一種ace抑制酶解液及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酶解液，尤其涉及一種ACE抑制酶解液及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 高血壓是世界上最為普遍也是危害性最大的疾病之一。研究發現，人體血壓主要 由腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統共同調控，而血管緊張素轉化酶(ACE)對 這兩系統都有重要影響，可導致血壓升高。因此抑制ACE的活性，可以起到治療高血壓的功 效。除了人工合成的普利類藥物，食物來源的ACE抑制劑因其天然可食療、安全無副作用，成 為研究熱點。ACE抑制劑可從各類食物材料中通過發酵或酶解，然后通過分離純化的方式制 備。
[0003] 扇貝裙邊即扇貝的外套膜，作為扇貝柱加工的主要副產物，占扇貝總重（除貝殼 外）的30.0%，其營養成分與扇貝柱類似，富含蛋白質且氨基酸種類齊全，具有很高的營養 價值，但目前利用率很低，除了少數被處理為動物飼料低價出售，大部分被當做廢棄物丟 棄，導致很大的浪費和污染。
[0004] 因此，本領域的技術人員致力于通過酶解、純化的方式，利用扇貝裙邊等利用率 低、商業價值小的蛋白質來源，制備ACE抑制劑。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是確定合適的酶和最優的酶解條件，利用扇貝裙邊作 原料，通過透析技術，得到具有ACE抑制效果的酶解液。
[0006] 本發明公開了一種ACE抑制酶解液的制備方法，包括以下步驟：
[0007] 1)將扇貝裙邊洗凈、烘干、粉碎，過篩，得到扇貝裙邊粉；
[0008] 2)向磷酸鹽緩沖液中里加入扇貝裙邊粉以及α-胰凝乳蛋白酶，混勻，進行水解反 應，高溫終止水解反應，離心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液；
[0009] 3)向α-胰凝乳蛋白酶酶解液中加入磷酸氫二鉀溶液將pH調節至7.5,然后添加羧 肽酶A和羧肽酶B，混勻，進行水解反應，高溫終止水解反應，得到羧肽酶A/B酶解液；
[0010] 4)將羧肽酶A/B酶解液放入lOOODa CE透析袋，浸沒于去離子水中透析，小于 lOOODa的組分擴散至去離子水中，將帶有小于lOOODa的組分的去離子水裝入500Da CE透析 袋內，浸沒于去離子水中透析，得到留在透析袋內的500_1000Da的組分，即得到ACE抑制酶 解液。
[0011] 進一步地，步驟1)具體為:將扇貝裙邊用水反復清洗3次，然后置于烘箱中65°C烘 干，將烘干的扇貝裙邊粉碎，過60目篩，得到扇貝裙邊粉。
[0012] 進一步地，步驟2)具體為：向60mL 0.035M PH8.0磷酸鹽緩沖液中里加入4g的扇貝 裙邊粉以及24mg 800U/mga-胰凝乳蛋白酶，漩渦混勻，在37°C下水解反應5h，高溫終止水解 反應，離心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液。
[0013] 進一步地，步驟3)具體為：取α-胰凝乳蛋白酶酶解液9.8mL，通過加入磷酸氫二鉀 溶液將口訊周節至7.5，然后添加10(^1^ 2001]/1^羧肽酶4和10(^1^001]/1^羧肽酶8，漩渦混勻， 于45°C下水解反應8h，高溫終止水解反應，得到羧肽酶A/B酶解液。
[0014] 進一步地，步驟4)中兩次透析的時間均為10-14h，期間均換一次去離子水。
[0015] 本發明所涉及的ACE抑制酶解液是通過上述制備方法制得的ACE抑制酶解液。
[0016] 尤其是，ACE抑制酶解液的半抑制濃度（IC5Q值)為800-900yg/mL。
[0017]優選地是，ACE抑制酶解液的IC5Q值為893yg/mL，ACE抑制酶解液中分子的大小為 500-1000Da〇
[0018] 進一步地，ACE抑制酶解液來自扇貝裙邊，扇貝裙邊的蛋白質含量為50-55% ;扇貝 裙邊的脯氨酸含量為200-210nmol/mg，占扇貝裙邊的總蛋白質含量的5.0-5.5%。
[0019] 本發明所涉及的ACE抑制酶解液能夠應用在制備降壓藥和/或降壓食品。比如，作 為制備普利類降壓藥的原料。
[0020] 其有益效果：
[0021] (1)通過α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A/B兩步酶解扇貝裙邊得到的ACE抑制酶解液其 ACE抑制的IC5Q值為893yg/mL，具備一定的降血壓功能。普通ACE抑制酶解液(未經分離純化） 的IC 5Q值一般在mg/ml的級別，即1000-10000yg/mL范圍內。本發明中，因為采用了針對性的 兩步酶解以及優化酶解時間，同時利用透析分離出ACE抑制肽較為集中的500-1000Da組分， 使得扇貝裙邊酶解液的IC 5Q = 893yg/mL，比普通的ACE抑制酶解液更好。
[0022] (2)扇貝裙邊粉中蛋白質含量為52.5±0.8%，脯氨酸含量為207.53nmol/mg，占總 蛋白質含量的5.2%，有利于制備酶解液。
[0023] (3)用α-胰凝乳蛋白酶酶解5h，扇貝裙邊蛋白的水解度達到最高值，為7.7 土 0.3%〇
[0024] (4)用羧肽酶A/B酶解8h，酶解液的水解度達到最高值，比α-胰凝乳蛋白酶解液提 高 3·5±0·3%。
[0025] (5)本發明提供的制備方法是從扇貝裙邊酶解得到ACE抑制酶解液，為扇貝裙邊提 供了一種新的利用途徑，降低了資源浪費和污染，提升了扇貝裙邊的商業價值和利用率。
[0026] (6)本發明提供的ACE抑制酶解液，食物來源，對于進一步的應用于降壓藥物或降 壓食物的生產更加安全可靠。
[0027] (7)本發明的制備方法步驟簡單，可以用于工業生產。
【附圖說明】
[0028] 圖1是α-胰凝乳蛋白酶水解時間與水解度曲線。
[0029] 圖2是羧肽酶Α/Β水解時間與水解度曲線。
[0030] 圖3是透析各組分抑制ACE的IC5Q值。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合附圖和具體的實施例，并參照數據進一步詳細描述本發明。應理解，這些 實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制發明的范圍。下述實施例中所使用 的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說 明，均可從商業途徑得到。
[0032]實施例1、ACE抑制酶解液的制備方法 [0033] 1、扇貝裙邊的預處理：
[0034]將購買的扇貝裙邊用水反復清洗3次。然后放置烘箱中65°C過夜，直至烘干。將烘 干的扇貝裙邊利用多功能粉碎機進行粉碎，并過60目篩，得到扇貝裙邊粉，備用。
[0035] 2、扇貝裙邊營養成分分析：
[0036] 通過凱氏定氮法，測得海灣扇貝裙邊粉中蛋白質含量為52.5±0.8%。通過全自動 氨基酸分析儀進行氨基酸成分分析，結果表明脯氨酸含量為207.53nmol/mg，占總蛋白質含 量的5.2%。
[0037] 3、水解度的測定：
[0038] 根據Adler-Nissen的方法進行改進，具體操作步驟如下:取0. lmL酶解液樣品于試 管中，加入2.2mL 0.21M磷酸鹽緩沖液(pH 8.2)和2mL 0.1%三硝基苯磺酸，混合均勻，50°C 避光水浴lh。反應結束后，加入4mL的0.1M鹽酸，震蕩后室溫靜置30min，測定混合液的340nm 吸光值。同時以不同濃度的L-亮氨酸替代樣品，執行相同操作，用以擬合0D34Q與氨基態氮濃 度的關系曲線。水解度的計算按照Ben jakul&Morrissey ' s的公式進行改進，具體如下：
[0039] DH= (ht-ho)/(ht〇t-ho) X 100
[0040] 其中DH:水解度（％)
[0041] ht:反應后氨基態氮濃度(mmol/g)
[0042] ho:反應前氨基態氮濃度(mmol/g)
[0043] htclt:樣品肽鍵總數(mmol/g)，即樣品100%徹底水解后氨基態氮濃度。扇貝裙邊的 ht〇t為7 · 99mmol/g〇
[0044] 4、α_胰凝乳蛋白酶酶解條件優化：
[0045]向60mL 0.035Μ ρΗ8.0磷酸鹽緩沖液中里加入4g的扇貝裙邊粉以及24mga-胰凝乳