本發明涉及植物生物
技術領域：
，具體涉及一種象草維管組織特異性啟動子及其應用。
背景技術：
：啟動子是指能與RNA聚合酶作用并能起始轉錄的一段DNA序列，被稱為調控基因表達的樞紐，它能夠控制基因的表達水平、表達部位及表達方式。為了克服組成性啟動子，如花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35spromoter)、激動蛋白啟動子(Actinpromoter)和玉米泛素啟動子(Ubiquitinpromoter)，在植物體內持續、高效表達時，對植物造成生長發育造成的不利影響。組織特異性或誘導性啟動子的研究和應用越來越受到科研工作者的重視，通過組織特異性或誘導性啟動子，不僅能控制基因的精確表達，而且還能避免過量表達對轉基因植株的負面影響。組織特異性啟動子是在植物的綠色組織(葉片)、分生組織(莖尖、根尖、幼芽)、維管組織(韌皮部、木質部及塊莖)、薄壁組織、花粉、種子、果實和胚乳等組織中特異表達的啟動子。它能夠驅動外源基因在特定時間、特定部位表達積累，增加區域表達量，往往表現出發育調節的特性。其中維管組織特異性啟動子主要分為韌皮部特異性啟動子和木質部特異性啟動子。韌皮部在植物體內，是負責運輸有機物質的主要部位，富含糖等，因此成為細菌、真菌、病毒等植物病源和刺吸式昆蟲的侵害目標。韌皮部特異啟動子可以為抗病蟲作物的生物技術育種提供啟動元件。木質部是運輸水分、無機離子的主要部位，起到支撐植物的作用。木質部特異啟動子在深入了解木材形成過程中的分子機制和材性改良的基因工程育種中有重要意義。象草是熱帶亞熱帶地區的優良飼草，適口性好，利用率高。而且還能代替煤炭石油發電，種植1公頃的象草燃料產生的能量可替代36桶石油。但是象草中，木質素含量過高，影響反芻動物，如牛的消化速率，從而不利于牲畜增重。木質素同時也是制漿造紙工業的限制因素，因為要將木質素去除之后，才能獲得純的纖維素和半纖維素進行造紙。因此，木質素的調控是牧草或能源草培育的方向之一。通過維管組織特異性啟動子特異啟動外源基因控制在維管中的表達具有重要的理論和實踐意義。技術實現要素：本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種象草維管組織特異性啟動子，該啟動子可應用于植物特定組織表達，從而為植物的轉基因育種提供有效的手段和工具。本發明的另一目的在于提供所述的啟動子的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現：一種象草維管組織特異性啟動子，選自如下任一序列：(a)含有如SEQIDNO.1～9任一所示的核苷酸序列，或具有與SEQIDNO.1～9任一所示序列互補的核苷酸序列；(b)凡是經過人工修飾的，與SEQIDNO.1～9任一所示的核苷酸序列具有至少75％同源性的核苷酸序列。所述的啟動子從象草中克隆獲得，或通過人工合成方法獲得。所述的維管組織特異性表達啟動子在植物維管組織特異性表達調控基因中的應用。所述的植物優選為煙草。所述的應用包括用所述的象草維管組織特異性啟動子轉化植物、并通過損傷和激素處理來鑒定該象草維管組織特異性啟動子的調控機制，為該啟動子的應用奠定了基礎。一種表達載體，含有上述象草維管組織特異性啟動子。所述的表達載體，是將上述象草維管組織特異性啟動子替換雙元表達載體pCAMBIA1305.1的CaMV35S啟動子獲得。一種轉基因細胞，是將上述象草維管組織特異性啟動子或上述表達載體轉入宿主細胞獲得。所述的宿主細胞為根癌農桿菌細胞。所述的根癌農桿菌細胞優選為EHA105細胞。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：1、本發明提供一種從象草中克隆獲得的維管組織特異性表達啟動子，該啟動子可應用于植物特定組織表達，并可以應用于調控植物基因表達中，從而為植物的轉基因育種提供有效的手段和工具。該啟動子主要能驅動基因在植株的成熟時期表達。其中，具有296bp啟動子的片段的染色部位主要是初生木質部；隨著片段長度的增加，染色部位向兩端延展；由內向外，染色部位逐漸覆蓋至維管形成層及韌皮部，自外向內染色效果蔓延至髓細胞中；具有1154bp啟動子片段的GUS染色最深，且覆蓋面積最廣。2、本發明用構建好的植物表達載體轉化煙草、并通過損傷和激素處理來鑒定該維管組織特異性啟動子的調控機制，為該啟動子的應用奠定了基礎。附圖說明圖1為第一次hi-TAILPCR的第1輪TAILPCR和第2輪TAILPCR擴增得到的產物檢測結果圖；其中，M表示DNAmarkerDL2000，1st表示引物Hi-CADR1-1與AC1的第1輪TAILPCR擴增條帶，2ed表示引物Hi-CADR1-2與AC1的第2輪TAILPCR擴增條帶。圖2為第二次hi-TAILPCR的第1輪TAILPCR和第2輪TAILPCR擴增得到的產物檢測結果圖；其中，M表示DNAmarkerDL2000，1st表示引物Hi-CADR2-1與AC1的第1輪TAILPCR擴增條帶，2ed表示引物Hi-CADR2-2與AC1的第2輪TAILPCR擴增條帶。圖3為啟動子缺失片段的克隆檢測結果圖；其中，M表示DNAmarkerDL5000；泳道1～9分別對應181～2054bp的啟動子片段。圖4為CADP-181啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有181bp啟動子片段的陽性質粒。圖5為CADP-296啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有296bp啟動子片段的陽性質粒。圖6為CADP-645啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有645bp啟動子片段的陽性質粒。圖7為CADP-758啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有758bp啟動子片段的陽性質粒。圖8為CADP-936啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有936bp啟動子片段的陽性質粒。圖9為CADP-1154啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有1154bp啟動子片段的陽性質粒。圖10為CADP-1340啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有1340bp啟動子片段的陽性質粒。圖11為CADP-1565啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有1565bp啟動子片段的陽性質粒。圖12為CADP-2054啟動子轉化煙草的GUS染色及PCR鑒定結果圖；其中，CK+是含有2054bp啟動子片段的陽性質粒。圖13為啟動子不同缺失片段轉化煙草的GUS酶活性測定結果圖；其中，WT表示野生型；CADP-181～CADP-2054表示缺失片段表達載體。圖14為轉基因煙草組培苗莖的GUS組織化學染色結果圖；其中，WT表示野生型；a～i分別代表轉化自缺失片段載體CADP-181、CADP-296、CADP-645、CADP-758、CADP-936、CADP-1154、CADP-1340、CADP-1565和CADP-2054的煙草莖；Ph表示韌皮部；Ca表示形成層；SX表示次生木質部；PX表示初生木質部；Pi表示髓；標尺為200μm。圖15為啟動子對損失及激素的響應效果圖；其中，WT表示野生型；CK表示空白對照(無處理)；虛線框中的葉片在理論上有響應；“*”為與對照相比有明顯響應的葉片。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例11材料1.1植物材料：象草取自華南農業大學草業科學系引種園。2方法2.1維管組織特異性表達啟動子的獲得按照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取象草基因組DNA，采用hi-TAILPCR的方法，對PpCAD(華南象草肉桂醇脫氫酶)基因ATG上游2054bp啟動子序列(命名為PpCADPRO的啟動子區域)進行克隆，用4條上游簡并引物LAD(1/2/3/4)，1條上游通用引物AC1和3條靠PpCAD基因5’端的下游同向特異性引物Hi-CADR1-0、Hi-CADR1-1和Hi-CADR1-2進行三輪巢式PCR擴增。根據第1次hi-TAILPCR得到的序列，再次設計3條靠近5’端的特異性下游引物Hi-CADR2-0、Hi-CADR2-1和Hi-CADR2-2以相同方法進行3輪擴增。PCR的引物序列如表1所示，PCR反應程序如表2所示，第1次hi-TAILPCR的過程如表3所示，第2次hi-TAILPCR的過程基本同表3，區別僅在于所使用的引物為Hi-CADR2-0、Hi-CADR2-1和Hi-CADR2-2。PCR反應結束之后，經過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測每一輪PCR產物，將第1次hi-TAILPCR和第2次hi-TAILPCR中得到最長的產物(即第1次hi-TAILPCR中用LAD4得到的產物(約900bp)和第2次hi-TAILPCR中用LAD2得到的產物(約1400bp))回收，連接至載體19-Tvector(寶生物工程大連有限公司)上T-克隆后送測序，并將測序結果進行拼接，共得到2300bp啟動子序列，設計上游引物F1和下游引物R1再次擴增啟動子序列，回收產物連接至載體19-Tvector(寶生物工程大連有限公司)上，得到T-PpCADPRO質粒，并送公司進行測序。測序后，除去5’端部分峰值不穩定的區域，最終得到2054bp的啟動子片段。表1hi-TAILPCR中的引物引物名稱引物序列(5’-3’)LAD1ACGATGGACTCCAGAGVNVNNNGGAALAD2ACGATGGACTCCAGAGBNBNNNGGTTLAD3ACGATGGACTCCAGAGVVNVNNNCCACLAD4ACGATGGACTCCAGAGBDNBNNNCCAAHi-CADR1-0AAAAATGACTGCGCGAGGGAATGCHi-CADR1-1ACGATGGACTCCAGTCCGATCGAGCAGGAAGGGGAAGGACGHi-CADR1-2GGTGTAGGTGTAGGGGGAGAGGTGGHi-CADR2-0AGCTGGGATTTGATAGGCACTTTGCHi-CADR2-1ACGATGGACTCCAGTCGGGTGGGGGGGCTGTTACCATCCTGHi-CADR2-2GGTTGACAGCTGGTTGAGCAAGCCCAC1ACGATGGACTCCAGAGF1GGTCGTGTCGTATTTTCTTR1CCTTCGGTGTGAGACCGGCC注：V＝A/C/G，N＝A/C/G/T，B＝C/G/T，D＝A/G/T表2hi-TAILPCR反應程序表3hi-TAILPCR反應體系2.2啟動子基因序列分析利用DNAman對測序結果進行整理，采用在線分析軟件NeuralNetworkPromoterPrediction(//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)分析轉錄起始位點，經同源性比較后，在PlantCARE(//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)和PLACE(//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)中分析順式作用元件。2.3啟動子缺失片段載體構建根據順式作用元件分析結果，對啟動子進行分段。通過設計含有XbaI和BglII兩個酶切位點將分段的啟動子片段替換pCAMBIA1305.1(北京天恩澤基因科技有限公司，細菌篩選標記為Kan，植物篩選標記為抗Hpt基因)的CaMV35S啟動子，構建了PpCADPRO啟動子的缺失表達載體。其中，PpPro-Bg-R為帶有BglII酶切位點且緊接起始密碼子ATG的下游引物，PpPro-Xba-F1～PpPro-Xba-F9為帶有XbaI酶切位點的上游引物。以T-PpCADPRO質粒為模板，進行PCR，得到的產物經XbaI和BglII雙酶切后，再與經XbaI和BglII雙酶切后的pCAMBIA1305.1通過T4DNA連接酶連接，連接液涂布于含50μg/ml的卡那霉素LB平板上，長出的克隆再通過表4中的引物進行進一步鑒定，最后提取質粒通過XbaI和BglII雙酶切鑒定，得到分別含有9個不同長度的啟動子片段的重組載體。表4啟動子缺失片段載體構建中的引物引物名稱引物序列(5’-3’)PpPro-Bg-RGAAGATCTCCTTCGGTGTGAGACCGGCCPpPro-Xba-F1GCTCTAGAGCGCTCCTCCCCACTCTCCTPpPro-Xba-F2GCTCTAGAGATCCTCTGCAGTCGACTGCPpPro-Xba-F3GCTCTAGACCAGTGGTGCATGTTATCAGPpPro-Xba-F4GCTCTAGATGGCTCCGCCGCTACAGCTPpPro-Xba-F5GCTCTAGACTGGGCTTGCTCAACCAGCTPpPro-Xba-F6GCTCTAGATCCAGCAAGTACAAACCTAAPpPro-Xba-F7GCTCTAGATGAACGATTGGAGGCCATGCPpPro-Xba-F8GCTCTAGATGTGGCTATTGGAAATTTGAPpPro-Xba-F9GCTCTAGAAGCTAGTATTACGTGGGGTC2.4煙草的遺傳轉化將構建好的9個重組載體分別采用凍融法轉入農桿菌EHA105中，以K326煙草作為植物材料，采用葉盤法，將表達載體通過農桿菌侵染法轉入煙草中。2.5轉基因煙草鑒定待煙草生長，并生長成為成熟植株時，通過PCR鑒定和GUS組織化學染色的方法對轉基因植株進行鑒定。PCR鑒定所用引物為表4中的引物。2.6轉基因煙草的GUS組織化學染色為探究不同啟動子片段的表達特異性及表達差異，對9個PpCADPRO基因啟動子缺失片段的煙草組培苗經行了GUS組織化學染色。2.7轉基因煙草對損失及激素的響應在轉基因煙草移栽1個月后，挑選含有不同缺失片段但長勢一致的轉基因苗進行生物與非生物處理的響應實驗。設置1/10(MS液體培養基稀釋10倍)MS液體培養基即空白處理、鑷子刺傷葉盤、100μmol/LGA(赤霉素)、100μmol/LMeJA(茉莉酸甲酯)、100μmol/LABA(脫落酸)共5個處理，采用24孔培養板，在不同培養孔中對煙草進行培養24h，每個處理孔中的液體培養基為3mL。處理后的葉片立即進行GUS染色處理，觀察不同缺失片段啟動子對非生物脅迫的響應。3結果與分析3.1PpCADPRO啟動子的克隆以象草基因組為模板，經過兩次hi-TAILPCR，最終得到PpCAD基因ATG上游2054bp啟動子序列(如SEQIDNO.1所示)，命名為PpCADPRO。采用在線分析軟件線NeuralNetworkPromoterPrediction預測該啟動子的轉錄起始位點為A，位于ATG上游156bp處。包含17個TATA-box和12個CAAT-box。此外，還有AC-Ielement、CAT-box、CGTCA-motif、GARE-motif、ABRE、CCAATBOX1、ARE、W-box等多個順式作用元件。3.2啟動子缺失片段載體構建根據啟動子分析結果，對PpCADPRO進行分段，根據表4中的引物進行PCR反應，可獲得大小分別為181bp(如SEQIDNO.2所示)、296bp(如SEQIDNO.3所示)、645bp(如SEQIDNO.4所示)、758bp(如SEQIDNO.5所示)、936bp(如SEQIDNO.6所示)、1154bp(如SEQIDNO.7所示)、1340bp(如SEQIDNO.8所示)、1565bp(如SEQIDNO.9所示)和2054bp的9個片段(圖3)。片段兩端帶有BglII和Xba兩個酶切位點，進行雙酶切，將9個啟動子片段分別替換pCAMBIA1305.1的CaMV35S啟動子，以驅動GUS基因的表達，這九個重組載體分別命名為CAD-181、CAD-296、CAD-645、CAD-758、CAD-936、CAD-1154、CAD-1340、CAD-1565、CAD-2054。3.3煙草的遺傳轉化與鑒定通過凍融法將構建好的9個載體轉化農桿菌感受態EHA105，并活化陽性菌落作為種質液，擴繁后侵染煙草葉盤。待轉基因苗移栽后，分別取每個轉基因植株的葉片進行GUS預染色。鑒定結果顯示(圖4～12)，CADP-936(缺失片段表達載體)的全部22株轉基因植株葉片均能被GUS染色，但CADP-2054有7株植株葉片不能被染色，約占植株總數的30％。此外，CADP-181、CADP-758和CADP-1154分別有5株、4株和3株不能被染色，約占植株總數的23％、21％和8％。CAD-296、CADP-645、CADP-1340和CADP-1565都有2株不能被染色，分別占植株總數的11％、15％、8％和9％。挑選生長一致，GUS預染色結果為陽性的煙草植株，進行PCR鑒定。結果表明，在所挑選的GUS預染色為陽性的轉基因植株中，都能擴增出與對照大小一致的片段)，證明9個PpCADPRO啟動子缺失片段載體成功轉化到煙草中。選擇不同3個生長時期的9個PpCADPRO缺失片段轉化煙草后基部莖(第3節以下)進行GUS酶活性的檢測，評價不同缺失片段啟動效率。在生長時期為3個月時，轉不同長度的啟動子的煙草GUS酶活性都達到最高，當PpCADPRO啟動子的長度為1154bp時，啟動效率最高(圖13)。說明PpCADPRO啟動子在植物發育的前期啟動效率不高，它主要能驅動基因在植株的成熟時期表達。3.4轉基因煙草的GUS染色差異分析煙草組培苗的莖在經過GUS染色后也表現出不同的著色差異，且這些差異還體現在橫切面的著色部位上(圖14)。對照(野生型)沒有著色，具有181bp啟動子片段的莖著色效果也不明顯，只能在初生木質部附近檢測到輕微的GUS活性；除了181bp以外，所有片段的木質部都能被GUS染色，但隨著片段長度的改變，著色的位置和強度也發生著變化。具有296bp啟動子的片段的染色部位主要是初生木質部；隨著片段長度的增加，染色部位向兩端延展。由內向外，染色部位逐漸覆蓋至維管形成層及韌皮部；自外向內染色效果蔓延至髓細胞中；具有1154bp啟動子片段的GUS染色最深，且覆蓋面積最廣。3.5啟動子不同缺失片段對損傷及激素的響應對葉片處理的5個外界因素分別為機械損傷、100μmol/LGA、100μmol/LMeJA和100μmol/LABA。含有長度為645bp以上的啟動子缺失片段在損傷處理后表現出較高的GUS活性；含有長度為758bp以上的啟動子缺失片段在GA理后表現出較高的GUS活性；含有長度為1340bp以上的啟動子缺失片段在MeJA處理后表現出較高的GUS活性；只有全長啟動子表現出對ABA的相應(圖15)。說明PpCADPRO啟動子序列中的確含有對外界響應的順式作用元件，響應不同外界因素的啟動子片段和預測結果基本一致。而且，啟動子對外界的響應可能是元件本身與其它增強或抑制表達元件共同作用的結果。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3