)仿(fang)，攪拌反(fan)(fan)應，冷(leng)卻(que)至(zhi)0～5℃，加(jia)入(ru)(ru)冷(leng)水，分出有機相，冷(leng)水洗(xi)氯(lv)仿(fang)層為中性，濃(nong)縮除去氯(lv)仿(fang)，干燥得(de)物(wu)(wu)質二(er)十四(si)；

化合(he)物(wu)Ⅳ的合(he)成：向(xiang)反(fan)應(ying)瓶中加入物(wu)質二十四、物(wu)質二十五、甲(jia)苯(ben)、碳酸鉀，回流(liu)反(fan)應(ying)3-4小時，冷(leng)至25℃，過濾，用二氯甲(jia)烷洗固(gu)體(ti)，濾液減壓濃縮得粗品(pin)，粗品(pin)以氯仿重結晶得化合(he)物(wu)Ⅳ。

優選地，所述物質二十(shi)一(yi)、物質二十(shi)二、冰醋酸的摩爾比為1.0:1.0～2.0:1.5～2.5，回流(liu)反應(ying)4～8小時，冷(leng)卻至25℃。

優選地，所述物質二十三(san)、吡啶、三(san)氯氧磷的摩爾(er)比(bi)為1.0:1.0～1.5:1.5～2.5，升溫(wen)至(zhi)110～120℃反應2-6小時，將反應液(ye)冷(leng)卻(que)至(zhi)50℃，加入氯仿。

優(you)選地，所述氯仿的體(ti)積為吡啶的30～60倍，攪拌反應1～2小時，冷(leng)(leng)卻至(zhi)0～5℃，加入5～10℃的冷(leng)(leng)水，冷(leng)(leng)水的體(ti)積為氯仿的0.5～2.0倍。

優選(xuan)地，所述物質(zhi)二(er)十四、物質(zhi)二(er)十五、碳酸鉀、甲(jia)苯的(de)摩爾比為(wei) 1.0:1.0～2.0:1.0～2.0:10.0～30.0，回流(liu)反應3-4小時，冷(leng)卻至25℃。

所(suo)(suo)述(shu)化合物(wu)或(huo)所(suo)(suo)述(shu)方法在制備(bei)抑制激(ji)肽釋(shi)放酶(mei)KLK7的藥物(wu)上(shang)(shang)的應用(yong)，其(qi)特征(zheng)在于，所(suo)(suo)述(shu)制備(bei)抑制激(ji)肽釋(shi)放酶(mei)KLK7的藥物(wu)上(shang)(shang)的應用(yong)的藥物(wu)包括：

中的(de)一種或幾種的(de)混合物。

優選地，所述制備抑制激肽(tai)釋(shi)放酶KLK7的藥物(wu)(wu)(wu)上(shang)的應用的藥物(wu)(wu)(wu)包(bao)括：化合物(wu)(wu)(wu)I、化合物(wu)(wu)(wu)II、化合物(wu)(wu)(wu)III、化合物(wu)(wu)(wu)IV和化合物(wu)(wu)(wu)V的摩(mo)爾比為1:1～4:1～5：1～3：1～2。

本發明優點：

1、本發明提供的(de)抑制(zhi)激肽釋(shi)放酶KLK7的(de)化合物能夠有效的(de)抑制(zhi)KLK7的(de)活性，其合成(cheng)方法(fa)簡單易行，加(jia)入(ru)適當的(de)輔料和助劑可制(zhi)備成(cheng)抑制(zhi)KLK7活性的(de)藥(yao)物制(zhi)劑。

2、采用(yong)本(ben)發明合(he)成(cheng)方法副(fu)產物產生的少，雜質含量(liang)低至0.05％～0.08％。

3、本發明化合(he)物和其(qi)他化合(he)物聯(lian)用，對于(yu)激肽釋放酶KLK7的活(huo)性抑制效率更高。

4、在皮膚中主要表達的(de)絲(si)氨(an)酸蛋白(bai)酶(mei)還包括KLK5，KLK14，Matriptase與Elastase2。本發明化合物合物對(dui)上述絲(si)氨(an)酸蛋白(bai)酶(mei)在100μM的(de)濃度下均不變現出抑制(zhi)活性，表明式其(qi)KLK7具有良(liang)好特(te)異性。

5、本發明(ming)化(hua)(hua)合(he)物(wu)在pH8，150mM NaCl，37℃的緩沖液中孵(fu)育(yu)72h，其對KLK7的抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)活性(xing)維持不變，表(biao)明(ming)本發明(ming)化(hua)(hua)合(he)物(wu)的抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)效率高，活性(xing)強，并且其抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)效果穩定。

附圖說明

圖1：本發明實施化合物Ⅳ的濃(nong)度與抑制率的關系曲線。

圖2：本發明化合物Ⅳ的H¹核磁圖。

圖3：本發明化合物Ⅳ的C¹³核磁圖。

圖4：實施例7合化合物濃度與(yu)抑制(zhi)率關系曲線。

具體實施方式

下面(mian)結合實施(shi)例(li)(li)來(lai)進一步說明(ming)本發(fa)明(ming)，但本發(fa)明(ming)要(yao)求保護的范圍并不(bu)局限于(yu)實施(shi)例(li)(li)表述(shu)的范圍。

實施例1

化合物在制備抑制激(ji)肽釋(shi)放酶KLK7的(de)藥物上的(de)應用(yong)，該化合物的(de)結(jie)構式(shi)為(wei)：

實施例2

合(he)成實(shi)施例1所(suo)述(shu)的(de)化合(he)物的(de)方法，所(suo)述(shu)合(he)成路(lu)線如下：

其中：

物質二十(shi)三(san)的合成：將物質二十(shi)一、物質二十(shi)二、冰(bing)醋酸加入(ru)到(dao)反應瓶，加熱(re)至回流反應4～8小(xiao)時，冷卻，過濾(lv)，水洗(xi)，二氯甲烷洗(xi)，得物質二十(shi)三(san)；

物(wu)質二十(shi)(shi)四的合(he)成(cheng)：向(xiang)反(fan)(fan)應瓶中(zhong)加(jia)(jia)(jia)入(ru)物(wu)質二十(shi)(shi)三(san)和吡啶的混合(he)物(wu)，再滴加(jia)(jia)(jia)三(san)氯氧磷，加(jia)(jia)(jia)畢，升溫反(fan)(fan)應，反(fan)(fan)應結束后將反(fan)(fan)應液(ye)冷(leng)(leng)卻至(zhi)50℃，加(jia)(jia)(jia)入(ru)氯仿，攪拌反(fan)(fan)應，冷(leng)(leng)卻至(zhi)5℃，加(jia)(jia)(jia)入(ru)冷(leng)(leng)水(shui)，分出有機相，冷(leng)(leng)水(shui)洗氯仿層為(wei)中(zhong)性，濃(nong)縮除(chu)去(qu)氯仿，干燥得物(wu)質二十(shi)(shi)四；

化合(he)物(wu)Ⅳ的合(he)成：向反應瓶中加入(ru)物(wu)質二(er)(er)十(shi)四、物(wu)質二(er)(er)十(shi)五、甲苯、碳(tan)酸鉀，回(hui)流反應4小(xiao)時，冷至(zhi)25℃，過濾，用二(er)(er)氯甲烷洗固體，濾液(ye)減壓濃(nong)縮得粗品(pin)，粗品(pin)以氯仿重結晶得化合(he)物(wu)Ⅳ。

所(suo)述物質二十(shi)一、物質二十(shi)二、冰醋酸(suan)的摩爾比為1:1:1.5，回流反應4小時，冷卻至(zhi)25℃。

所(suo)(suo)述物質二十三(san)、吡啶(ding)(ding)、三(san)氯(lv)氧磷(lin)的摩爾比為1:1:1.5，升溫至(zhi)110℃反應2小時，將反應液冷(leng)卻(que)至(zhi)50℃，加(jia)入氯(lv)仿，所(suo)(suo)述氯(lv)仿的體積(ji)為吡啶(ding)(ding)的30倍，攪拌反應1小時，冷(leng)卻(que)至(zhi)0℃，加(jia)入5℃的冷(leng)水，冷(leng)水的體積(ji)為氯(lv)仿的0.5倍。

實施例3

合成(cheng)實施例1所(suo)述(shu)的(de)化合物的(de)方法，所(suo)述(shu)合成(cheng)路線(xian)為(wei)實施例2所(suo)述(shu)：

物(wu)(wu)質(zhi)二(er)(er)十三的(de)合(he)成：將物(wu)(wu)質(zhi)二(er)(er)十一、物(wu)(wu)質(zhi)二(er)(er)十二(er)(er)、冰醋酸加(jia)入到反應(ying)瓶(ping)，加(jia)熱至回流反應(ying)8小時(shi)，冷卻，過濾(lv)，水洗(xi)，二(er)(er)氯(lv)甲烷洗(xi)，得(de)物(wu)(wu)質(zhi)二(er)(er)十三；

物(wu)質二十四(si)的合成(cheng)：向(xiang)反(fan)應瓶中加(jia)(jia)入物(wu)質二十三(san)和吡啶的混合物(wu)，再滴加(jia)(jia)三(san)氯(lv)氧磷，加(jia)(jia)畢(bi)，升溫反(fan)應，反(fan)應結束(shu)后將(jiang)反(fan)應液冷(leng)卻(que)至(zhi)50℃，加(jia)(jia)入氯(lv)仿(fang)，攪拌反(fan)應，冷(leng)卻(que)至(zhi)5℃，加(jia)(jia)入冷(leng)水，分出有(you)機相，冷(leng)水洗(xi)氯(lv)仿(fang)層為中性，濃縮除去氯(lv)仿(fang)，干燥得物(wu)質二十四(si)；

化(hua)合物(wu)Ⅳ的合成：向(xiang)反應瓶中(zhong)加(jia)入物(wu)質(zhi)二(er)十(shi)四、物(wu)質(zhi)二(er)十(shi)五、甲(jia)苯、碳酸鉀，回流(liu)反應4小時，冷至25℃，過濾(lv)，用二(er)氯甲(jia)烷(wan)洗固體，濾(lv)液減(jian)壓濃縮(suo)得粗品，粗品以氯仿(fang)重結晶得化(hua)合物(wu)Ⅳ。

所述物質二(er)(er)(er)十一、物質二(er)(er)(er)十二(er)(er)(er)、冰醋(cu)酸的摩爾(er)比為(wei)1:2:2.5，回(hui)流反應8小(xiao)時，冷卻(que)至(zhi)25℃。

所述(shu)物質二(er)十(shi)三、吡啶、三氯(lv)氧磷的(de)摩爾比為1:1.5:2.5，升溫至120℃反應(ying)6小時，將反應(ying)液(ye)冷(leng)(leng)(leng)卻至50℃，加入氯(lv)仿(fang)，所述(shu)氯(lv)仿(fang)的(de)體積為吡啶的(de)60倍，攪拌反應(ying)2小時，冷(leng)(leng)(leng)卻至5℃，加入10℃的(de)冷(leng)(leng)(leng)水(shui)(shui)，冷(leng)(leng)(leng)水(shui)(shui)的(de)體積為氯(lv)仿(fang)的(de)2倍。

實施例4

合(he)成實施例(li)1所(suo)述的(de)化合(he)物的(de)方法(fa)，所(suo)述合(he)成路線為實施例(li)2所(suo)述：

物(wu)(wu)質二(er)十(shi)三(san)的合成：將物(wu)(wu)質二(er)十(shi)一、物(wu)(wu)質二(er)十(shi)二(er)、冰醋酸加(jia)入到反應瓶，加(jia)熱至回流反應6小時，冷卻，過濾，水洗(xi)，二(er)氯(lv)甲烷洗(xi)，得(de)物(wu)(wu)質二(er)十(shi)三(san)；

物質二十(shi)四的(de)合成：向反(fan)(fan)(fan)應瓶中加入(ru)(ru)物質二十(shi)三(san)(san)和(he)吡啶的(de)混合物，再滴加三(san)(san)氯(lv)氧磷，加畢，升溫反(fan)(fan)(fan)應，反(fan)(fan)(fan)應結束后將反(fan)(fan)(fan)應液(ye)冷卻至(zhi)50℃，加入(ru)(ru)氯(lv)仿，攪拌反(fan)(fan)(fan)應，冷卻至(zhi)4℃，加入(ru)(ru)冷水，分(fen)出有機相，冷水洗(xi)氯(lv)仿層為中性，濃縮除去氯(lv)仿，干(gan)燥得物質二十(shi)四；

化合物(wu)Ⅳ的(de)合成(cheng)：向反應(ying)瓶(ping)中加(jia)入物(wu)質(zhi)(zhi)二(er)十(shi)四、物(wu)質(zhi)(zhi)二(er)十(shi)五、甲苯、碳酸鉀，回流反應(ying)3.5小時，冷(leng)至25℃，過濾，用二(er)氯(lv)甲烷(wan)洗固體，濾液減壓濃縮得粗品(pin)，粗品(pin)以氯(lv)仿重結晶得化合物(wu)Ⅳ。

所述物質二十(shi)一(yi)、物質二十(shi)二、冰醋酸(suan)的摩爾比為1:1.5:1.8，回(hui)流反應(ying)6小時，冷卻至25℃。

所述(shu)物質(zhi)二十三、吡(bi)啶(ding)、三氯(lv)(lv)氧磷(lin)的摩爾比(bi)為1:1.3:1.8，升溫至115℃反(fan)應(ying)(ying)5小 時(shi)(shi)，將(jiang)反(fan)應(ying)(ying)液(ye)冷(leng)卻至50℃，加入(ru)氯(lv)(lv)仿，所述(shu)氯(lv)(lv)仿的體積為吡(bi)啶(ding)的40倍，攪拌反(fan)應(ying)(ying)1.5小時(shi)(shi)，冷(leng)卻至3℃，加入(ru)8℃的冷(leng)水，冷(leng)水的體積為氯(lv)(lv)仿的0.8倍。

實施例5

1)將(jiang)化合物(wu)Ⅳ溶解在DMSO中(zhong)，配置成濃(nong)度10mM的母液(ye)；

2)在KLK7活(huo)性緩沖液(ye)(ye)中加入化合物Ⅳ，配制(zhi)成(cheng)6.25μM,12.5μM,25μM,50μM,100μM,200μM的(de)溶液(ye)(ye)，并(bing)在37℃作用15分鐘(zhong)；

3)加入熒光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH₂，在37℃下測(ce)KLK7的活性(xing)15分鐘，采用熒(ying)(ying)光酶標儀(yi)檢測(ce)熒(ying)(ying)光值，根據(ju)熒(ying)(ying)光值的大小計(ji)算KLK7的活性(xing)。

陰性對照組(zu)：在KLK7的(de)活性緩沖(chong)液中加入DMSO，其它(ta)操(cao)作(zuo)條件均與(yu)實驗組(zu)相同。

根(gen)據上(shang)述實(shi)驗組(zu)和陰性(xing)對照組(zu)獲得(de)的KLK7的活性(xing)計算化(hua)合物(wu)Ⅳ對KLK7的抑制率(lv)，計算抑制率(lv)的公式為％inhibition＝(1-a/b)×100％，計算結果如表(biao)1所(suo)示；其中(zhong)，a為待測樣品(pin)的酶(mei)活，b為陰性(xing)對照的酶(mei)活。

表(biao)1為(wei)化(hua)合物Ⅳ在不同濃(nong)度(du)下對KLK7活(huo)性的(de)抑(yi)(yi)制(zhi)率，根據表(biao)1所(suo)示的(de)結果繪制(zhi)化(hua)合物Ⅳ的(de)濃(nong)度(du)與抑(yi)(yi)制(zhi)率的(de)關系圖，采用(yong)KaleidaGraph軟件進行曲(qu)線(xian)擬合得(de)到(dao)化(hua)合物Ⅳ的(de)濃(nong)度(du)與抑(yi)(yi)制(zhi)率的(de)關系曲(qu)線(xian)，如圖1所(suo)示。

由表1和圖1的(de)結果可以看(kan)出，隨著化合(he)物Ⅳ濃度的(de)增(zeng)加，對KLK7活性的(de)抑制(zhi)率逐漸增(zeng)高，化合(he)物Ⅳ的(de)濃度為(wei)200μM時，對KLK7活性的(de)抑制(zhi)率達到100％。

因此，化合(he)物Ⅳ對KLK7具有優異的抑制(zhi)(zhi)效(xiao)果，該化合(he)物作為(wei)活性組分加入適當(dang)的輔料和助(zhu)劑可(ke)制(zhi)(zhi)備成抑制(zhi)(zhi)KLK7活性的藥物制(zhi)(zhi)劑。

化合物Ⅳ在(zai)不(bu)同(tong)濃度下對KLK7活性的(de)抑制率

由上述描述可(ke)以看出，本發明提(ti)供的(de)(de)抑(yi)制(zhi)(zhi)激肽釋(shi)放酶KLK7的(de)(de)化合物的(de)(de)制(zhi)(zhi)備方法簡單(dan)易行，能夠有效的(de)(de)抑(yi)制(zhi)(zhi)KLK7的(de)(de)活性，加入適當(dang)的(de)(de)輔料和助劑(ji)(ji)可(ke)制(zhi)(zhi)備成抑(yi)制(zhi)(zhi)KLK7活性的(de)(de)藥物制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)。

實施例6

所述制備抑制激肽釋放酶(mei)KLK7的(de)藥物上的(de)應用的(de)藥物包括：

所述化合物(wu)I、化合物(wu)II、化合物(wu)III、化合物(wu)IV和化合物(wu)V的質(zhi)量(liang)比為(wei)1:1～2:1～2.5： 2～3：1～2。

實施例7

實(shi)施例(li)6組合物的中按摩爾比為1:1:1：1：1混合后，按照實(shi)施例(li)5的方法測試不同濃度(du)下對KLK7活性的抑制率，結果見表(biao)2和圖(tu)4

表2混合(he)物在(zai)不同濃度下對(dui)KLK7活性(xing)的抑(yi)制率

由表(biao)2結果證(zheng)明(ming)，式化(hua)合物I、化(hua)合物II、化(hua)合物III、化(hua)合物IV和化(hua)合物V聯(lian)用(yong)效(xiao)果要比(bi)單獨(du)(du)使(shi)用(yong)效(xiao)果更(geng)加顯著，同樣的(de)(de)添(tian)加量情況下(xia)，混合物的(de)(de)藥(yao)效(xiao)要比(bi)單獨(du)(du)使(shi)用(yong)時對KLK7活(huo)性抑(yi)制率更(geng)高。

實施例8

合成(cheng)化(hua)合物(wu)I的方法，所述合成(cheng)路線如(ru)下：

其中：

物質(zhi)三(san)(san)的(de)合(he)成(cheng)：向反應瓶(ping)中加入(ru)乙(yi)(yi)(yi)醇、物質(zhi)一、質(zhi)量(liang)濃度37％的(de)甲(jia)醛水溶液、氫氧(yang)化鈉以(yi)及物質(zhi)二，反應，反應完畢，乙(yi)(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)(yi)酯萃取三(san)(san)次(ci)，每次(ci)乙(yi)(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)(yi)酯的(de)用量(liang)為前述乙(yi)(yi)(yi)醇體積的(de)1～5倍，合(he)并(bing)有機相，蒸餾，冷卻，過濾，水洗，乙(yi)(yi)(yi)醇洗，干燥得(de)物質(zhi)三(san)(san)；

物質四的(de)合成：向(xiang)反應瓶中加入(ru)物質三(san)、醋酐，控(kong)制溫度為-12℃，滴加質量(liang)濃度為90％的(de)發煙硝酸反應，反應完畢，升至25℃，倒入(ru)冰水(shui)中，冰水(shui)的(de)體積為反應液(ye)5-10倍(bei)，過濾，先用1～5％碳酸氫鈉溶(rong)液(ye)洗，再用冰水(shui)洗，干(gan)燥得物質四；

物質(zhi)五的(de)合成(cheng)：向(xiang)反(fan)應瓶中加(jia)入乙醇、水、醋酸、鐵粉、氯化銨和物質(zhi)四(si)，回流反(fan)應，再加(jia)入乙醇，第二次加(jia)入乙醇的(de)質(zhi)量(liang)為物質(zhi)四(si)的(de)5倍(bei)，趁熱(re)過濾(lv)，濾(lv)液冷(leng)卻至25℃，倒(dao)入冰水中，冰水的(de)體(ti)積為濾(lv)液的(de)10倍(bei)，過濾(lv)，水洗，干燥得物質(zhi)五；

物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)七(qi)的合成：向反(fan)(fan)應瓶中(zhong)加入物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)五、物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)六、二甲基甲酰胺(an)、碳(tan)酸鉀，反(fan)(fan)應，冷卻至25℃，將反(fan)(fan)應液加入到冰水中(zhong)，冰水的質(zhi)(zhi)量為反(fan)(fan)應液的10倍，過濾，水洗，干(gan)燥(zao)得物(wu)(wu)質(zhi)(zhi)七(qi)。

物質(zhi)八(ba)的合成：向(xiang)反應(ying)瓶(ping)中(zhong)(zhong)加入物質(zhi)七和(he)吡(bi)啶(ding)的混合物，再滴加三氯(lv)(lv)氧磷，升溫反應(ying)，將反應(ying)液冷卻(que)，加入氯(lv)(lv)仿，攪拌，冷卻(que)，加入冷水，分(fen)出有機相，冷水洗氯(lv)(lv)仿層為中(zhong)(zhong)性，濃縮除(chu)去氯(lv)(lv)仿，干燥得(de)物質(zhi)八(ba)。

化合物I的合成(cheng)：將二(er)甲基甲酰胺、物質八(ba)、碳酸鉀和物質九依(yi)次(ci)加到反(fan)應(ying)瓶中(zhong)，加熱反(fan)應(ying)，冷卻，將反(fan)應(ying)液倒入水中(zhong)，抽濾，濾餅用水淋洗，干(gan)燥得化合物I。

所述(shu)物(wu)質(zhi)二、質(zhi)量濃度37％的甲醛(quan)水溶液、物(wu)質(zhi)一(yi)、氫氧化鈉(na)和(he)乙(yi)醇的質(zhi)量比為1:1:1:1:5，25℃下(xia)反(fan)應2時(shi)。

所述物質三(san)、醋酐(gan)、硝酸的質量比為1:0.5:0.5，在-5℃下反應4小時(shi)。

所述物質四、乙醇、水、醋酸、鐵粉、氯化銨質量(liang)比為1:2.5:2:0.05:1:0.02，回流反應2小時。

所述物質五、物質六、碳酸鉀、二甲基甲酰胺的(de)摩(mo)爾比為1:1:1:10，升溫至80℃反應4小時。

所述物質七(qi)、吡啶、三氯(lv)(lv)氧磷的(de)(de)摩(mo)爾比為(wei)1:1:1.5，加(jia)畢，升溫至100℃反應(ying)3小時，將反應(ying)液冷(leng)(leng)卻至50℃，加(jia)入氯(lv)(lv)仿(fang)，氯(lv)(lv)仿(fang)的(de)(de)體積為(wei)吡啶的(de)(de)40倍，攪拌1小時，冷(leng)(leng)卻至0℃，加(jia)入5℃的(de)(de)冷(leng)(leng)水，冷(leng)(leng)水的(de)(de)體積為(wei)氯(lv)(lv)仿(fang)的(de)(de)0.6倍，分出有機相，冷(leng)(leng)水洗(xi)氯(lv)(lv)仿(fang) 層為(wei)中性，濃縮除去(qu)氯(lv)(lv)仿(fang)，干燥得物質八。

所述物(wu)質八、物(wu)質九、碳酸鉀、二(er)甲基甲酰胺(an)的(de)(de)摩爾比為(wei)(wei)1:2:2:20，加熱至50℃，反應1h，冷卻，將反應液倒入水(shui)中，水(shui)的(de)(de)體積(ji)為(wei)(wei)反應液的(de)(de)10倍，抽濾，濾餅用水(shui)淋洗，干燥得化(hua)合物(wu)I。

實施例9

合成化合物II的方(fang)法，所述合成路線如下：

其中：

物質十二的合成：將物質十、物質十一、POCl₃加入裝有回流冷凝管的圓底燒瓶中，將圓底燒瓶放置于超聲清洗儀中反應，減壓蒸出剩余的POCl₃，殘余物(wu)傾倒于碎冰中，碎冰質量為(wei)殘余物(wu)的20倍(bei)，析出沉(chen)淀(dian),抽(chou)濾，固(gu)體用1～5％的NaOH溶液洗(xi)滌，水洗(xi)至中性，得物(wu)質十二；

物(wu)(wu)質十三(san)的(de)合成：反(fan)應瓶中加(jia)(jia)入二氯甲烷和物(wu)(wu)質十二，鹽冰(bing)浴冷卻至(zhi)-15℃，避光，氮氣保(bao)護下，逐滴加(jia)(jia)入20wt％三(san)溴(xiu)化硼的(de)無(wu)水二氯甲烷溶(rong)液，滴加(jia)(jia)完后，升溫反(fan)應，反(fan)應結(jie)束后將反(fan)應液倒(dao)入冰(bing)水中，冰(bing)水的(de)質量為(wei)反(fan)應液的(de)5倍，分出有機相，水相用(yong)乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯萃取三(san)次，每次乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯的(de)體積(ji)為(wei)水相的(de)0.5倍，合并有機相，有機相用(yong)硫酸(suan)鈉干燥，蒸出溶(rong)劑，得物(wu)(wu)質十三(san)；

物(wu)(wu)質(zhi)十四的合(he)成(cheng)：將氯乙酸(suan)與(yu)5wt％氫氧化(hua)鈉(na)水溶液(ye)(ye)混合(he)得(de)溶液(ye)(ye)A，將物(wu)(wu)質(zhi)十三與(yu)5wt％氫氧化(hua)鈉(na)水溶液(ye)(ye)混合(he)得(de)溶液(ye)(ye)B，將溶液(ye)(ye)A加(jia)入到反(fan)應瓶(ping)中，再滴加(jia)溶液(ye)(ye)B，滴加(jia)完畢，升(sheng)溫反(fan)應，冷(leng)卻，加(jia)5wt％鹽酸(suan)酸(suan)化(hua)至pH＝1，過濾、洗(xi)滌、干燥(zao)得(de)物(wu)(wu)質(zhi)十四；

物(wu)質(zhi)十(shi)五的合(he)成：在反(fan)應瓶中裝(zhuang)有攪拌棒、溫(wen)度計，回流冷凝管，其回流冷凝管連接氯(lv)化(hua)氫吸收裝(zhuang)置(zhi)，依次加(jia)入(ru)氯(lv)化(hua)亞砜和(he)物(wu)質(zhi)十(shi)四(si)，攪拌升溫(wen)反(fan)應，減壓(ya)蒸出(chu)低沸物(wu)，瓶內殘余(yu)物(wu)即為物(wu)質(zhi)十(shi)五，不經(jing)分離(li)直接用(yong)于下步(bu)反(fan)應；

化合(he)物(wu)II的(de)合(he)成：在反應(ying)瓶中加入(ru)上步(bu)制得的(de)物(wu)質十五，再加入(ru)三乙胺、二氯甲烷和物(wu)質十六(liu)，攪拌反應(ying)，減壓蒸出溶劑(ji)，冷(leng)卻，過濾，水洗(xi)，丙酮洗(xi)得化合(he)物(wu)II。

所述物質十、物質十一、POCl₃的質量比為1:1:3，超(chao)(chao)聲清洗儀中(zhong)反應溫度為50℃，功(gong)率為350W，超(chao)(chao)聲作用60分鐘。

所述二(er)氯甲烷、物質十二(er)、20wt％三(san)溴(xiu)化硼(peng)的(de)二(er)氯甲烷溶液的(de)質量比為20:1:6，升溫至25℃，25℃下反應2小時。

所(suo)述溶液(ye)A中(zhong)(zhong)氯乙酸(suan)與(yu)(yu)(yu)氫氧化(hua)鈉的(de)摩(mo)爾比為1:1，所(suo)述溶液(ye)B中(zhong)(zhong)物質(zhi)十三與(yu)(yu)(yu)氫氧化(hua)鈉的(de)摩(mo)爾比為1:1，將溶液(ye)A加入到反應(ying)(ying)瓶中(zhong)(zhong)，再滴加溶液(ye)B，加入到反應(ying)(ying)瓶中(zhong)(zhong)的(de)物質(zhi)十三與(yu)(yu)(yu)氯乙酸(suan)的(de)摩(mo)爾比為1:1，升溫(wen)至60℃反應(ying)(ying)1小時(shi)，冷(leng)卻至25℃。

所述物質(zhi)十四與氯化亞砜的摩爾比為1:1，攪拌升溫至(zhi)60℃，在(zai)60℃下(xia)反應(ying)5小時(shi)。

所述物質十(shi)五(wu)、物質十(shi)六、三乙胺和二(er)氯甲烷(wan)的摩(mo)爾比(bi)1:1:1:5，在0～25℃攪拌(ban)2小時。

實施例10

合成化合物III的(de)方法，所述合成路線如下：

其中：

物(wu)(wu)質十八的合成：將物(wu)(wu)質十七、KOH、水、二硫化碳加入到反應瓶(ping)，，加熱至 回流，反應2小時，冷至25℃，過濾，濾液用(yong)1wt％鹽酸調節pH值析出物(wu)(wu)質十八，過濾、洗滌、干燥得物(wu)(wu)質十八；

物(wu)質(zhi)二十(shi)(shi)的(de)合成：向反(fan)應瓶中(zhong)加(jia)入(ru)物(wu)質(zhi)十(shi)(shi)八(ba)、物(wu)質(zhi)十(shi)(shi)九、甲苯和(he)碳酸鉀(jia)，回流反(fan)應，冷卻過濾，用二氯(lv)甲烷(wan)(wan)洗固體，濾液(ye)減壓濃縮(suo)，殘留物(wu)用硅膠(jiao)層析，己烷(wan)(wan)-乙酸乙酯洗脫(tuo)，得(de)物(wu)質(zhi)二十(shi)(shi)。

化合(he)(he)物(wu)III的(de)合(he)(he)成：向反應瓶中加入(ru)物(wu)質二十、4-氟芐氯、NaOH、乙腈，回流反應，冷(leng)卻(que)，減壓(ya)蒸出溶劑(ji)得殘(can)留物(wu)，殘(can)留物(wu)用乙酸乙酯(zhi)萃(cui)取三次，每次乙酸乙酯(zhi)的(de)體積為殘(can)留物(wu)的(de)2倍，有機相水(shui)(shui)洗，再用無水(shui)(shui)硫酸鈉干燥，過(guo)濾(lv)，濾(lv)液減壓(ya)蒸出溶劑(ji)得粗品，粗品以乙腈重結晶得化合(he)(he)物(wu)III。

所述(shu)物(wu)質(zhi)十七、二(er)硫化碳、KOH、水(shui)的(de)摩爾比為(wei)1:1:1:5。

所述物(wu)質十八、物(wu)質十九、碳酸鉀、甲苯的摩爾(er)比(bi)為1:1:1:5，回流反(fan)應，冷卻，所述己烷-乙酸乙酯體積(ji)比(bi)為2:1。

所(suo)述物質二十合成中回(hui)流反應時(shi)間為4小時(shi)，冷卻至25℃。

所述物質二十、4-氟芐氯、NaOH、乙腈(jing)的摩爾(er)比為(wei)1:1:1:10，回流反應(ying)4小時。

實施例11

合(he)成化合(he)物V的工藝，所(suo)述合(he)成路線如(ru)下：

其中：

物質(zhi)(zhi)二十(shi)八的合成：將物質(zhi)(zhi)二十(shi)六和物質(zhi)(zhi)二十(shi)七加入(ru)干燥圓(yuan)底燒瓶中(zhong)，升(sheng)溫進行攪拌反應，薄層色(se)譜(pu)跟(gen)蹤(zong)反應至原(yuan)料消失，將混合物冷卻至25℃，倒入(ru)冰水混合物中(zhong)，過(guo)濾，水洗，氯仿(fang)洗，得物質(zhi)(zhi)二十(shi)八；

物質(zhi)二十九的合成(cheng):反(fan)應(ying)(ying)瓶中(zhong)加(jia)入(ru)(ru)依次乙醚(mi)、氫化(hua)鋰鋁，攪拌(ban)溶解(jie)，冰水浴(yu)冷卻(que)至(zhi)0℃，再緩慢加(jia)入(ru)(ru)物質(zhi)二十八，加(jia)料完畢，冰水浴(yu)下反(fan)應(ying)(ying)，將反(fan)應(ying)(ying)液(ye)倒入(ru)(ru)冰水中(zhong)， 靜置讓沉淀物停(ting)在(zai)底部，過濾(lv)，氯仿(fang)洗濾(lv)渣，濾(lv)液(ye)分出有機(ji)相，水相以氯仿(fang)萃取三次，有機(ji)相合并，減壓(ya)濃縮(suo)得物質(zhi)二十九。

化合(he)物(wu)V的(de)(de)(de)合(he)成：在反(fan)應中加(jia)(jia)入物(wu)質(zhi)二(er)十九、三(san)乙胺、二(er)氯甲(jia)(jia)烷和物(wu)質(zhi)三(san)十，攪拌(ban)反(fan)應，濃縮除(chu)去二(er)氯甲(jia)(jia)烷，然后加(jia)(jia)水，加(jia)(jia)水質(zhi)量(liang)為濃縮物(wu)的(de)(de)(de)10倍，用(yong)氯仿(fang)萃取(qu)三(san)次，萃取(qu)劑氯仿(fang)每次用(yong)量(liang)為前(qian)述所加(jia)(jia)水的(de)(de)(de)體(ti)積的(de)(de)(de)1倍，有機(ji)相合(he)并，減(jian)壓濃縮得(de)(de)粗品，粗品用(yong)氯仿(fang)重結(jie)晶得(de)(de)化合(he)物(wu)V。

所述(shu)物質二十六(liu)、物質二十七的摩爾比為(wei)1:1.，升(sheng)至80℃進行攪拌反應，所述(shu)冰(bing)水混合物的質量為(wei)物質二十六(liu)的5倍。

所述(shu)物質(zhi)二十八、氫化(hua)鋰鋁、乙醚(mi)的(de)質(zhi)量(liang)比為(wei)(wei)1:0.5:15，加料速度以微回流為(wei)(wei)宜，所述(shu)冰水(shui)浴下反(fan)應(ying)1.5小時，將反(fan)應(ying)液倒(dao)入冰水(shui)中，冰水(shui)的(de)體積為(wei)(wei)反(fan)應(ying)液的(de)1倍，萃(cui)取劑(ji)氯(lv)仿每(mei)次(ci)用量(liang)為(wei)(wei)水(shui)相體積的(de)1倍。

所述物質二十九、物質三(san)十、三(san)乙胺和二氯甲烷的摩爾比為1:1:1:10，25℃攪拌(ban)1.5小時。

上述的(de)實施(shi)例僅為(wei)本發(fa)明的(de)優選技(ji)術(shu)方案(an)(an)，而(er)不(bu)應(ying)視(shi)為(wei)對于本發(fa)明的(de)限制，本申請(qing)中的(de)實施(shi)例及實施(shi)例中的(de)特征在不(bu)沖突(tu)的(de)情況(kuang)下，可以相互任意組合。本發(fa)明的(de)保(bao)護范(fan)圍(wei)應(ying)以權(quan)利(li)(li)要求記載(zai)的(de)技(ji)術(shu)方案(an)(an)，包(bao)括權(quan)利(li)(li)要求記載(zai)的(de)技(ji)術(shu)方案(an)(an)中技(ji)術(shu)特征的(de)等(deng)同替換方案(an)(an)為(wei)保(bao)護范(fan)圍(wei)。即在此范(fan)圍(wei)內(nei)的(de)等(deng)同替換改進，也在本發(fa)明的(de)保(bao)護范(fan)圍(wei)之內(nei)。