一種抗手足口病特異性納米抗體及其效價測定方法
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種抗手足口病抗體及其效價測定方法，具體地說，是一種抗手足口病特異性納米抗體及其效價測定方法；屬于免疫學技術領域。
【背景技術】
[0002]手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，多發生于5歲以下的嬰幼兒，成人也偶見發生，可引起發熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，具有很強的傳染性，可以通過玩具、食具、鼻咽分泌物、飛沫等多種途徑傳染。其癥狀表現為:急性起病，發熱，手或腳掌部出現斑丘疹和皰疹，臀部或膝蓋也可以出現皮疹。皮疹周圍有炎性紅暈，皰內液體較少；口腔粘膜出現散在的皰疹，疼痛明顯。部分患者伴有咳嗽、流涕、食欲不振、惡心、嘔吐和頭疼等癥狀。少數患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥，個別重癥患者如果病情發展快，會導致死亡。
[0003]引發手足口病的腸道病毒有20多種，其中腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CoxA16)最為常見。1957年在新西蘭首次報道，1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出HFMD命名，60年代以后，許多國家和地區多次報道該病的流行。早期發現的手足口病的病原體主要是CoxA16型，1969年分離并首次確認EV71病毒。1981年在上海首次報道本病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林和廣東等10幾個省市均有報道。1995年武漢病毒研究所從手足口病人中分離出EV71，1998年深圳市衛生防疫站從患者標本中分離出EV71病毒。
[0004]1993年，Hamers-Casterman等報道了在胳駐科動物(單峰駐、雙峰駐、美洲駐等)體內存在一種只含重鏈不含輕鏈的天然重鏈抗體(Heavy chain antibody, HCAb)。
[0005]由于駱駝重鏈抗體是純天然的，不能直接作用于人，或者為人類所用。因此克隆駱駝體內重鏈抗體的可變區后，得到的僅有一個重鏈可變區組成的單域抗體，稱之為重鏈可變區基因抗體(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH), VHH抗體是迄今為止發現的具有結合抗原功能的最小分子量抗體片段，分子量為15KD，僅為常規抗體的1/10，其分子高度4.8nm，直徑2.2nm，故又被稱為納米抗體(Nanobody)。
[0006]目前，雖然已有針對預防HFMD的疫苗等，臨床用藥主要有抗病毒藥、中藥和抗菌藥等，治療效果不理想，而且有副作用，影響兒童健康。此外，雖現已有治療手足口病的抗體，但是由于傳統抗體的一些缺點，如:純度低、穩定性差及特異性差等特點，使其在治療手足口病方面有了一定的局限性。因此，本發明的抗手足口病特異性納米抗體不但能有效治療手足口病，而且相比于傳統抗體而言，具有其獨特的優點。

【發明內容】

[0007]針對上述不足，本發明的目的在于提供一種分子量小、水溶性好、特異性強、穩定性高的抗手足口病特異性納米抗體，本發明還提供該抗手足口病特異性納米抗體的效價測定方法。
[0008]為解決上述技術問題，本發明提供的前一個技術方案是這樣的:
[0009]—種抗手足口病特異性納米抗體，所述的抗手足口病特異性納米抗體依次通過下述步驟制得:
[0010]1)采用滅活純化的EV71型病毒株制成可溶性抗原；
[0011]2)用0.01M的磷酸鹽緩沖液將步驟1)制備的可溶性抗原配成0.8-1.2mg/ml抗原液，與弗氏完全佐劑按體積比1:0.8-1.2充分乳化后制得免疫抗原；
[0012]3)采用步驟2)制備的免疫抗原多點注射雙峰駱駝背部皮下，平均500-700 μ L/只，免疫周期為12-18天，中間加強免疫3次，采用初免相同免疫方法和劑量，免疫4個周期后，靜脈取血，收集血清，3-5°C冰箱保存備用；
[0013]4)將收集到的血清，通過PEG三步沉淀法和改進水體綜合PEG法進行純化，得到納米抗體。
[0014]上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟1)所述的制備抗原是將EV71病毒液接種到生長至單層的橫紋肌肉細胞中，每瓶加0.5mL，放入0)2培養箱中培養至90%左右細胞出現細胞病變時收獲，_15-25°C凍融2-4次，3-5°C時以6000-10000rpm離心0.5-1.5h，收集病毒液3-5°C lOOOOrpm離心1.5-2.5h，棄上清，沉淀用PBS緩沖液懸浮；
[0015]2) CsCl密度梯度離心純化病毒抗原
[0016]將CsCl裝入梯度離心管中，輕輕吹打至溶解，3-5°C時以12000-18000rpm離心10-15h，3-5°C保存過夜，次日3-5°C 18000-22000rpm離心3_5h，以去除殘余CsCl和上清液，加入PBS稀釋純化病毒液3-5°C，即得可溶性抗原。
[0017]進一步的，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟2)所述的磷酸鹽緩沖液pH7.0-7.8o
[0018]進一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟3)所述的加強免疫采用初免相同免疫方法和劑量。
[0019]進一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟4)所述的PEG三步沉淀法是PEG粉末加入到駱駝血清中使其終濃度為3-6%，調PH值至7.0-7.5，充分混勻后3_5°C，離心分離后過濾，棄沉淀；取上清液中加入PEG粉末使其終濃度為8.0-10.0%，調PH值至7.0-7.5，充分混勻后3-5°C，離心分離后過濾，棄上清液，沉淀用3-5°C PBS緩沖液溶解后再加入PEG至終濃度為10-18%，離心分離后過濾后再次棄上清，再用PBS溶解沉淀，轉入透析袋，透析48h以上，每12h更換一次透析液，最終收集截留物質，-50-60°C真空冷凍干燥至粉末，_20°C保存。
[0020]進一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟4)所述的改進水體綜合PEG法是駱駝血清與3-5°C凍存蒸餾水2:6-10混勻，調PH值至5.0-5.5，冰箱3_5°C靜置過夜；3-5 °C離心分離后過濾后取沉淀。
[0021]進一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，所述的PEG粉末為PEG 6000粉末。
[0022]本發明還有一個技術方案是提供該抗手足口病特異性納米抗體的效價測定方法，該方法依次包括下述步驟:
[0023]1)包被
[0024]將純化過的EV71病毒抗原用0.01M PBS 1:1000稀釋至最佳包被溶度后包被于96孔酶標板上，37°C溫育lh后，4°C過夜，次日甩干孔中液體，用PBST洗滌1次，吸水紙拍干；
[0025]2)封閉
[0026]用含3%脫脂奶粉的0.01M PBS液封閉，37°C溫育lh后甩干，PBST洗滌3次，每次2-5min，吸水紙拍干；
[0027]3)加一抗
[0028]駱駝抗體血清用0.01M PBS 倍比系列 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1: 32000、1:64000、空白PBS稀釋后加入96孔酶標板，PBS作為空白對照，37°C溫育lh,甩干，PBST洗滌3次，每次2-5min，吸水紙拍干；
[0029]4)加酶標二抗
[0030]每孔加入用0.01MPBS 1:8000稀釋的兔抗駱駝抗體100 μ L，置37°C溫育lh后甩干，PBST洗滌3次，每次2-5min，吸水紙拍干；
[0031]5)顯色和讀數
[0032]用新鮮配制的TMB顯色液，置37°C溫育顯色約15min后，每孔加50 μ L 2Μ H2S04if液終止反應，立即用酶標儀測定各孔在0D 450nm處吸光值，以免疫駱駝抗體與未免疫駱駝抗體陰性對照0D值之比大于2.1，且陰性駱駝抗體吸光值大于0.1做為抗體陽性的判定閾值，陽性孔0D值多2.1倍陰性孔0D值的最高稀釋倍數為駱駝抗體的效價。
[0033]與現有技術相比，本發明所制備的納米抗體，具有分子量小、可水溶性好、特異性強等特點；且耐熱、耐酸，穩定性高。這些獨特的優點使納米抗體在臨床和基礎科學的應用中起著重要的作用。因此，納米抗體在腫瘤的診斷和治療、食品科學、抗病毒等領域都有較大的應用價值與前景。
【附圖說明】
[0034]圖1是抗EV71病毒納米抗體純化分析圖；
[0035]圖2是抗EV71病毒納米抗體效價消長規律圖；
[0036]圖3是雙向免疫瓊脂擴散圖；
[0037]圖4是蛋白印跡分析抗EV71病毒納米抗體圖；
[0038]圖5是特異性納米抗體體外中和活病毒分析圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結合【具體實施方式】，對本發明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制，任何人在本發明權利要求保護范圍內所做的有限次的修改，仍在本發明的權利要求保護范圍之內。
[0040]實施例1
[0041]抗手足口病納米抗體的制備
[0042]1、抗原制備
[0043]1)將EV71病毒液接種到生長至單層的RD (橫紋肌肉細胞)細胞中，每瓶加0.5mL，放入0)2培養箱中培養至90%左右細胞出現CPE(細胞病變)時收獲，-20°C凍融3次，4°C 8000rpm，lh離心，收集上清液(病毒液)，4°C lOOOOrpm離心2h，棄上清，沉淀用PBS緩沖液懸浮。
[0044]2) CsCl密度梯度離心純化病毒抗原
[0045]稱取3.2g CsCl裝入7.6mL梯度離心管中，輕輕吹打至溶解，水平轉頭4°C 15000rpm，離心12h，4°C保存過夜。次日4°C 20000rpm離心4h，以去除殘余CsCl，棄上清，加入300 μ L PBS稀釋純化病毒液4°C保存。
[0046]2、免疫
[0047]用PBS溶解純化后EV71抗原，配成lmg/ml溶液。取上述溶液0.6ml與弗氏完全佐劑按1:1混合后充分乳化，采用背部皮下多點注射雙峰駝，600 μ L/只；免疫周期為15天，加強免疫3次，加強免疫采用弗氏不完全佐劑與病毒液按1:1乳化，采用初免相同免疫方法和劑量。加強免疫3次后收集血清，分裝后，4°C冰箱保存備用。
[0048]3、納米抗體的分離純化
[0049]分別采用PEG三步沉淀法和改進水體綜合PEG法純化免疫后獲得的駱駝血清蛋白。結果見圖1。
[0050]1)PEG三步沉淀法:PEG 6000粉末加入到駱駝血清中使其終濃度為4.5%，調PH值至7.2，充分混勻后4°C，8000rpm離心30min，過濾，棄沉淀。上清液中加入PEG 6000粉末使其終濃度為9.0%，調PH值至7.2，充分混勻后8000rpm 4°C離心30min，棄上清液。沉淀用適量4°C PBS緩沖液(