一株產揮發性抑菌氣體的拮抗菌的篩選、鑒定及應用
【專利摘要】本發明提供一株產揮發性抑菌氣體的拮抗菌株12a及其在防治果蔬病害中的應用。本發明公開的拮抗菌株12a為死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)，保藏號為CGMCC No.12179。本發明的拮抗菌株12a是在未施用化肥農藥的肥城桃園中采集桃樹根際土壤分離獲得的，其發酵液中產生的揮發性抑菌氣體對桃褐腐病(Monilinia fructicola)具有強拮抗作用，同時對鏈格孢菌(Alternaria mali)引起的蘋果褐斑病、由長喙殼菌(Ceratocystis fimbriata Ellis.Et Halsted)引起的甘薯黑斑病、由青霉菌(Penicillium italicum Wehmer)引起的柑橘青霉病和由細交鏈格孢(Alternaria alternata)引起的冬棗黑斑病也有明顯的抑制作用，可以有效防治多種果蔬病害，是一種生防效果好、無污染、防治范圍廣、安全生態的生物防治潛力菌株，有廣闊的市場應用前景。CGMCC No.04
【專利說明】
一株產揮發性抑菌氣體的拮抗菌的篩選、鑒定及應用 (一)
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物和生物防治領域中的一種拮抗菌的篩選、鑒定和應用，特別是 涉及產生揮發性抑菌氣體的菌液熏蒸在防治果蔬采后病害中的應用。 (二)
【背景技術】
[0002] 果蔬采后病害導致的巨大損失已成為全球性的問題。目前，控制果蔬采后病害的 主要手段是使用化學殺菌劑，雖然取得較好的防治效果，但是長期使用化學殺菌劑，使病菌 產生了抗藥性，降低了藥劑的防病效果，最終導致化學殺菌劑的使用劑量及其化學殘留量 大大加重，對人類的健康威脅也加大。因此，迫切需要尋求一些新的、安全高效的防腐技術， 來逐步減少化學殺菌劑在采后果蔬上的使用。
[0003] 借鑒采前作物病害生物防治的思路，人們提出了果蔬采后病害生物防治的設想。 生物防治具有不污染環境、無農藥殘毒、不產生抗藥性、處理費用低廉等優點，受到人們的 廣泛關注。利用拮抗菌控制果蔬采后病害的研究工作始于20世紀80年代，經過10多年的研 究已從實驗室走向商業化應用，許多研究都證明利用拮抗微生物來控制病害是一項具有潛 力的新興技術。本實驗通過研究拮抗菌對采后果蔬病原菌和病害的抑制作用，為實現安全 無毒的果蔬采后保鮮提供新方法。
[0004] 從土壤中分離篩選出拮抗菌株通過菌液中產生的揮發性抑菌氣體熏蒸的方法來 有效防治果蔬采后病害的技術并不多見，該方法簡便高效，可減少采后病害帶來的巨大損 失，有利于在生產實踐中推廣應用。 (三)

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一株能夠產生揮發性抑菌氣體的拮抗菌株12a，經16S rDNA 序列比對鑒定為死谷芽孢桿菌(Bacillus vailismortis)，該菌株已于2016年03月04日在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保存登記，保存地址為北京市北辰 西路1號院3號，保藏號為CGMCC No. 12179,建議分類命名為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis)。用該菌株體外產生的揮發性氣體控制多種常見的果蔬采后病害，具有安全 高效、操作簡便的優點。
[0006] 本發明所采取的技術方案如下。
[0007] 本發明的拮抗菌株12a的分離篩選方法為：
[0008] 1、在未施用化肥農藥的桃園中采集桃樹根際土壤，采用稀釋分離法，做好一系列 的土壤稀釋液10-\ 10-2、10-3、10-4，用移液槍分別吸取10-2、10- 3、10-4土壤稀釋液0. lmL加到 NA培養基平板上，用無菌涂布器涂勻，標明編號，放置一小時后將培養皿反轉，于37°C中培 養。
[0009] 2、從培養的第二天起，根據菌落形態等特點挑選細菌單菌落，分別移接到NA培養 基上，培養48h后用于后續試驗。經純化的菌株于NA斜面培養基上，4°C保存。
[0010] 3、采用平板對扣法篩選拮抗菌。在PDA平板中央接種桃褐腐菌菌餅，在NA平板中央 接種分離的細菌菌餅，將接有菌的培養皿去蓋、對扣(接有細菌的放在下方，接有桃褐腐菌 的放在上方）、密封，每個處理3皿。室溫下培養96h，以不接種細菌的平板作對照，測定其抑 菌率。篩選出對桃褐腐菌具有較強拮抗作用的拮抗菌株12a。
[0011] 本發明的拮抗菌株12a在防治多種果蔬采后病害上的應用的步驟包括：
[0012] 用振蕩培養48h的1000mL拮抗菌菌液熏蒸果實20~30min，將熏蒸過的果實取出室 溫放置，每果刺1個3mmX 3mmX 3mm的傷口，再分別接種1 X 104cfu/mL的相應病原菌的孢子 懸浮液20yL，之后在20 ± 1°C貯藏觀察。
[0013] 上述的防治果蔬采后病害的應用中，所述果實為肥城白里桃、元帥蘋果、砂糖橘、 甘薯蘇薯8號、沾化冬棗。
[0014] 上述的防治果蔬采后病害的應用中，所述果實為處于生理成熟期，無機械傷害，無 病蟲害，大小均一的果實。
[0015] 本發明的有益效果在于：
[0016] 選用拮抗菌菌液產生的揮發性抑菌氣體熏蒸果實，此法操作簡單、安全性高、對果 疏無殘留毒性，具有很尚的應用價值。
[0017] 在處理和貯藏中不使用任何有毒試劑，能高效防治多種果實采后病害，具有廣闊 的市場前景。
[0018] 提供一種新型、安全、高效的拮抗菌株，可用于肥城白里桃、砂糖橘、甘薯蘇薯8號 和沾化冬棗等多種果實采后病害的防治。 (四）
【附圖說明】
[0019] 圖1是基于菌株12a的16S rDNA構建的系統發育樹。
[0020]圖2為肥城白里桃未經拮抗菌液熏蒸處理和經拮抗菌菌液熏蒸處理后，貯藏第4天 的效果圖片。
[0021]圖3為砂糖橘未經拮抗菌菌液熏蒸處理和經拮抗菌菌液熏蒸處理后，貯藏第5天的 效果圖片。
[0022]圖4為沾化冬棗未經拮抗菌菌液熏蒸處理和經拮抗菌菌液熏蒸處理后，貯藏第5天 的效果圖片。 (五)
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖表和【具體實施方式】來對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技 術人員更了解本發明，但并不以此限制本發明。
[0024]實施例1:拮抗菌株12a的篩選
[0025] 在未施用化肥農藥的桃園中采集桃樹根際土壤，采用稀釋分離法，做好1(^、10一2、 10一3和10- 4的土壤稀釋液，用移液槍分別吸取10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液O.lmL加到NA培 養基平板上，用無菌涂布器涂勻，標明編號，放置一小時后將培養皿反轉，于37°C中培養。從 培養的第二天起，根據菌落形態等特點挑選細菌單菌落，分別移接到NA培養基上，培養48h 后用于后續試驗。經純化的菌株于ΝΑ斜面培養基上，4°C保存。
[0026] 采用平板對扣法篩選拮抗菌。在PDA平板中央接種桃褐腐菌菌餅，在NA平板中央接 種分離的細菌菌餅，將接有菌的培養皿去蓋、對扣(接有細菌的放在下方，接有桃褐腐菌的 放在上方）、密封，每個處理3皿。室溫下培養96h，以不接種細菌的平板作對照，測定其抑菌 率。其中，抑菌率（％ )=(對照菌落直徑-對峙菌落直徑)/對照菌落直徑X 100。結果表明，拮 抗菌12a對桃褐腐菌的的抑制效果最明顯，抑菌率可達80.23%。
[0027]經過菌種鑒定后，對16S rDNA序列在ncbi核糖體數據庫上比對，選擇親緣關系遠 近不同的16S rDNA序列做系統發育樹，12a被鑒定為死谷芽孢桿菌，與Bacillus vallismortis NBRC 101236T(AB681417)有最高的同源性，同源性達99%以上。該菌株已于 2016年03月04日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保存登記，建議 分類命名為死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)，保存地址為北京市北辰西路1號院3 號。
[0028]實施例2:在防治桃褐腐病上的應用
[0029]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養基中振蕩培養48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液（對照下層無菌液），上層放置肥城白里桃，用凡士林密封罐蓋，熏蒸 20min后將果實取出。為使染菌量均一，每果刺1個3mmX3mmX3mm的傷口，再分別接種IX 104cfu/mL的桃褐腐菌的孢子懸浮液20yL，將上述處理的果實于20土 1°C保濕貯藏，每隔24h 測量病斑直徑，計算抑菌率，詳情見表1。每次每個處理20個果實，該試驗重復三次。
[0030] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X100%
[0031] 實施例3:在防治蘋果黑斑病上的應用
[0032]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養基中振蕩培養48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置元帥蘋果，用凡士林密封罐蓋，熏蒸20min 后將果實取出。為使染菌量均一，每果刺1個3mm X 3mm X 3mm的傷口，再分別接種1 X 104cfu/ mL的蘋果鏈格孢菌的孢子懸浮液20yL，將上述處理的果實于20土 1°C保濕貯藏，每隔24h測 量病斑直徑，計算抑菌率，詳情見表1。每次每個處理20個果實，該試驗重復三次。
[0033] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0034]實施例4:在防治柑橘青霉病上的應用
[0035]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養基中振蕩培養48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置砂糖橘，用凡士林密封罐蓋，熏蒸20min后 將果實取出。為使染菌量均一，每果刺1個3mmX3mmX3mm的傷口，再分別接種lX10 4cfu/mL 的柑橘青綠霉的孢子懸浮液20yL，將上述處理的果實于20±1°C保濕貯藏，每隔24h測量病 斑直徑，計算抑菌率，詳情見表1。每次每個處理8個果實，該試驗重復三次。
[0036] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0037]實施例5:在防治甘薯黑斑病上的應用
[0038]將保存的拮抗菌12a接種到1000mL NB液體培養基中振蕩培養48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置甘薯，用凡士林密封罐蓋，熏蒸30min后將 果實取出。每果刺3個3mmX 3mmX 3mm的傷口，再分別接種1 X 104cfu/mL的長卩彖殼菌的孢子 懸浮液20yL，將上述處理的果實于20土 1°C保濕貯藏，每隔24h測量病斑直徑，計算抑菌率， 詳情見表1。每次每個處理8個果實，該試驗重復三次。
[0039] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0040]實施例6:在防治采后沾化冬棗褐斑病上的應用
[0041 ]將保存的拮抗菌12a接種到lOOOmL NA液體培養基中振蕩培養48h后，在密封罐的 隔板下層倒置菌液(對照下層無菌液），上層放置沾化冬棗，用凡士林密封罐蓋，熏蒸20min 后將果實取出。將上述處理的果實于20±1°C保濕貯藏，每天觀察一次，計算自然發病率，詳 情見表1。每次每個處理40個果實，該試驗重復三次。
[0042] 表1拮抗菌12a對多種果蔬采后病害的控制效果
[0043]
[0044] 注:每一列的不同字母(a，b)表示同一種果蔬處理和對照間在P〈0.05水平上有顯 著性差異。
[0045] 由表1可見，未經拮抗菌12a菌液熏蒸的肥城白里桃、元帥蘋果、砂糖橘、甘薯蘇薯8 號和沾化冬棗在第2天發病率分別達到37.5%、10%、12.5%、20%和32.5%，而經菌液熏 蒸處理的果實第3天才開始發病，而且發病率和病斑直徑顯著小于對照處理，有較高的抑菌 率，說明拮抗菌12a菌液熏蒸可以抑制桃褐腐病、砂糖橘青霉病、甘薯黑斑病和冬棗褐斑病 的發病率，抑制病斑擴展，可以有效延緩采后病害的發生，減輕采后病害的侵染情況。
[0046] 綜上所述，本發明提供的可產生揮發性抑制氣體的拮抗菌對肥城桃褐腐病、柑橘 青綠霉病、甘薯黑斑病、沾化冬棗的采后病害均有較強的拮抗作用，可有效控制多種果實的 采后病害，在該領域具有廣闊的應用前景。
【主權項】
1. 一株產揮發性抑菌氣體的拮抗菌株12a，經16S rDNA鑒定為死谷芽孢桿菌(Bacillus vailismortis)。該菌株于2016年3月4日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌 種保藏中心進行了登記和檢測，保藏號為:CGMCC No. 12179。2. 根據權利要求1所述拮抗菌株12a的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟:拮抗菌株 的分離純化和篩選。3. 根據權利要求2所述拮抗菌株12a的篩選方法，其特征在于，所述的拮抗菌的分離純 化包括:在未施用化肥農藥的桃園中采集桃樹根際土壤，采用稀釋分離法，用移液槍分別吸 取不同濃度的土壤稀釋液加到NA培養基平板上，用無菌涂布器涂勻，標明編號，放置一小時 后將培養皿反轉，于37°C中培養。從培養的第二天起，根據菌落形態等特點挑選細菌單菌 落，分別移接到NA培養基上，培養48h后用于后續試驗。經純化的菌株于NA斜面培養基上，4 °C保存。4. 根據權利要求2所述拮抗菌株12a的篩選方法，其特征在于，所述的拮抗菌的篩選包 括:采用平板對扣的方法篩選拮抗菌。在I 3DA平板中央接種桃褐腐菌菌餅，在NA平板中央接 種分離的細菌菌餅，將接有菌的培養皿去蓋、對扣(接有細菌的放在下方，接有桃褐腐菌的 放在上方）、密封，每個處理6皿。室溫下培養96h，以不接種細菌的平板作對照，測定其抑菌 率。篩選出對桃褐腐菌具有較強拮抗作用的拮抗菌株12a。5. 根據權利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應用，其特征在于，步 驟如下：用振蕩培養48h的1000 mL菌液產生的揮發性氣體熏蒸果實20~30min后，進行處理， 然后貯藏。6. 根據權利要求1所述拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應用，其特征在于，所述 處理步驟為將熏蒸過的果實取出室溫放置，每果刺1個3mmX3mmX3mm的傷口，再分別接種1 X IO5Cfu/mL的相應病原菌的孢子懸浮液20yL。7. 根據權利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應用，其特征在于，所 述貯藏溫度為20±1°C。8. 根據權利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應用，其特征在于，所 述果蔬為肥城白里桃、元帥蘋果、砂糖橘、甘薯蘇薯8號和沾化冬棗。9. 根據權利要求1所述的拮抗菌株12a在防治果蔬采后病害中的應用，其特征在于，所 述果蔬為處于生理成熟期，無機械傷害，無病蟲害，大小均一的果蔬。
【文檔編號】C12N1/02GK105907669SQ201610270739
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】石晶盈, 殷曉慧, 王慶國, 張暢
【申請人】山東農業大學