抑制肽對治療炎性疾病的用圖
【專利說明】抑制化對治療炎性疾病的用途
[0001] 發明領域和發明背景 本發明設及可W用來防止蛋白質核轉位的膚，作為轉位至細胞核的方式，所述蛋白質 天然地與Imp7締合。所述膚可W用于治療炎性疾病和免疫疾病。進一步的，所述膚可W用于 促進蛋白質和其他化合物核轉位至細胞核中（當其連接于其時）。
[0002] 為確保精確的細胞功能，蛋白質的空間分布需要緊密調節與協調。運在許多信號 蛋白質上特別明顯，所述蛋白質受到細胞外刺激后顯著地并迅速地改變他們的定位。為了 維持運樣的調節，細胞核通過雙層膜包膜從細胞質中分離，其允許通過特異性核孔復合體 (NPC)具有蛋白質的選擇性入口。核定位的選擇性主要由核內蛋白序列內含有的核定位信 號（化S)介導[G. Schlenste化，陽BS Lett 389,75 (Jun 24,1996)]。
[0003] 迄今鑒定的主要類型的化S是由堿性氨基酸構成的，所述氨基酸是通過NPC進入的 原理所需的。運些堿性序列有兩種：（i)五至六個堿性氨基酸的單一延伸，例如猴腎病毒（ SV) 40大T抗原化S;與（ii)二分的化S，其由兩個堿性氨基酸、10 - 12個氨基酸的間隔區 和其中五個氨基酸中的Ξ個必須是堿性的一個簇構成。該類型的代表是核質蛋白。為了使 化S -介導的核輸入發生，NLS首先與細胞質輸入-受體蛋白質輸入蛋白α和β締合，使其停靠 (docking)在核膜孔的細胞質側[Ε. J. Tran,S. R. Wente，Cell 125,1041 (Jun 16， 2006)]。通過核膜孔的移動是由小GTP酶Ran調節，所述GTP酶Ran在其GTP -結合狀態促進 輸入的蛋白質從輸入蛋白上的解離并使其回收返回細胞質[J. Moroianuij Cell Biochem Suppl 32-33,76 (1999)]〇
[0004] 然而，不是所有的細胞-核穿梭蛋白質都含有規范的NLS，因此使用其他的，不依賴 化S使他們的通過NPC的通道機制。一些表征的不依賴化S的機制包括小蛋白質（<30 - 40 kDa)的被動擴散、特殊核引導基序（distinct nuclear-directing motif)[D. 化1'131:09116，〔.化1'131:09116-化661'1：113，13.?;[油0]1，〔6115;[即日1 12,337 (1日7,2000)]、與 含化S的蛋白質的相互作用，或可選地，與核膜孔蛋白質（NUP)的直接相互作用；[L. Xu，J. Massague，化t Rev Mol Cell Biol 5,209 (Mar,2004)]。然而，通過運些機制的穿梭和核 保留的動力學通常太慢W至于不能及時進行瞬時轉錄，且因此允許信號蛋白在刺激后迅速 和可逆的不依賴NLS轉位的分子機制仍然是不清楚的。
[000引 畑uderland等人，2008，M01 Cell 31,850-861 和 Plotnikov等人，2011，Mol 0611810131，3515-3530教導了6版1/2轉位設及0(2-介導的6版1/2。核轉運信號（ NTS)中的兩個絲氨酸殘基的憐酸化作用。該憐酸化作用允許與Imp7相互作用，其進一步促 進邸K1 / 2通過核膜孔穿梭。
[0006] 調節生物學組分的細胞定位的能力對于許多功能如調節核酸表達、真核細胞轉 染，基因治療、保護免受有毒化學品侵害W及運輸抗癌劑是重要的。因此廣泛意識到鑒定能 調節核轉運的新型序列是需要的，且是非常有利的。
[0007] 另外的【背景技術】包括美國專利申請號20100099627。
[000引發明概述 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了一種經分離的膚，其包含與SEQ ID NO : 1 ( PERYQNLSPV)至少80 %同源的氨基酸序列，所述經分離的膚包含核祀向活性，所 述膚長度不超過20個氨基酸。
[0009] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了一種經分離的膚，其包含與SEQ ID NO : 1 (陽RYQNLSPV)至少80 %同源的氨基酸序列，所述經分離的膚能夠防止Ρ38α核 轉位，所述膚長度不超過20個氨基酸。
[0010] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了在受試者中治療炎癥性或免疫 病癥的方法，所述方法包含對受試者施用治療有效量的本文描述的經分離的膚，從而治療 炎性疾病或免疫疾病。
[0011] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了一種物質組合物，其包含本文 描述的經分離的膚W及通過接頭與所述膚的氨基酸序列連接的異源物質。
[0012] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了一種經分離的多核巧酸，其包 含能夠編碼本文描述的膚的核酸序列。
[0013] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了一種核酸構建體，其包含本文 描述的經分離的多核巧酸。
[0014] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了將物質祀向至宿主細胞的細胞 核的方法，所述方法包括將物質導入宿主細胞中，所述物質連接于本文描述的膚上。
[001引根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了將物質祀向至宿主細胞的細胞 核的方法，所述方法包括將本文描述的膚引入宿主細胞，所述膚連接至能夠結合所述物質 的親和部分。
[0016] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了包含本文描述核酸的分離的細 胞。
[0017] 根據本發明的一些實施方案的一方面，在此提供了藥物組合物，包含作為活化劑 的本文描述的膚和藥物可接受載體。
[001引根據本發明的一些實施方案，所述膚包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 8所示的 序列。
[0019] 根據本發明的一些實施方案，至少一個氨基酸是合成氨基酸。
[0020] 根據本發明的一些實施方案，至少一個氨基酸是D立體異構體。
[0021] 根據本發明的一些實施方案，至少一個氨基酸是L立體異構體。
[0022] 根據本發明的一些實施方案，一種異源物質通過接頭與氨基酸序列連接。
[002引根據本發明的一些實施方案，經分離的膚包含選自SEQ ID NO: 2 (P邸YQ化SPVG)、沈Q ID NO: 3 (P邸YQ化SPVGS)、沈Q ID NO: 4 (陽RYQNLSPVGSG)、SEQ ID NO: 5 (PERYQ化SPVGSGA) SEQ ID NO: 6 (KPERYQNLSPVGSGA)和SEQ ID NO: 7 化陽RYQNLSPVAAAA)的氨基酸序列。
[0024] 根據本發明的一些實施方案，經分離的膚包含與SEQ ID NO: 8化陽RYQ化SPV)所 示的序列至少80%同一性的序列。
[0025] 根據本發明的一些實施方案，經分離的膚是肉豆違酷化的(myristoylated)。
[0026] 根據本發明的一些實施方案，免疫病癥是自身免疫病癥。
[0027 ]根據本發明的一些實施方案，炎性疾病是結腸炎。
[0028]根據本發明的一些實施方案，所述膚用于在治療炎性病癥或免疫病癥中使用。
[0029] 根據本發明的一些實施方案，異源物質選自多膚、核酸、小分子和碳水化合物。
[0030] 根據本發明的一些實施方案，異源物質是多膚。
[0031 ]根據本發明的一些實施方案，異源物質是藥劑。
[0032] 根據本發明的一些實施方案，藥劑是治療劑，化妝劑或診斷劑。
[0033] 根據本發明的一些實施方案，組合物通過接頭與可檢測部分連接。
[0034] 根據本發明的一些實施方案，接頭包含膚鍵。
[0035] 根據本發明的一些實施方案，接頭包含非膚鍵。
[0036] 根據本發明的一些實施方案，物質組合物通過接頭與親和部分連接。
[0037 ]根據本發明的一些實施方案，親和部分選自抗體，受體配體和碳水化合物。
[0038] 根據本發明的一些實施方案，構建體進一步包含用于調節多核巧酸表達的順式調 節元件。
[0039] 根據本發明的一些實施方案，經分離的多核巧酸轉錄地融合至編碼目的異源多膚 序列的核酸序列中。
[0040] 根據本發明的一些實施方案，分離的細胞是真核細胞。
[0041 ]根據本發明的一些實施方案，真核細胞是酵母細胞。
[0042] 根據本發明的一些實施方案，所述物質是內源物質。
[0043] 根據本發明的一些實施方案，所述物質是外源物質。
[0044] 根據本發明的一些實施方案，所述方法進一步包括在引入之前、伴隨引入或在引 入之后對宿主細胞施用外源物質。
[004引根據本發明的一些實施方案，宿主細胞是分裂細胞。
[0046 ]根據本發明的一些實施方案，宿主細胞是非分裂細胞。
[0047] 根據本發明的一些實施方案，所述物質選自多膚、核酸、小分子和碳水化合物。
[0048] 根據本發明的一些實施方案，所述物質是核酸。
[0049] 根據本發明的一些實施方案，通過選自下述的方法將核酸被引入至宿主細胞中： 顯微注射，電穿孔，憐酸巧共沉淀，DEAE葡聚糖引入，脂質體介導的引入，病毒介導的引入， 裸DNA注射，和生物射彈轟擊。
[0050] 根據本發明的一些實施方案，祀向在體內有效。
[0051] 根據本發明的一些實施方案，祀向在先體外后體內有效。
[0052] 根據本發明的一些實施方案，祀向在體外有效。
[0053] 根據本發明的一些實施方案，宿主細胞是真核細胞。
[0054] 根據本發明的一些實施方案，真核細胞是酵母細胞。
[0055] 除非另有限定，本文中使用的所有技術和/或科學術語具有如本發明所屬的本領 域的普通技術人員通常理解的相同含義。雖然與本發明描述的那些類似或等同的方法和材 料可W用于實踐或測試本發明的實施方案，但本文在下文描述了示例性的方法和/或材料。 W防沖突，本專利說明書，包括定義，將進行控制。另外，材料、方法W及實施例僅用做示例 性的，并且不意在必須是限制性的。
[0056] 附圖簡述 僅W例子的方式，本文描述了本發明的一些實施方案。通過參考附圖細節，強調了顯示 的運些細節僅是示例性的，用于說明本發明的實施方案。在運點上，【附圖說明】對本領域技術 人員如何實施本發明來說是顯而易見的。
[0057] 在附圖中： 圖1A-B闡明了在HeLa細胞中JNK1/2和ρ38α/β與Imp3、7和9相互作用。（A) Co - IP研 究。HeLa細胞在血清饑餓（0.1% FBS，16小時）下生長至70%匯合，隨后用茵香霉素（Anis; 0.扣g/ ml, 15分鐘）和TPA (250 nM，15分鐘）刺激，或者不進行處理(NT)。隨后將細胞提取 物與抗1服1、1服2、938〇、93地抗體或兔1旨6(作為陰性對照)進行(：〇-1?實驗。使用具有指示 的抗Imp抗體的蛋白免疫印跡檢測相互作用的Imp。如指示的（底部小圖），Iped MAPK的量 通過抗JNKl、JNK2、p38α、p38β抗體進行檢測，IgG作為對照。印跡使用NBT/BCIP或ECL顯 色。箭頭指示了相互作用的Imp。（B)使用化A研究。胎La細胞在血清饑餓（0.1% FBS，16小 時）下長至70%匯合，并隨后用茵香霉素（Anis)刺激，或者不進行處理(NT)。將細胞固定，且 根據生產廠商的說明書進行化A測定，其如指示的使用了抗Imp抗體連同抗JNK (上部小 圖）或抗p38(下部小圖）。使用DAPI檢測細胞核，且使用巧光顯微鏡觀察載玻片。信號強度定 量使用ImageJ分析工具（顯示的數據代表平均數+ S. E. p<0.0001 (經處理的相對于對照)執 行。 -
[005引圖2A-C闡明了Imp3、7和9是JNK和p38轉位和誘導轉錄所需的。（A)Imp3、7、9的Si RNA，而不是Imp5的Si RNA，抑制經刺激的JNK和p38的核轉位。化La細胞在蓋玻片上生長至 30%聚集。根據生產商說明書使用化armafeCt將指示的Imp的Si RNA和公司提供的Si對照的 (si Scr，陰性對照)轉染至細胞中。轉染48小時后，細胞是血清饑餓的，隨后如指示的用茵 香霉素（0.5μg/ml，15分鐘）刺激，或不處理(NT)。隨后固定細胞，使用指示的（左側）抗 MPK抗體染色，并用巧光顯微鏡觀察。（B)在刺激之前和刺激后JNKs/p38s核定位的定量。 顯示的數據代表平均數+ S.EJmp3相對于Imp7/Imp9 (*)的顯著性為p<0.0003。刺激的 1111口3/7/9相對于5沈的顯著性為9<0.00001。（0111193、7、9的511?酷抑制1服3/9383的下 游轉錄因子祀的活化。根據廠商說明手冊使用化armafect方法使用指示的Imp的si RNA和 生產廠商提供的si對照（si Scr，陰性對照）轉染化La細胞。轉染48小時后，細胞是血清饑 餓的，且隨后W指示的時間用茵香霉素(0.5μg/ml，15分鐘）刺激，或不處理(NT)。使用抗 口]1^、口16尸24、口4了尸2、指示的11]1口和微管蛋白抗體對細胞提取物進行蛋白質印跡分析。
[0059] 圖3A-B闡明了 JNK1/2和ρ38α/β與Imp7或Imp9,但不與Imp3直接相互作用。（A) JNK1/2和ρ38α/β與Imp3/7/9的體外相互作用。由IPW如下制備純化的Imp3/7/9的:HeLa 細胞生長至70%匯合，血清饑餓，且隨后用茵香霉素（Anis，0.5 pg/ml，15分鐘）、TPA (250 nM，15分鐘）刺激，或不處理（NT)。隨后從細胞提取物中獲得Imp3/7/9,充分洗涂（使用 RIPA緩沖液洗涂兩次，使用0.5M LiCl洗涂一次）。根據材料和方法中所述的從細菌中制備 指示的GST-MAPK。為了檢測締合作用，將50化g的各GST-MAPK與20 μ1在PBS中得指示的經 IP的Imp溫育（4°C下振蕩2小時）。隨后用含有150 ml NaCl的洗涂緩沖液洗涂小珠，且使 用具有指示的抗體的蛋白質印跡分析檢測相互作用的MAPKe(B)Imp3不是Imp7/9與JNK1/2 和ρ38α/β的相互作用所需的。根據廠商說明書，使用Imp3的Si RNA處理化La細胞。轉染48 小時后，細胞是血清饑餓的，隨后使用茵香霉素 (Anis 0.5 pg/ml)或TPA (TPA 250 ng) 刺激，或不處理（NT)。隨后細胞提取物與抗Imp7或Imp9進行Co-IP,使用指示的抗體W蛋 白質印跡檢測相互作用的MAPK。通過指示的抗體檢測經IP的Imp的量。
[0060] 圖4A-B闡明了衍生自ρ38α的第21位-第33位氨基酸的肉豆違酷化膚抑制刺激-依 賴的核轉位和JNKl/2和ρ38α與Imp7的相互作用。（A)所述膚抑制JNKl/2和ρ38α/β的刺 激-依賴的核轉位。HeLa細胞在載玻片上生長至70%匯合，血清饑餓(0.1% FBS，16小時），并 隨后與抑制膚（膚，lOyM)或亂序膚（scrambled peptide) (Scr膚，lOyM)溫育，細胞隨后 用茵香霉素（Anis，0.5 pg/ml)處理或不處理(NT)。將細胞固定，并如指示的抗JNKUJNK2、 ρ38α或ρ38β抗體染色，且WDAPI檢測細胞核。使用巧光顯微鏡觀察載玻片。（B)所述膚抑 制JNK1/2和ρ38α/β與Imp7的相互作用。HeLa細胞生長至70%匯合，血清饑餓(0.1% FBS，16 小時），并隨后與抑制膚（膚，1化Μ)、亂序膚（Scr膚，1化Μ)或DMS0溫育，之后用茵香霉素 (Anis，0.5 μg/ml)處理或模擬對照(NT)。隨后將細胞提取物與抗JNKl、JNK2、p38a、p38i^jt 體進行Co-IP。使用指示的抗Imp抗體通過蛋白質印跡檢測相互作用的Imp7。經IP的MAPK的 量如指示的通過抗JNKl、JNK2、p38a和ρ38β進行檢測。
[0061 ]圖 5A-D闡明了 Imp3W憐-依賴(phospho-dependent)的方式與Imp7/9-MAPK 二聚 體的相互作用。（A)使用PLA檢測異源二聚化的Imp3/7/9"HeLa細胞在載玻片上生長至70% 匯合，血清饑餓，并用茵香霉素（Anis，0.5μg/ml 15分鐘)刺激。其后，將細胞固定，并進 行PLA，使用圖上部標示的抗體。使用DAPI檢測細胞核，并使用巧光顯微鏡觀察載玻片。（B) 使用ImageJ分析工具對信號強度進行定量。顯示的數據代表了平均數± S.E。經刺激的相對 于NT的顯著性為p<0.0005e(C)通過CoIP檢測Imp3/7/9相互作用。使用茵香霉素 （Anis 0.5 μg/ml)或TPA (250 nM)將血清-饑餓的HeLa細胞(0.1% FBS，16小時）處理15分鐘。隨 后將細胞提取物與右側指示的抗體進行Co-IP。左側指示的抗體和NBT/BCIP或E化使 CoIPs和經IP的Imp (底部小圖）的印跡顯色。（D)Imp3對Imp7/9的相互作用依賴于Imp3 的憐酸化作用。通過IPW如下制備純化的Imp3:化La細胞生長至70%匯合，血清饑餓，并隨后 用TPA (250 nM，15分鐘）刺激或不進行處理（NT)。隨后，Imp3從細胞提取物中經IP的， 并充分洗涂(使用RIPA緩沖液洗涂兩次，使用0.5M LiCl洗涂一次）。隨后，純化的蛋白質與 小牛小腸憐酸酶溫育(CIP，1小時，37°C)或不進行處理。將50化g指示的重組Imp與經IP的 Imp3溫育（2小時，4°C下振蕩）。隨后用含有150 mM化C1的洗涂緩沖液洗涂小珠，并使用具 有指示的抗體的蛋白質印跡分析檢測相互作用的Imp。
[0062] 圖6A-B闡明了在刺激后p38和JNK與Imp3/7或Imp3/9的二聚體形成復合體。 (A)凝膠過濾研究顯示在刺激后Imp3/7/9的MW移動。HeLa細胞是血清饑餓的，并隨后用茵 香霉素（Anis，0.5 μg/ml，15分鐘）和TPA (250 nM，15分鐘)刺激，或不處理(NT)。將細 胞提取物(各處理20 mg)加載于16/60 superdex 200大小的柱上(速率1ml/分鐘），并收集 1ml級分。隨后使用具有左側指示的抗Imp3/7/9抗體的蛋白質印跡分析級分。（B) CoIP證 實了JNK和p38與Imp二聚體在約280 W)a峰處而不是在約120 W)a峰處的的締合。來源于未 處理的Anis或TPA刺激的柱的代表約280 kDa和約120 W)a峰(級分號9和22)的級分與指 示的（右側)抗體進行CoIP。使用具有指示的（左側)抗體的蛋白質印跡分析檢測相互作用的 蛋白質。
[0063]圖7A-B闡明了 JNK1/2和ρ38α/β獨立于他們的活化憐酸化作用而轉位至細胞核 中。（Α) JNK1/2和ρ38α/β的核轉位。HeLa細胞生長至70%匯合，血清饑餓(0.1% FBS，16小 時），并隨后在指示的時間點用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml)和TPA (250 nM)刺激，或不處 理（NT)。將細胞固定，用指示的抗JNKl、JNK2、p38a或ρ38β抗體染色，并使用DAPI檢測細胞 核。使用巧光顯微鏡(〇171119113 8乂51，義40放大率)觀察載玻片。（8)內源1服1/^2和938〇/0的 核轉位獨立于他們的憐酸化作用。HeLa細胞生長至70%匯合，血清饑餓，并隨后用茵香霉素 (0.5 pg/ml)或TPA (250 nM)刺激指示的時間。產生細胞提取物，并與指示的抗體進行蛋 白質印跡分析。使用NBT/BCIP或E化將印跡顯色。
[0064] 圖8A-B闡明了在MCF10A和皿2細胞中JNK1/2和ρ38α/β轉位至細胞核中。（A， Β)在MCF10A和皿2細胞中JNK1/2和ρ38α/β的核轉位。（Α)皿2和（Β) MCF10A細胞在 載玻片上生長至70%匯合，血清饑餓，并用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml)或ΤΡΑ (250 ηΜ，只 對皿2)刺激。將細胞固定，使用圖中上部標示的抗JNK和ρ38抗體染色。使用DAPI檢測細胞 核，并使用巧光顯微鏡（Olympus ΒΧ51，χ40放大率)觀察載玻片。
[0065] 圖9闡明了 1服1/^2和口38〇/0使用不依賴^5機制轉位至細胞核中。在^5-同源區內 的突變不影響JNK1/2和ρ38α/β的核穿梭。HeLa細胞生長至70%匯合，使用抓1(1-6。？（訊*- JNK1)、JNK2-GFP (wt-JNK2)、p38a-GFP (wt-p38a)或p380-GFP (wt-p380) W及他們的突 變體（APA或EPE)進行轉染。轉染16小時后，細胞是血清饑餓的、經固定的，使用巧光顯微鏡 (Olympus BX5l，x40 放大率)觀察。
[0066] 圖10A-B闡明了內源的和過表達的JNK1/2和ρ38α/β與Imp3、7和9的CoIPd(A) 進行Co-IP篩選在MCF7細胞中W檢測輸入蛋白與JNK1/2和ρ38α/β相互作用。MCF7細胞在 載玻片上生長至70%匯合，血清饑餓，并隨后用茵香霉素 (Anis 0.5 μg/ml，15分鐘）或ΤΡΑ (250 nM，15分鐘）刺激，或不處理（NT)。細胞提取物隨后與抗JNKl、JNK2、p38a或ρ38β抗 體，和兔IgG(作為陰性對照）(對照)進行Co-IP。使用具有指示的Imp或ΜΑΡΚ抗體的蛋白質 印跡檢測相互作用的Imp或經IP的MAPK。（B)化La細胞中過表達的MAPK的相互作用。使用 JNK2-GFP (wt-JNK2)、p38地-GFP (wt-p3她）或GFP單獨轉染HeLa細胞。細胞是血清饑餓 的，并且隨后使用茵香霉素 (Anis 0.5 μg/ml，15分鐘），TPA (250 nM，15分鐘)處理。隨后 將細胞提取物與抗GFP抗體進行CoIP。使用具有指示的（左側)抗體的蛋白質印跡分析檢測 相互作用的Imp和負載的提取物。使用NBT/BCIP或E化與所述印跡顯色。箭頭指示了相互作 用的Imp。
[0067] 圖11闡明了敲除Imp3/9不影響E服底物cMyc的憐酸化作用。Imp3、9的Si RNA不 抑制邸K1/2的下游轉錄因子祀的活化。使用化armafect根據制造商說明書，使用指示的Imp 的si RNA和廠商提供的si對照（si Scr，陰性對照）轉染化La細胞。轉染48小時后，細胞是 血清饑餓的，并隨后在指示的時間點用茵香霉素 (Anis 0.5 pg/ml)刺激或不刺激(NT)。使 細胞提取物進行具有指示的抗體的蛋白質印跡分析，印跡與NBT/BCIP或E化顯色。
[0068] 圖12A-B闡明了應答刺激的Imp3/7/9的轉位。HeLa (A)或皿2 (B)細胞在載玻 片上生長至70%匯合，血清饑餓，并隨后用茵香霉素 （Anis 0.5μg/ml 15分鐘）刺激或不處 理（NT)。將細胞固定，并使用指示的抗體染色。使用DAPI檢測細胞核，并且使用巧光顯微鏡 觀測(Olympus BX51，x40放大率)載玻片。
[0069] 圖13闡明了Ran是JNK1/2和ρ38α/β核轉位所需的。Ran的siRNA抑制刺激-依賴的 JNKl/^2和p38α/β的核轉位。HeLa細胞在蓋玻片上生長至30%匯合。隨后使用化armafect根據 制造商說明書，將SiRNA Ran和公司提供的si對照（si Scr，陰性對照)轉染至細胞。轉染 48小時后，細胞是血清饑餓的，隨后如指示的用茵香霉素(0.5μg/ml，15分鐘）刺激，或不處 理（NT)。隨后固定細胞，使用指示的抗MAPK抗體染色，并使用巧光顯微鏡觀察（Olympus 8乂51，義40放大率）。
[0070]圖14A-C闡明了ρ38αα與輸入蛋白7相互作用的位點的鑒定