擴大培養后抽提質粒。將擴大培養的菌液采用PET載體通用引物測序，測序反應由上海英濰捷基貿易有限公司完成，測序結果如圖6所示。
[0080]采用PCR方法克隆含有Ndel和Xhol酶切位點的白細胞介素_1受體拮抗劑_親水性非重復序列多肽基因，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。實驗結果如圖7所示:PCR產物的大小在900bp左右，與白細胞介素-1受體拮抗劑的目的基因大小(897bp)相符；
[0081]PCR反應I1:在0.2ml的PCR管中加入以下成分并混合均勻:
[0082]2X Taq Mix25 μ 1 ;上游引物 2 μ 1 ;下游引物 2 μ 1 ；cDNAl μ 1 ;超純水 20 μ 1。
[0083]PCR 反應程序為:94°C，5min ；94°C，30s ；55°C, 30s ；72°C, lmin。一共進行 30 個循環反應。最后，72°C，30min。
[0084]實施例4、親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白的表達
[0085]將測序正確的pET28a_親水性非重復序列多肽與白細胞介素_1受體拮抗劑融合蛋白編碼基因質粒轉化感受態大腸桿菌BL21 (DE3) condonplus,涂布于硫酸卡那霉素和氯霉素抗性LB平板，37°C培養過夜。隨機挑取平板上4個單菌落，擴大培養，按1 %的比例轉接至3ml新鮮LB試管中，37°C震蕩培養至0D600 ^0.6時，分別取樣加入終濃度為0.5mM和ImM的IPTG，繼續震蕩培養3小時，取1ml菌液離心收集菌體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析。實驗結果如圖8所示，與未經IPTG誘導對照組相比，IPTG誘導的實驗組在40KDa附近有目的蛋白表達，大小與預期相符。
[0086]實施例5、親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白的純化
[0087]取誘導后的大腸桿菌,8000rpm離心15min收集菌體。將菌體用生理鹽水進行洗滌后，按每g菌體加入5ml生理鹽水，將菌體重懸，進行超聲破碎，其中破碎時間2s，間隔2s，共進行8次循環，每次破碎4min。將破碎的菌液8000rpm離心15min,收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析。取破碎后的上清上樣至生理鹽水平衡的鎳柱，并采用含不同濃度咪唑的生理鹽水進行梯度洗脫，收集洗脫液，進行SDS-PAGE電泳檢測。實驗結果如圖9所示。將純化到的目的蛋白溶液置于生理鹽水中透析，除去其中的咪唑，獲得親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白。
[0088]實施例6、親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白的鑒定
[0089]融合蛋白采用免疫印跡方法進行鑒定。取純化的融合蛋白樣品5 μ g上樣于點樣孔中，100V電壓恒壓電泳。電泳結束后，取出凝膠進行電轉，100mA恒流轉膜120min。轉膜后，將PVDF膜取出，用TBS漂洗3次，每次5min ;漂洗之后加入適量的3%牛血清白蛋白，封閉處理lh ;棄去封閉液，用TBST快速漂洗3次，隨后用TBST洗膜3次，每次lOmin。加入抗白細胞介素-1受體拮抗劑單克隆抗體，4°C反應過夜；用TBST洗膜3次，每次lOmin ;室溫孵育二抗lh。將膜用TBST漂洗3次，每次lOmin。使用化學發光試劑盒進行顯色，曝光拍照。實驗結果如圖10所示:抗白細胞介素-1受體拮抗劑抗體可與目的條帶特異性結合，且信號較強。說明基因工程構建的親水性非重復序列多肽-白細胞介素-1受體拮抗劑大腸桿菌工程菌表達出的蛋白質為親水性非重復序列多肽-白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白。
[0090]實施例7、親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白的活性測定
[0091]親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白的活性測定采用A375.S2細胞殺傷中和試驗進行。取白細胞介素1受體拮抗劑參考品，以1ml無血清的MEM培養基(含4ng/ml的白細胞介素_1β)完全溶解，并預稀釋至100Au/ml。采用同樣的方法稀釋待檢樣品，將預稀釋的參考品和待檢樣品以上述培養液于96孔培養板上進行3倍系列稀釋，同稀釋8個稀釋度，每個稀釋度設3個復孔。A375.S2細胞以含10%胎牛血清的MEM培養基在37°C，5% C02及飽和濕度下培養生長成單層時傳代，48小時后消化收集細胞，制成8.0X104個/ml的細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μ 1。再加入稀釋好的參考品和待檢樣品，每孔ΙΟΟμ 1，于37°C，5% 0)2及飽和濕度下繼續培養72小時，加入CCK-8，放置30分鐘，并于450nm吸光值下進行測定，繪制細胞存活曲線。實驗結果如圖11所示:親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白的活性與原型的白細胞介素-1受體拮抗劑活性相似，無顯著差異。
[0092]實施例8、親水性非重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑融合蛋白的藥代動力學實驗
[0093]取雄性ICR小鼠5只，按16mg/kg劑量皮下注射給藥，眼眶取血采集每個時間點的血樣，再將血樣離心30min后分離血清，-20°C保存。具體采血時間點為0，5，15,30min,1，2，4，8，12，24h。采用人IL1RA檢測試劑盒檢測血樣濃度；按照試劑盒要求準備好所有溶液和標準工作液以及條板，檢測結果如圖12所示。
【主權項】
1.一種長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，其特征在于，該重組融合蛋白是由N-端白細胞介素-1受體拮抗劑與C-端天然存在的親水性無重復序列多肽融合制成； 所述天然存在的親水性無重復序列多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示； 所述白細胞介素-1受體拮抗劑的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.根據權利要求1所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，其特征在于，所述的白細胞介素-1受體拮抗劑選自人白細胞介素-1受體拮抗劑原型及其突變型。3.根據權利要求1所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，其特征在于，編碼所述的親水性無重復序列多肽的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。4.根據權利要求1所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，其特征在于，編碼所述的親水性無重復序列多肽的適合于大腸桿菌原核表達的核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示。5.編碼權利要求1、3、4任一項所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于:其序列如SEQ ID N0.5所示。6.根據權利要求1所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，其特征在于，所述的親水性無重復序列多肽以SEQ ID N0.1所述氨基酸序列為單位進行重復組合，與白細胞介素-1受體拮抗劑的N-端或C-端進行融合，其組合方式為N-端白細胞介素-1受體拮抗劑和C-端親水性無重復序列多肽的組合。7.根據權利要求6所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，其特征在于，所述的親水性無重復序列多肽與白細胞介素-1受體拮抗劑之間或多肽之間的融合為直接融合或間接融合。8.根據權利要求7所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白，其特征在于，所述白細胞介素-1受體拮抗劑與親水性無重復序列多肽之間或親水性無重復序列多肽之間進行間接融合所需氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。9.含有所述的編碼親水性無重復序列多肽的核苷酸序列，和編碼所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白的核苷酸序列的載體。10.含有所述的編碼親水性無重復序列多肽的核苷酸序列，和編碼所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白的核苷酸序列的宿主細胞。11.權利要求1?8任一項所述的長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白在制備治療類風濕性關節炎、糖尿病、動脈粥樣硬化、痛風、炎性腸病、紅斑狼瘡、乳腺癌、黑色素瘤，阿爾茲海默病、多發性硬化等神經退行性疾病、感染性疾病或惡性腫瘤藥物中的用途。
【專利摘要】本發明涉及生物制藥領域。提供了一種長效白細胞介素-1受體拮抗劑重組融合蛋白及其制備方法，本發明解決的關鍵技術問題是在延長白細胞介素-1受體拮抗劑的體內半衰期的同時保持其活性，降低免疫原性。本發明的重組融合蛋白是由N-端白細胞介素-1受體拮抗劑與C-端天然存在的親水性無重復序列多肽融合的重組蛋白；其能減少白細胞介素-1受體拮抗劑的免疫原性，延長白細胞介素-1受體拮抗劑在體內的半衰期；該融合蛋白可在大腸桿菌中高效表達，且制備工藝簡單，可用于大規模的藥物級融合蛋白的生產和制備。進一步用于制備治療類風濕性關節炎、糖尿病、動脈粥樣硬化及炎癥和神經退行性疾病的藥物。
【IPC分類】C07K19/00, A61P25/00, A61P1/00, A61P9/10, A61P19/02, A61P3/10, A61K38/20, A61P19/06, A61K47/48, A61P25/28, A61P37/02, A61P29/00, C12N15/62, A61P35/00
【公開號】CN105367663
【申請號】CN201410438971
【發明人】鞠佃文, 李玉彬, 錢曉璐
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月31日