本發明(ming)屬于肺纖維化治療(liao)技術領(ling)域(yu)，尤其涉(she)及一(yi)種治療(liao)肺纖維化的藥物(wu)。
背景技術：
肺(fei)纖維(wei)化(PF)是(shi)(shi)肺(fei)間質彌(mi)漫性滲出、浸潤和纖維(wei)化為主要(yao)病(bing)(bing)(bing)變的一(yi)類疾病(bing)(bing)(bing)，其主要(yao)癥狀包括呼(hu)吸困難、氣短(duan)、干咳、喘(chuan)憋現(xian)象，嚴重(zhong)時會(hui)導致患(huan)者(zhe)呼(hu)吸衰竭(jie)而死亡。目前對(dui)其發病(bing)(bing)(bing)機制仍不(bu)太清楚，隨著(zhu)環境污染的不(bu)斷惡化，發病(bing)(bing)(bing)率正在逐年增加。目前西醫(yi)(yi)對(dui)于肺(fei)纖維(wei)化的傳統治療手段主要(yao)是(shi)(shi)采用(yong)激(ji)素和免疫抑制劑類藥物，但是(shi)(shi)療效不(bu)理想而且還有副作用(yong)。中醫(yi)(yi)文獻沒有關于肺(fei)纖維(wei)化的疾病(bing)(bing)(bing)名稱(cheng)，根(gen)據其癥狀可(ke)歸屬于“肺(fei)痹”、“肺(fei)痿”、“咳嗽”等，臨床(chuang)與實踐表明(ming)中醫(yi)(yi)藥治療肺(fei)纖維(wei)化顯示一(yi)定的優勢。
肺(fei)纖(xian)(xian)維(wei)化難(nan)以(yi)(yi)(yi)用單(dan)一(yi)病機(ji)(ji)來解釋，很(hen)多(duo)醫(yi)家認(ren)為(wei)(wei)：肺(fei)纖(xian)(xian)維(wei)化當屬本(ben)(ben)虛(xu)標實(shi)(shi)，以(yi)(yi)(yi)肺(fei)腎氣虛(xu)為(wei)(wei)本(ben)(ben)，以(yi)(yi)(yi)痰濁、瘀(yu)血(xue)(xue)、熱毒(du)等(deng)邪實(shi)(shi)內阻為(wei)(wei)標。在本(ben)(ben)病的發(fa)生、發(fa)展的整個(ge)過(guo)程中(zhong)(zhong)，正氣不足是本(ben)(ben)病之本(ben)(ben)，“虛(xu)”、“痰”、“瘀(yu)”一(yi)直貫穿(chuan)于疾病的始終。單(dan)味中(zhong)(zhong)藥對(dui)肺(fei)纖(xian)(xian)維(wei)化的作用具有局(ju)限性(xing)，難(nan)以(yi)(yi)(yi)完全(quan)治療(liao)病機(ji)(ji)復(fu)(fu)雜的疾病，中(zhong)(zhong)藥復(fu)(fu)方才是中(zhong)(zhong)藥研(yan)究的重難(nan)點。目前中(zhong)(zhong)醫(yi)主(zhu)(zhu)要使用藥物多(duo)以(yi)(yi)(yi)補(bu)益藥和活血(xue)(xue)藥為(wei)(wei)主(zhu)(zhu)，以(yi)(yi)(yi)祛痰藥為(wei)(wei)佐。鄧家剛(gang)教授認(ren)為(wei)(wei)，肺(fei)纖(xian)(xian)維(wei)化形(xing)成的中(zhong)(zhong)醫(yi)病機(ji)(ji)主(zhu)(zhu)要涉(she)及正虛(xu)痰瘀(yu)等(deng)，并依據中(zhong)(zhong)醫(yi)理論和多(duo)年的行醫(yi)經(jing)驗，組成“蛤芒肺(fei)纖(xian)(xian)方”(原處方：蛤蚧、五指牛奶、芒果葉、黃根(gen)與三七)進行治療(liao)肺(fei)纖(xian)(xian)維(wei)化的研(yan)究。
技術實現要素：
本發明要解決的(de)(de)技術問題是提(ti)供一(yi)種(zhong)安全(quan)有效的(de)(de)治(zhi)療肺纖維化的(de)(de)藥(yao)物。
為解決(jue)上(shang)述技術(shu)問(wen)題，本發明采用以下技術(shu)方案：治療肺纖維化的藥物，其處方由蛤蚧(jie)、五(wu)指牛奶、芒果葉(xie)、黃根與三(san)七組成。
蛤芒肺纖方按重量份(fen)由(you)蛤蚧2～10份(fen)、五指(zhi)牛奶(nai)6～15份(fen)、芒果葉(xie)5～20份(fen)、黃(huang)根(gen)5～15份(fen)與(yu)三七1～5份(fen)組成。
所述的(de)治療肺(fei)(fei)纖維化藥物，可(ke)通(tong)過顯著性的(de)提(ti)高模型小(xiao)鼠體(ti)內總SOD活力，降(jiang)低MDA含量，即通(tong)過增加氧自由(you)(you)基清除(chu)劑的(de)含量和降(jiang)低氧自由(you)(you)基代謝產物的(de)損害，對博萊霉素致小(xiao)鼠肺(fei)(fei)損傷具有(you)保護作用，從而(er)抑制肺(fei)(fei)纖維化。
所述的(de)治(zhi)療(liao)肺(fei)纖(xian)維化藥物，可通過顯(xian)著地降(jiang)低HYP表達水平(ping)，抑制膠原蛋白的(de)形成(cheng)，進而減輕肺(fei)纖(xian)維化的(de)程度。
所述的治療肺纖(xian)維化(hua)藥物，可通過抑制IL-1β的表達而(er)發揮抑制肺纖(xian)維化(hua)形成(cheng)的作用。
所(suo)述(shu)的治(zhi)療肺(fei)纖(xian)維(wei)化藥物，可通過抑制NF-κB而起(qi)到抗(kang)炎作(zuo)用，進而起(qi)到治(zhi)療肺(fei)纖(xian)維(wei)化作(zuo)用。
所述的治療肺(fei)(fei)纖(xian)維(wei)化(hua)藥物，可通過抗(kang)氧化(hua)抗(kang)自由基損傷、抑制(zhi)炎(yan)癥因(yin)子(zi)的釋放抗(kang)炎(yan)性損傷、影響膠原(yuan)的代謝減少肺(fei)(fei)纖(xian)維(wei)蛋(dan)白(bai)的形成(cheng)3個方(fang)面發揮抑制(zhi)肺(fei)(fei)纖(xian)維(wei)化(hua)的作用。
所(suo)述肺纖(xian)維化由化學、物(wu)理(li)或(huo)生物(wu)因素引起人(ren)體(ti)正(zheng)虛痰瘀所(suo)造(zao)成(cheng)。
肺(fei)纖(xian)維化由抗腫瘤藥博(bo)萊霉素(su)誘導造成(cheng)。
該藥物為口服制劑。
此藥(yao)物處(chu)方是(shi)根(gen)據(ju)中(zhong)醫“辨證論治”的思想，合(he)理用藥(yao)，以求達標本(ben)皆治之效。
發(fa)明人根據先(xian)前對蛤芒肺(fei)纖(xian)方的(de)(de)研究，進一步(bu)采用(yong)中(zhong)藥(yao)(yao)藥(yao)(yao)理學方法和分子生(sheng)物(wu)學方法，對抗腫瘤藥(yao)(yao)博萊霉素誘導的(de)(de)小鼠(shu)肺(fei)纖(xian)維(wei)化進行藥(yao)(yao)效及其初(chu)步(bu)機(ji)制(zhi)研究。實(shi)驗結果表(biao)明該方有效性及其藥(yao)(yao)理作用(yong)機(ji)制(zhi)，可用(yong)于開發(fa)治(zhi)療肺(fei)纖(xian)維(wei)化的(de)(de)中(zhong)藥(yao)(yao)新藥(yao)(yao)。
具體實施方式
實施(shi)例1：蛤芒肺纖方對(dui)肺纖維化模型小鼠的干預(yu)作用
1實驗材料
1.1實驗動物
18-22g左右昆明(ming)種SPF級雄性小鼠，合(he)格證號：scxk桂2009-0002，由廣(guang)西醫科大學實驗動(dong)物(wu)中(zhong)心提供。
1.2藥物與試劑
地塞米松磷酸(suan)(suan)(suan)鈉注射(she)液(1ml、5mg，廣州白(bai)云山天心制藥(yao)(yao)(yao)股份(fen)有(you)(you)限(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)(si)，生(sheng)產(chan)(chan)(chan)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：130608)；注射(she)用鹽酸(suan)(suan)(suan)博萊霉(mei)素(日本(ben)化(hua)藥(yao)(yao)(yao)株(zhu)式會社，產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：120901)；蛤(ha)蚧(廣西(xi)(xi)玉林(lin)參(can)寶(bao)堂(tang)中藥(yao)(yao)(yao)飲片有(you)(you)限(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)(si)，產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：130802)；五指牛(niu)奶(nai)(廣西(xi)(xi)玉林(lin)參(can)寶(bao)堂(tang)中藥(yao)(yao)(yao)飲片有(you)(you)限(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)(si)，產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：130905)；芒果葉(自(zi)采，經廣西(xi)(xi)中醫藥(yao)(yao)(yao)大學中藥(yao)(yao)(yao)教研(yan)(yan)(yan)室覃文慧鑒定(ding))；三七(廣西(xi)(xi)玉林(lin)參(can)寶(bao)堂(tang)中藥(yao)(yao)(yao)飲片有(you)(you)限(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)(si)，產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：130902)；黃根(廣西(xi)(xi)玉林(lin)參(can)寶(bao)堂(tang)中藥(yao)(yao)(yao)飲片有(you)(you)限(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)(si)，產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：130601)；SOD試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(南(nan)京(jing)(jing)(jing)建成(cheng)生(sheng)物工程(cheng)研(yan)(yan)(yan)究所(suo)產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：20131102)；MDA試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(南(nan)京(jing)(jing)(jing)建成(cheng)生(sheng)物工程(cheng)研(yan)(yan)(yan)究所(suo)，產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：20140109)；羥脯氨酸(suan)(suan)(suan)試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(堿)(南(nan)京(jing)(jing)(jing)建成(cheng)生(sheng)物工程(cheng)研(yan)(yan)(yan)究所(suo))；考(kao)馬(ma)斯亮蘭(南(nan)京(jing)(jing)(jing)建成(cheng)生(sheng)物工程(cheng)研(yan)(yan)(yan)究所(suo)產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：20140108)；IL-1βELISA測試(shi)(shi)(shi)盒(武漢博士(shi)德生(sheng)物工程(cheng)有(you)(you)限(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)(si)，產(chan)(chan)(chan)品(pin)批(pi)(pi)號(hao)(hao)：20140109)。
1.3實驗主要儀器
BX60顯(xian)微鏡(OLYMPUS 日(ri)本)
高速低溫離心(xin)機(Heraeus LG16-W)
全波長酶(mei)標儀(Epoch Biotek公(gong)司(si) 美國)
TGL-16B和TGL-16C型高速臺式(shi)離(li)心機(上海安亭科學(xue)儀器(qi)廠)
紫(zi)外分光光度計(ji)(TU-1901/1900北京(jing)普析通用儀(yi)器有限公司(si))
電子(zi)天平(EL204 梅(mei)特勒-托利(li)多(duo)儀器(qi)(上海)有限公(gong)司)
全自(zi)動石蠟切片(pian)機(德(de)國MICROM(美康(kang))HM355 S型)
電(dian)熱(re)恒(heng)溫培養箱(HH·B11·360型(xing) 上海躍進(jin)公(gong)司(si))
電熱恒干燥箱(GZX-DH·400型 上海(hai)躍(yue)進公司(si))
研究級顯微(wei)鏡(jing)(OLYMPUS 日(ri)本BX-60型)
顯微攝像(尼(ni)(ni)康 D700型 單(dan)反照(zhao)相(xiang)機 日本尼(ni)(ni)康)
2方法
2.1蛤(ha)芒肺纖(xian)方(fang)制備
按處方(fang)配比稱取蛤蚧、五指牛奶、芒果葉、黃根與三七(qi)，第一次(ci)(ci)以(yi)8倍量的水(shui)煎煮至沸(fei)后(hou)30分(fen)鐘過濾，保留濾液(ye)，然(ran)后(hou)再以(yi)4倍量的水(shui)煎煮至沸(fei)后(hou)30分(fen)鐘過濾，保留濾液(ye)，將兩次(ci)(ci)濾液(ye)混合濃縮至150ml。
2.2造模與分組
18-22g昆明種雄性(xing)小鼠40只(zhi)，隨機分為4組(zu)(zu)，每組(zu)(zu)10只(zhi)：A空白組(zu)(zu)(10只(zhi)，純凈(jing)水(shui))、B模型(xing)組(zu)(zu)(10只(zhi)，純凈(jing)水(shui))、C陽(yang)性(xing)組(zu)(zu)(10只(zhi)，地塞米松，1mg/kg)、D蛤(ha)芒(mang)肺(fei)纖(xian)(xian)方(fang)組(zu)(zu)。除(chu)空白組(zu)(zu)外其(qi)余各組(zu)(zu)小鼠乙醚吸入(ru)麻醉后(hou)，保持(chi)小鼠呈直立(li)狀，根(gen)據(ju)小鼠的呼吸，自鼻腔緩慢(man)滴(di)入(ru)6mg/kg鹽酸博(bo)萊霉素溶液，滴(di)完(wan)后(hou)保持(chi)直立(li)30秒，待其(qi)蘇醒后(hou)給予水(shui)和飼料，肺(fei)纖(xian)(xian)維化小鼠模型(xing)建立(li)完(wan)成。
2.3給藥方法
模型建立14天(tian)后每(mei)日灌胃(ig)給(gei)予(yu)各組小鼠相應(ying)的(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)進行干預14天(tian)，空白組和模型組ig等量(liang)純凈(jing)水。地塞米松，給(gei)藥(yao)(yao)(yao)量(liang)為1mg/kg；蛤芒肺纖方組(劑(ji)量(liang)為3.3mg/kg生藥(yao)(yao)(yao))，給(gei)藥(yao)(yao)(yao)容(rong)量(liang)統一為20mL/kg。
2.4觀察指標
各(ge)組(zu)小(xiao)鼠分別(bie)于(yu)給(gei)藥14天后(hou)處死(si)，打開(kai)小(xiao)鼠胸腔(qiang)，取出肺(fei)(fei)臟(zang)，小(xiao)鼠肺(fei)(fei)左大葉固定于(yu)4％多(duo)聚甲醛(quan)溶液中(zhong)(zhong)，常規石蠟包埋，切片，采(cai)用(yong)HE和Masson染色(se)觀(guan)察肺(fei)(fei)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)病(bing)理改變以及肺(fei)(fei)纖(xian)維化(hua)程(cheng)度；取右肺(fei)(fei)中(zhong)(zhong)葉，在生(sheng)理鹽(yan)水(shui)(shui)中(zhong)(zhong)充分漂(piao)洗(xi)后(hou)，濾紙吸(xi)干表面水(shui)(shui)分，精密稱取30-50mg，于(yu)-80℃冰箱保存，待測(ce)肺(fei)(fei)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)羥(qian)脯氨酸(HYP)含(han)量；余肺(fei)(fei)留(liu)存并(bing)用(yong)生(sheng)理鹽(yan)水(shui)(shui)制備成(cheng)10％肺(fei)(fei)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)勻漿(jiang)，用(yong)于(yu)測(ce)定肺(fei)(fei)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)勻漿(jiang)中(zhong)(zhong)的(de)丙二醛(quan)(MDA)和超(chao)氧化(hua)物岐化(hua)酶(SOD)活力。HE染色(se)觀(guan)察肺(fei)(fei)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)病(bing)理切片和Masson染色(se)觀(guan)察膠原纖(xian)維的(de)分布情(qing)況；采(cai)用(yong)ELISA法測(ce)白介素-1β(IL-1β)含(han)量。
2.5統計學方法
所有數(shu)據均以表示，使用(yong)SPSS17.0軟(ruan)件中(zhong)單因(yin)素方(fang)差(cha)(cha)分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法(fa)進行統計(ji)分(fen)(fen)析(xi)；Homegeneity檢驗(yan)方(fang)差(cha)(cha)齊性，若方(fang)差(cha)(cha)齊時采(cai)用(yong)最小顯(xian)著(zhu)法(fa)(LSD)檢驗(yan)；若方(fang)差(cha)(cha)不齊時采(cai)用(yong)Dunnett’sU檢驗(yan)；等級資料采(cai)用(yong)SPSS17.0軟(ruan)件中(zhong)非(fei)參數(shu)檢驗(yan)法(fa)統計(ji)分(fen)(fen)析(xi)。
3結果
3.1各組小鼠肺組織勻漿中(zhong)總(zong)SOD活力比較
模(mo)型組(zu)肺組(zu)織勻漿中總(zong)SOD活力較(jiao)空(kong)白(bai)組(zu)顯著性(xing)的降低(di)(P＜0.01)。與模(mo)型組(zu)比較(jiao)，各給藥組(zu)總(zong)SOD活力均(jun)顯著性(xing)升高(gao)(gao)(P＜0.01)。蛤芒肺纖(xian)方組(zu)SOD活力升高(gao)(gao)較(jiao)明顯，和空(kong)白(bai)組(zu)比較(jiao)沒有差(cha)異，見表1。
注(zhu)：與(yu)空白組比(bi)較，*P＜0.05，**P＜0.01；與(yu)模型組比(bi)較，#P＜0.05，##P＜0.01；以下各表(biao)相同。
3.2各(ge)組小鼠肺組織勻漿(jiang)中MDA含量(liang)比較
與空(kong)(kong)白(bai)組(zu)(zu)比較(jiao)，模(mo)型(xing)組(zu)(zu)肺組(zu)(zu)織勻漿中MDA含量(liang)顯(xian)著升高(P＜0.01)；與模(mo)型(xing)組(zu)(zu)比較(jiao)，各給藥組(zu)(zu)MDA含量(liang)顯(xian)著性的降低(P＜0.01)。蛤芒肺纖方組(zu)(zu)MDA含量(liang)和空(kong)(kong)白(bai)組(zu)(zu)無顯(xian)著性差異。見(jian)表2
注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
3.3各組小鼠(shu)肺組織(zhi)中HYP含(han)量(ug/mg干重)比較(jiao)
與(yu)空白組相比(bi)，模型組肺組織中HYP含量(liang)明顯升(sheng)高(P＜0.05)，與(yu)模型組相比(bi)，各給藥(yao)組HYP含量(liang)均較(jiao)模型組顯著降低(P＜0.05)。蛤芒肺纖方組HYP含量(liang)和空白組無顯著性差(cha)異(yi)。見表3。
注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
3.4各組(zu)小鼠0.1％肺組(zu)織勻漿中IL-1β含量比較
與空白組比較(jiao)(jiao)，模型組1％肺(fei)組織勻漿中IL-1β水(shui)平均顯著(zhu)(zhu)升(sheng)高(gao)(P＜0.05～0.01)；與模型組比較(jiao)(jiao)，各給藥組IL-1β水(shui)平顯著(zhu)(zhu)性降低(P＜0.05)。見表4。
注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
3.5各組小鼠肺組織病理形態(tai)學(xue)觀(guan)察
光學顯(xian)微鏡下(xia)觀察，空白組(zu)(zu)肺(fei)(fei)(fei)(fei)結構清晰，肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡(pao)上(shang)皮細(xi)(xi)胞(bao)、肺(fei)(fei)(fei)(fei)間質血(xue)(xue)管(guan)上(shang)皮細(xi)(xi)胞(bao)未見或少見炎癥細(xi)(xi)胞(bao)浸(jin)潤，支氣管(guan)、肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡(pao)、血(xue)(xue)管(guan)壁均未見膠原(yuan)纖(xian)(xian)維明(ming)顯(xian)增生。模型組(zu)(zu)小鼠均有肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡(pao)炎，表現為(wei)肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡(pao)充血(xue)(xue)、水腫，部分肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡(pao)有透明(ming)膜形成，肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡(pao)上(shang)皮細(xi)(xi)胞(bao)有中至重(zhong)度損傷，肺(fei)(fei)(fei)(fei)泡(pao)炎稍減輕(qing)；肺(fei)(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)維化程度最重(zhong)，多呈3級肺(fei)(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)維化變(bian)化，膠原(yuan)纖(xian)(xian)維組(zu)(zu)織增生、變(bian)厚(hou)，肺(fei)(fei)(fei)(fei)氣腫嚴重(zhong)。各給藥組(zu)(zu)都有明(ming)顯(xian)的改(gai)善。肺(fei)(fei)(fei)(fei)組(zu)(zu)織病理學分析結果見表5。
表(biao)5各組(zu)小鼠(shu)肺泡炎、肺纖維化程度比較
注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
實施(shi)例2：蛤芒肺(fei)纖方對人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)炎(yan)癥的(de)干預(yu)作用
1材料
1.1主要儀器
Milli-Q超純水儀(美(mei)國(guo)(guo)Millipore公司)；HF151UV型CO2細胞培養箱(上海Heal Force公司)；倒置生物相差顯微(wei)鏡(jing)(日本Olympus公司)；MIKRO 220R型高速冷凍離心(xin)機(德國(guo)(guo)Hettich公司)；680型酶標儀(美(mei)國(guo)(guo)Bio-Rad公司)；Modulus熒(ying)光檢測儀(美(mei)國(guo)(guo)Turner Designs公司)。
1.2藥品與試劑
肺纖(xian)方，由(you)蛤蚧(jie)、五指牛(niu)奶(nai)、芒果葉、黃根與三(san)七(qi)等藥物組成，經天津藥物研究院(yuan)提取(qu)制(zhi)備(bei)；1640基(ji)(ji)礎培養基(ji)(ji)(美(mei)(mei)國HyClone公司(si)(si))；雙(shuang)抗(氨(an)芐青霉素和鏈霉素)、胎(tai)牛(niu)血(xue)清、胰蛋白酶(mei)(美(mei)(mei)國Gibco公司(si)(si))；TNF-α(美(mei)(mei)國Peprotech公司(si)(si))；地(di)塞米松(Dex，美(mei)(mei)國Sigma公司(si)(si))；PGL4.32質粒和海腎熒光素酶(mei)質粒、細胞裂解(jie)液、雙(shuang)熒光素酶(mei)報(bao)告基(ji)(ji)因試劑盒(美(mei)(mei)國Promega公司(si)(si))；脂質體2000轉染試劑(美(mei)(mei)國Invitrogen公司(si)(si))；TNF-α、IL-6酶(mei)聯免疫試劑盒(上(shang)海西(xi)唐)；超純水由(you)Milli-Q制(zhi)備(bei)。
1.3細胞
人支(zhi)氣管(guan)上(shang)皮細胞(bao)(BEAS-2B)購自(zi)上(shang)海(hai)拜力生物技(ji)術有限公(gong)司(si)。
2方法
2.1肺纖方對NF-κB抑制能力的測定(ding)
BEAS-2B細胞培養于96孔板，細胞融合至60％～70％時共轉染PGL4.32及內參Renilla質粒，轉染24h后加入各濃度的肺纖方(10-4、10-5、10-6、10-7g/mL)或地塞米松(10-4mol/L)孵育6h，再加入TNF-α(10ng/mL)刺激(ji)6h后裂解細胞，用雙熒光(guang)(guang)素酶(mei)報告基因試劑盒檢(jian)測各組細胞NF-κB的表達量，數據以相對熒光(guang)(guang)比值(zhi)表示(shi)，相對熒光(guang)(guang)比值(zhi)＝NF-κB熒光(guang)(guang)值(zhi)/內(nei)參Renilla熒光(guang)(guang)值(zhi)。
2.2數據統計分析
采用SPSS18.0軟件進行(xing)數據統計(ji)，組(zu)間比較采用單因(yin)素方差(cha)分(fen)析(one-way ANOVA)，以P＜0.05為差(cha)異(yi)有統計(ji)學意義。
3結果
3.1肺(fei)纖方體外抗炎活性評價(jia)
3.1.1抗炎能力的測定肺纖方在細胞水平上對NF-κB的抑制活性評價結果見表6，結果顯示：與空白組比較，模型組NF-κB的表達量顯著升高(P＜0.001)。與模型組比較，陽性藥地塞米松組(1×10-4mol/L)NF-κB的表達量顯著降低(P＜0.001)；肺纖方組(10-1、10-2mg/mL)NF-κB的表達量顯著降低(P＜0.001)，肺纖方組(10-3、10-4mg/mL)與模型組之間無顯(xian)著性差異；抗炎(yan)能力隨著藥(yao)物(wu)濃度的(de)增加而增強，說明肺(fei)纖方(fang)對NF-κB有很好的(de)抑制(zhi)作用。
表6不(bu)同濃(nong)度肺纖方對NF-κB的抑制作(zuo)用
注：與空(kong)白組(zu)(zu)比(bi)較，###表示P＜0.001；與模型組(zu)(zu)比(bi)較，***表示P＜0.001。
結論：動物實驗結果(guo)表(biao)(biao)(biao)明，蛤(ha)芒肺(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)方(fang)(fang)組(zu)(zu)(zu)顯(xian)著(zhu)性的(de)(de)(de)(de)提高模型小鼠(shu)體(ti)內總SOD活力，降(jiang)低MDA含量(liang)，說明本(ben)方(fang)(fang)能增加氧自由基清除(chu)劑的(de)(de)(de)(de)含量(liang)和(he)降(jiang)低氧自由基代(dai)謝產物的(de)(de)(de)(de)損(sun)害，對(dui)博(bo)萊霉素(su)致小鼠(shu)肺(fei)(fei)(fei)損(sun)傷(shang)具有(you)保(bao)護作(zuo)(zuo)用，從而抑制(zhi)(zhi)肺(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)維化(hua)。各(ge)組(zu)(zu)(zu)HYP的(de)(de)(de)(de)測(ce)定(ding)含量(liang)表(biao)(biao)(biao)明給(gei)藥組(zu)(zu)(zu)均能顯(xian)著(zhu)地降(jiang)低HYP表(biao)(biao)(biao)達(da)水平(ping)，蛤(ha)芒肺(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)方(fang)(fang)組(zu)(zu)(zu)HYP含量(liang)甚至達(da)到空白組(zu)(zu)(zu)水平(ping)，表(biao)(biao)(biao)明其(qi)可(ke)(ke)以通過抑制(zhi)(zhi)膠原蛋白的(de)(de)(de)(de)形成，減輕(qing)肺(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)維化(hua)的(de)(de)(de)(de)程(cheng)度(du)。通過ELISA測(ce)定(ding)各(ge)組(zu)(zu)(zu)肺(fei)(fei)(fei)勻漿中IL-1β含量(liang)，可(ke)(ke)知模型組(zu)(zu)(zu)在(zai)疾病發(fa)展過程(cheng)中IL-1β水平(ping)始終偏高，而給(gei)藥組(zu)(zu)(zu)明顯(xian)降(jiang)低，表(biao)(biao)(biao)明其(qi)可(ke)(ke)能通過抑制(zhi)(zhi)IL-1β的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)而發(fa)揮抑制(zhi)(zhi)肺(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)維化(hua)形成的(de)(de)(de)(de)作(zuo)(zuo)用。可(ke)(ke)見，此(ci)方(fang)(fang)可(ke)(ke)以從抗氧化(hua)、抗自由基損(sun)傷(shang)方(fang)(fang)面(mian)、抑制(zhi)(zhi)炎癥因子的(de)(de)(de)(de)釋放而發(fa)揮抗炎性損(sun)傷(shang)作(zuo)(zuo)用、影(ying)響膠原的(de)(de)(de)(de)代(dai)謝而減少肺(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)維蛋白的(de)(de)(de)(de)形成3個方(fang)(fang)面(mian)發(fa)揮抑制(zhi)(zhi)肺(fei)(fei)(fei)纖(xian)(xian)維化(hua)的(de)(de)(de)(de)作(zuo)(zuo)用。
細(xi)胞(bao)實驗(yan)結果表明(ming)(ming)，肺(fei)纖(xian)方對NF-κB有(you)很好(hao)的(de)抑制作用。NF-κB是(shi)一種核轉錄因(yin)子，在(zai)(zai)體內廣泛分布并參與調控多種細(xi)胞(bao)因(yin)子、粘附分子和趨化(hua)(hua)(hua)因(yin)子等基(ji)因(yin)的(de)轉錄激(ji)活(huo)，TNF-α是(shi)一種重(zhong)要的(de)炎癥介質(zhi)，無論是(shi)間質(zhi)性肺(fei)疾病患(huan)者還(huan)是(shi)動物(wu)模型，巨噬細(xi)胞(bao)釋放的(de)TNF-α均增加(jia)，TNF-α基(ji)因(yin)啟動子含有(you)NF-κB的(de)結合(he)位點，在(zai)(zai)肺(fei)纖(xian)維(wei)化(hua)(hua)(hua)過程中，NF-κB受(shou)TNF-α的(de)調控，其基(ji)因(yin)表達增加(jia)。據研究表明(ming)(ming)，在(zai)(zai)急(ji)性肺(fei)損(sun)傷(shang)、特發性肺(fei)纖(xian)維(wei)化(hua)(hua)(hua)和SiO2、百草枯、博萊霉素等誘(you)導的(de)實驗(yan)性肺(fei)纖(xian)維(wei)化(hua)(hua)(hua)中均有(you)NF-κB被激(ji)活(huo)。因(yin)此，本發明(ming)(ming)可通過抑制NF-κB而起到抗炎作用。
因此，蛤芒肺纖(xian)方可用于開(kai)發抗肺纖(xian)維化(hua)的新藥，特別是(shi)針(zhen)對抗腫瘤化(hua)療藥物造成的肺纖(xian)維化(hua)。