本發(fa)明涉及(ji)(ji)一種新(xin)化合(he)物(wu)(wu)E)-2-(5-((4-甲(jia)氧(yang)基-2-(三(san)氟甲(jia)基)喹啉-6-基)甲(jia)氧(yang)基)-2-((4-(三(san)氟甲(jia)基)苯甲(jia)基)氧(yang)基)-苯亞甲(jia)基)己酸(MTTB)及(ji)(ji)其(qi)衍(yan)生物(wu)(wu)。本發(fa)明的所述化合(he)物(wu)(wu)用作(zuo)選擇性過氧(yang)化物(wu)(wu)酶體增殖物(wu)(wu)活化受體γ(PPARγ)拮(jie)抗(kang)劑(ji)并且(qie)適用于治療免疫相關性疾(ji)病如全(quan)身性炎癥(zheng)、膿毒癥(zheng)和膿毒性休克。

描述

全身(shen)性炎(yan)癥(zheng)、膿(nong)(nong)(nong)毒癥(zheng)和(he)(he)膿(nong)(nong)(nong)毒性休克(ke)是危及(ji)生(sheng)命的(de)(de)(de)(de)并發癥(zheng)，每(mei)年引起約60000人(ren)死亡，因此在(zai)德國(guo)是第三最常見的(de)(de)(de)(de)死亡原因。這(zhe)種疾患(huan)(huan)的(de)(de)(de)(de)發病率(lv)由于(yu)(yu)人(ren)口老齡化及(ji)免(mian)(mian)疫受損和(he)(he)危重患(huan)(huan)者數量越來越多而(er)(er)上(shang)升。膿(nong)(nong)(nong)毒癥(zheng)包(bao)括復雜(za)的(de)(de)(de)(de)臨床綜合征，該綜合征由身(shen)體(ti)對侵入身(shen)體(ti)的(de)(de)(de)(de)細(xi)菌和(he)(he)/或真菌病原體(ti)引起的(de)(de)(de)(de)感染(ran)的(de)(de)(de)(de)反(fan)應(ying)(ying)而(er)(er)引起。通常，有(you)效、復雜(za)的(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫級聯反(fan)應(ying)(ying)確(que)保對人(ren)類中(zhong)微(wei)生(sheng)物侵入的(de)(de)(de)(de)迅(xun)速、保護(hu)性反(fan)應(ying)(ying)。然而(er)(er)，免(mian)(mian)疫防御缺陷可使感染(ran)變得(de)確(que)立。進(jin)一步地(di)，過(guo)(guo)度或調控不力的(de)(de)(de)(de)反(fan)應(ying)(ying)可通過(guo)(guo)內源產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)炎(yan)癥(zheng)化合物的(de)(de)(de)(de)不適應(ying)(ying)性釋放而(er)(er)傷害宿主(zhu)。膿(nong)(nong)(nong)毒癥(zheng)特征在(zai)于(yu)(yu)高炎(yan)癥(zheng)反(fan)應(ying)(ying)期(hyper inflammatory phase)，接著是低(di)炎(yan)癥(zheng)反(fan)應(ying)(ying)期(hypo inflammatory phase)，后者也被(bei)稱(cheng)為(wei)“免(mian)(mian)疫麻(ma)痹”。具(ju)體(ti)而(er)(er)言，免(mian)(mian)疫麻(ma)痹對于(yu)(yu)患(huan)(huan)者而(er)(er)言至(zhi)關(guan)重要。此時適應(ying)(ying)性免(mian)(mian)疫系統(tong)的(de)(de)(de)(de)T細(xi)胞經歷了凋亡和(he)(he)停滯。因此患(huan)(huan)者往往死于(yu)(yu)繼發性感染(ran)。

目前治(zhi)療膿毒癥(zheng)的(de)方(fang)法(fa)集中在所述疾(ji)病(bing)(bing)的(de)高炎癥(zheng)反應期以(yi)便阻遏疾(ji)病(bing)(bing)進展。然而(er)，目前治(zhi)療很少成功，因為它(ta)們取(qu)決于膿毒癥(zheng)的(de)極早診斷。其它(ta)治(zhi)療方(fang)法(fa)僅靶向所述疾(ji)病(bing)(bing)的(de)癥(zheng)狀。已(yi)知治(zhi)療膿毒癥(zheng)的(de)方(fang)法(fa)包括抗生素、抗體、小分子(zi)和肽、蛋白C、用(yong)氧(yang)的(de)支(zhi)持性療法(fa)、靜脈(mo)注射液和增高血壓的(de)藥物(wu)。

然而，盡(jin)管在(zai)重度感染的(de)(de)治療(liao)中有(you)過去幾十年的(de)(de)重大(da)進展，但膿毒癥的(de)(de)發病率和歸(gui)因于膿毒癥的(de)(de)死亡率持續增長(chang)。因此(ci)，需要用于預防和治療(liao)膿毒癥的(de)(de)新(xin)方法和組合物。

在(zai)(zai)(zai)脂(zhi)肪(fang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內表(biao)(biao)達的(de)(de)過(guo)(guo)氧化(hua)物(wu)(wu)酶體(ti)(ti)(ti)增殖(zhi)物(wu)(wu)活(huo)化(hua)受(shou)體(ti)(ti)(ti)γ(PPAR-γ或PPARG)是多功能核(he)受(shou)體(ti)(ti)(ti)型(xing)轉(zhuan)錄因子，其通(tong)過(guo)(guo)響應于前(qian)列腺(xian)素類和(he)噻唑烷二酮(TZD)配(pei)體(ti)(ti)(ti)來調控(kong)脂(zhi)肪(fang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)基因表(biao)(biao)達和(he)分(fen)化(hua)，在(zai)(zai)(zai)胰島素敏感性的(de)(de)控(kong)制中(zhong)起核(he)心作(zuo)用。其還(huan)已(yi)(yi)被鑒定為調節(jie)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)分(fen)化(hua)、癌細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)終末分(fen)化(hua)和(he)炎癥(zheng)過(guo)(guo)程中(zhong)的(de)(de)關鍵作(zuo)用因子。該蛋白(bai)質還(huan)在(zai)(zai)(zai)其它組織(zhi)如結(jie)腸和(he)乳腺(xian)上皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、骨(gu)髓、白(bai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系和(he)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)表(biao)(biao)達，并且在(zai)(zai)(zai)巨噬細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)，已(yi)(yi)經(jing)與TZD的(de)(de)抗(kang)炎作(zuo)用及其對動脈粥樣(yang)硬(ying)化(hua)發(fa)展的(de)(de)影響聯系起來。已(yi)(yi)經(jing)證明在(zai)(zai)(zai)人原(yuan)發(fa)性和(he)轉(zhuan)移性乳腺(xian)腺(xian)癌和(he)阿耳茨海默氏病(Alzheimer's disease)腦部中(zhong)過(guo)(guo)氧化(hua)物(wu)(wu)酶體(ti)(ti)(ti)增殖(zhi)物(wu)(wu)活(huo)化(hua)受(shou)體(ti)(ti)(ti)γ的(de)(de)表(biao)(biao)達升高，而在(zai)(zai)(zai)散(san)發(fa)性結(jie)腸癌已(yi)(yi)經(jing)報道(dao)了等(deng)位(wei)基因變體(ti)(ti)(ti)。

與(yu)核激素受體(ti)(ti)超(chao)家族的(de)其(qi)(qi)它成員一樣，PPARγ的(de)組織和(he)配體(ti)(ti)特(te)異(yi)性(xing)活化(hua)和(he)轉(zhuan)錄(lu)靶基(ji)(ji)因(yin)調控(kong)是多(duo)步過程(Kliewer等(deng)人(ren)(ren)，1994；Seargent等(deng)人(ren)(ren)，2004)。這個(ge)過程涉及幾(ji)種天然和(he)合成配體(ti)(ti)的(de)特(te)異(yi)性(xing)結合(Forman等(deng)人(ren)(ren)，1995；Kliewer等(deng)人(ren)(ren)，1995)，與(yu)維甲類X受體(ti)(ti)α(RXRα)的(de)異(yi)源二(er)聚化(hua)，其(qi)(qi)靶基(ji)(ji)因(yin)啟動子(zi)區內序列特(te)異(yi)性(xing)PPARγ反應(ying)元(yuan)件(PPRE)的(de)識別和(he)相互作用及最(zui)后輔助因(yin)子(zi)和(he)其(qi)(qi)它核輔調控(kong)蛋白的(de)募集(Nolte等(deng)人(ren)(ren)，1998；Chawla等(deng)人(ren)(ren)，2001；Kliewer等(deng)人(ren)(ren)，2001；Spiegelman等(deng)人(ren)(ren)，2004)。

由于其(qi)(qi)在脂肪形成(cheng)和葡萄(tao)糖代謝(xie)中(zhong)的(de)作(zuo)用，其(qi)(qi)中(zhong)PPARγ主要誘導脂肪細(xi)(xi)胞(bao)蛋白質(zhi)(zhi)2(aP2)、分化簇36(CD36)、脂蛋白脂肪酶(mei)(LPL)或葡萄(tao)糖轉(zhuan)運(yun)體(ti)4(GLUT4)的(de)基因(yin)(yin)(yin)表(biao)達，例如，已經將(jiang)其(qi)(qi)作(zuo)為治療(liao)靶標進行深入(ru)研究(Lehmann等(deng)(deng)(deng)人(ren)，1995；Tontonoz等(deng)(deng)(deng)人(ren)，1995)。具有高受體(ti)親和力的(de)最突出的(de)合成(cheng)PPARγ激動劑為噻唑烷二酮(tong)(TZD)。這些用于2型(xing)糖尿病中(zhong)，其(qi)(qi)中(zhong)它(ta)(ta)們提高胰島素敏感性并引起游離葡萄(tao)糖水平隨之降低(Rangwala等(deng)(deng)(deng)人(ren)，2004；Staels等(deng)(deng)(deng)人(ren)，2005)。PPARγ也(ye)可(ke)以與其(qi)(qi)它(ta)(ta)蛋白質(zhi)(zhi)直接結合并抑制信(xin)號轉(zhuan)導。這種能力，稱為反式(shi)阻抑(transrepression)，主要由PPARγ和其(qi)(qi)它(ta)(ta)轉(zhuan)錄因(yin)(yin)(yin)子(如活化B細(xi)(xi)胞(bao)的(de)核因(yin)(yin)(yin)子“κ-輕鏈-增強子”(NFkB)、活化T細(xi)(xi)胞(bao)的(de)核因(yin)(yin)(yin)子(NFAT)或活化蛋白1(AP-1))之間的(de)直接蛋白質(zhi)(zhi)-蛋白質(zhi)(zhi)相(xiang)互作(zuo)用介導(Yang等(deng)(deng)(deng)人(ren)，2000；Wang等(deng)(deng)(deng)人(ren)，2001；Chen等(deng)(deng)(deng)人(ren)，2003)。

這(zhe)樣，PPARγ抑(yi)制促炎信號并誘(you)導抗(kang)炎反應(ying)(Pascual等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2006；Ricote等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2007)。在這(zhe)種情況下，PPARγ受(shou)TZD活化對(dui)減輕炎癥有(you)效。與(yu)(yu)已經(jing)證實的(de)(de)TZD在體(ti)內(nei)的(de)(de)有(you)益作(zuo)用(yong)(yong)和(he)廣泛用(yong)(yong)途相反，它們(men)還(huan)與(yu)(yu)許多(duo)有(you)害副(fu)作(zuo)用(yong)(yong)、嚴重(zhong)(zhong)耐受(shou)性(xing)(xing)(xing)和(he)安全問題相關，包括明顯(xian)增(zeng)重(zhong)(zhong)、外(wai)周水腫、充血性(xing)(xing)(xing)心(xin)力衰竭(jie)和(he)骨折(Nesto等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2003；Nissen等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2007)。另一方面，PPARγ還(huan)誘(you)導凋亡并且因(yin)此發揮免疫(yi)抑(yi)制活性(xing)(xing)(xing)。最(zui)近，PPARγ拮抗(kang)作(zuo)用(yong)(yong)，尤其(qi)是PPARγ拮抗(kang)劑(ji)(ji)(ji)2-氯(lv)-5-硝(xiao)基苯(ben)甲酰(xian)苯(ben)胺(an)(GW9662)(Leesnitzer等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2002)，指導了用(yong)(yong)于各種不(bu)同癌(ai)癥類型，如(ru)乳腺癌(ai)(Seargent等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2004；Burton等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2008)，及免疫(yi)力調(diao)節(jie)和(he)炎癥性(xing)(xing)(xing)疾病(Schmidt等(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，2011)的(de)(de)新(xin)藥物和(he)治療策略的(de)(de)開發。由于GW9962與(yu)(yu)PPARγ蛋白的(de)(de)不(bu)可逆(ni)結合，其(qi)不(bu)適(shi)于治療用(yong)(yong)。增(zeng)進對(dui)PPARγ生理(li)作(zuo)用(yong)(yong)和(he)臨床相關性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)理(li)解已強調(diao)了在避免已知(zhi)副(fu)作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)同時(shi)，對(dui)發現、鑒定和(he)表征新(xin)PPARγ激動劑(ji)(ji)(ji)、拮抗(kang)劑(ji)(ji)(ji)或選(xuan)擇性(xing)(xing)(xing)PPARγ調(diao)節(jie)劑(ji)(ji)(ji)(SPPARγM)的(de)(de)關鍵性(xing)(xing)(xing)需求。

因(yin)此，至今也沒(mei)有(you)(you)用(yong)于治療(liao)或預防特征在于病(bing)理性(xing)炎(yan)癥(zheng)(如膿毒癥(zheng))和全(quan)身性(xing)炎(yan)癥(zheng)的疾病(bing)的滿意(yi)治療(liao)方法。此外，正需要鑒(jian)定具有(you)(you)更有(you)(you)益的毒理學性(xing)質，可應用(yong)于治療(liao)免(mian)疫相關性(xing)疾病(bing)或其(qi)它疾病(bing)的選擇性(xing)PPAR拮抗劑。

以上問題在(zai)第一(yi)方(fang)面中通過式(I)的化合物(wu)或(huo)其立體異構體、衍(yan)生物(wu)或(huo)鹽得以解決：

其中

R₁和R₂獨立地選(xuan)自未取(qu)代、單取(qu)代或多取(qu)代的芳(fang)基(ji)或雜芳(fang)基(ji)，并且

R₁和R₂不同，并且

R₃為未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₀-烷基(ji)(ji)，其中(zhong)所述烷基(ji)(ji)可為直鏈、支鏈或環狀。

在(zai)(zai)本(ben)發明(ming)的(de)上下文(wen)中術(shu)語(yu)“雜芳基”涵蓋(gai)在(zai)(zai)環結(jie)構中具(ju)有至少一個可為氮、氧或(huo)硫的(de)雜原子的(de)單環、雙環或(huo)多環雜芳族(zu)化合(he)物。屬于該定義范圍的(de)代表性(xing)雜芳基，例如，吡啶、喹啉、吡咯、吲哚(duo)、噻吩、苯并(bing)咪唑(zuo)、四唑(zuo)、嘧(mi)啶等。

術語“芳基”指芳香基團，優選(xuan)(xuan)具(ju)有6至10個(ge)(ge)碳(tan)原(yuan)子(zi)，例如苯基、甲(jia)苯基等(deng)。術語“雜(za)取代(dai)基”在本(ben)發明(ming)的(de)意義上應涵蓋具(ju)有至少一個(ge)(ge)非(fei)碳(tan)鏈原(yuan)子(zi)(雜(za)原(yuan)子(zi))，優選(xuan)(xuan)選(xuan)(xuan)自氧、氮或(huo)硫(liu)的(de)雜(za)原(yuan)子(zi)的(de)任何取代(dai)基。

驚人地(di)發現(xian)，在針對PPARγ激(ji)(ji)動劑(ji)試驗時，本發明的化(hua)合物表現(xian)出競(jing)爭性拮(jie)抗作用，與最先(xian)進的PPARγ拮(jie)抗劑(ji)如GW9662相(xiang)比，本發明的化(hua)合物細胞積(ji)累(lei)極高(gao)、細胞毒性地(di)且(qie)PPARγ激(ji)(ji)動作用較小。

本發明的優選實施方案涉及其中R₁和R₂為(wei)單取代或(huo)多取代的(de)芳(fang)基(ji)或(huo)雜芳(fang)基(ji)的(de)化合物。

本發明的另一個實施方案涉及其中R₃為未取代的C₁-C₈烷基，優選為未取代的C₂-C₆烷基，最優選為未取代的直鏈C₄烷基的化合物。

在本發明另外的或替代性實施方案中，R₁可(ke)優選(xuan)為(wei)具有式(shi)(II)的(de)基團，

在式(II)中R₄-R₈獨立地選自H、OH、SH；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、富馬酰基、馬來酰基、琥珀酰基、苯甲酰基或支鏈或經雜原子或芳基取代的酰基；烷氧基取代基，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺酰基，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘、-CN或雜取代基。更優選R₄、R₅、R₇和R₈為H，并且R₆為三氟甲基(-CF₃)。

另外或可選地，本發明的化合物包含為式(III)的基團的R₂，

其中

X和Z獨立地選(xuan)自C或N，

R₉至R₁₂獨立地選自H、羥基；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、富馬酰基、馬來酰基、琥珀酰基、苯甲酰基或支鏈或經雜原子或芳基取代的酰基；烷氧基取代基，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺酰基，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基(ji)、芳基(ji)等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘(dian)、-CN或雜取代基(ji)。

在這個(ge)實施方案中(zhong)，Z優選為N，并且X優選為C。

此外可優選R₁₀和R₁₂為H，R₉為-OMet(-OCH₃)，并且R₁₁為三氟甲基(-CF₃)。

在本發明(ming)的(de)上下(xia)文中，最優選為具(ju)有式(IV)的(de)(E)-2-(5-((4-甲(jia)氧基(ji)-2-(三(san)氟(fu)甲(jia)基(ji))喹啉-6-基(ji))甲(jia)氧基(ji))-2-((4-(三(san)氟(fu)甲(jia)基(ji))苯(ben)甲(jia)基(ji))氧基(ji))-苯(ben)亞(ya)甲(jia)基(ji))己酸(MTTB)：

特別優選的化合物亞類屬于以下結構通式，其具有前面描述的基團R₁至R₁₂的定義。

具有通式(V)的化合物：

R₂選自未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基，優選R₂為式(shi)(III)的基團(tuan)，

其中

X和Z獨立地選(xuan)自C或N，

R₉至R₁₂獨立地選自H、羥基；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、富馬酰基、馬來酰基、琥珀酰基、苯甲酰基或支鏈或經雜原子或芳基取代的酰基；烷氧基取代基，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺酰基，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴(xiu)、碘(dian)、-CN或雜(za)取代(dai)基。

在這個實施(shi)方案中Z優(you)選(xuan)(xuan)為(wei)N，并且X優(you)選(xuan)(xuan)為(wei)C。

此外可優選R₁₀和R₁₂為H，R₉為-OMet(-OCH₃)，并且R₁₁為三氟甲基(-CF₃)。

可選地或另外，R₄至R₈獨立地選自H、OH、SH；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、富馬酰基、馬來酰基、琥珀酰基、苯甲酰基或支鏈或經雜原子或芳基取代的酰基；烷氧基取代基，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺酰基，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘、-CN或雜取代基。更優選R₄、R₅、R₇和R₈為H，并且R₆為三氟甲基(-CF₃)。

還優選具(ju)有通式(VI)的化合物：

R₂選自未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基，優選R₂為式(III)的基團，

其中

X和Z獨立地選自C或N，

R₉至R₁₂獨立地選自H、羥基；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、富馬酰基、馬來酰基、琥珀酰基、苯甲酰基或支鏈或經雜原子或芳基取代的酰基；烷氧基取代基，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺酰基，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或(huo)-NO2；或(huo)氟、氯、溴、碘(dian)、-CN或(huo)雜取代基。

在這個實施方(fang)案中Z優選(xuan)為N，并且(qie)X優選(xuan)為C。

此外可優選R₁₀和R₁₂為H，R₉為-OMet(-OCH₃)，并且R₁₁為三氟甲基(-CF₃)。

對于式(V)和式(VI)的所有化合物而言，對應于以上描述的R₁和R₂的基團不同。

本(ben)發明的(de)另一(yi)方面涉(she)及(ji)一(yi)種生成或化(hua)學(xue)合(he)(he)成本(ben)發明的(de)化(hua)合(he)(he)物的(de)方法。

優選地，生成(cheng)或化學合成(cheng)本發(fa)明的(de)(de)化合物的(de)(de)方法包(bao)括以下步驟：

(a)：

(b)

(c)

和

(d)

其中R₁至R₃如以上所定義，并且(qie)X為反應基，優(you)選為Cl、Br、OTs或OTf。

再(zai)一(yi)方面還涉及用于(yu)治療(liao)或(huo)預防(fang)免疫性疾病的(de)(de)(de)過氧化物(wu)(wu)(wu)酶體增(zeng)殖物(wu)(wu)(wu)活化受(shou)體γ(PPARγ)拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑。在這個(ge)方面可優選(xuan)PPARγ拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑為選(xuan)擇性PPARγ拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑，因此(ci)是(shi)一(yi)種(zhong)不(bu)或(huo)僅僅弱(優選(xuan)低(di)于(yu)50％，更優選(xuan)低(di)于(yu)40％、30％、20％且最優選(xuan)低(di)于(yu)10％)誘導或(huo)反式激(ji)活PPARγ的(de)(de)(de)PPARγ拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑。此(ci)類(lei)選(xuan)擇性化合物(wu)(wu)(wu)尤其是(shi)本文描述的(de)(de)(de)新一(yi)類(lei)PPARγ拮(jie)(jie)抗(kang)(kang)劑的(de)(de)(de)化合物(wu)(wu)(wu)。

在(zai)(zai)本(ben)發(fa)明的(de)(de)上下文中進(jin)一(yi)步(bu)發(fa)現(xian)，PPARγ的(de)(de)選(xuan)擇性(xing)拮(jie)抗劑在(zai)(zai)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)性(xing)疾病的(de)(de)治療中有用。術(shu)語“免(mian)(mian)疫(yi)(yi)性(xing)疾病”或(huo)“免(mian)(mian)疫(yi)(yi)相關性(xing)疾病”出于(yu)(yu)本(ben)發(fa)明的(de)(de)目的(de)(de)應(ying)(ying)被理(li)解為(wei)是(shi)指特征在(zai)(zai)于(yu)(yu)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)系(xi)統(tong)病理(li)性(xing)活化或(huo)阻抑的(de)(de)疾病或(huo)疾患。在(zai)(zai)優(you)選(xuan)的(de)(de)實施方案(an)中，免(mian)(mian)疫(yi)(yi)性(xing)疾病為(wei)全身性(xing)炎癥(zheng)或(huo)膿毒癥(zheng)。最優(you)選(xuan)地，免(mian)(mian)疫(yi)(yi)性(xing)疾病為(wei)低炎癥(zheng)反應(ying)(ying)期(qi)的(de)(de)膿毒癥(zheng)。

用于本文(wen)描述的(de)醫療(liao)用途的(de)PPARγ拮抗劑優(you)選(xuan)為上文(wen)和下文(wen)描述的(de)發明(ming)的(de)化合物(wu)，最優(you)選(xuan)為化合物(wu)MTTB。

如本(ben)文中(zhong)所(suo)用，術語“治(zhi)(zhi)療”是(shi)指(zhi)防(fang)護性(xing)或(huo)預防(fang)性(xing)治(zhi)(zhi)療和治(zhi)(zhi)愈性(xing)或(huo)疾(ji)病緩解性(xing)治(zhi)(zhi)療，包(bao)括治(zhi)(zhi)療處于感(gan)染(ran)疾(ji)病的(de)風(feng)險或(huo)疑似已經感(gan)染(ran)疾(ji)病的(de)患(huan)(huan)(huan)(huan)者(zhe)，以及生病或(huo)已經診斷為患(huan)(huan)(huan)(huan)有(you)疾(ji)病或(huo)醫(yi)學(xue)疾(ji)患(huan)(huan)(huan)(huan)的(de)患(huan)(huan)(huan)(huan)者(zhe)。術語“治(zhi)(zhi)療”還指(zhi)在未患(huan)(huan)(huan)(huan)病但可能易于發展不健(jian)康(kang)狀況，如病理性(xing)活躍(yue)或(huo)阻抑的(de)免疫力的(de)個體中(zhong)保(bao)持和/或(huo)促進(jin)健(jian)康(kang)。因此(ci)，“有(you)效量”是(shi)在個體中(zhong)治(zhi)(zhi)療疾(ji)病或(huo)醫(yi)學(xue)疾(ji)患(huan)(huan)(huan)(huan)，或(huo)更一般(ban)地(di)說，為個體提(ti)供(gong)營養(yang)、生理或(huo)醫(yi)療益(yi)處的(de)量。

優選地本發明(ming)免疫(yi)性(xing)(xing)疾病(bing)的(de)(de)治(zhi)療或(huo)預防(fang)包括向患有(you)免疫(yi)性(xing)(xing)疾病(bing)或(huo)處于發展免疫(yi)性(xing)(xing)疾病(bing)風險的(de)(de)受(shou)試者(zhe)(zhe)施用治(zhi)療有(you)效劑量的(de)(de)所述PPARγ拮抗劑。免疫(yi)性(xing)(xing)疾病(bing)的(de)(de)治(zhi)療或(huo)預防(fang)可(ke)包括向所述受(shou)試者(zhe)(zhe)施用額外的(de)(de)治(zhi)療活性(xing)(xing)化合(he)物，其(qi)中額外的(de)(de)治(zhi)療活性(xing)(xing)化合(he)物在免疫(yi)性(xing)(xing)疾病(bing)，如膿毒(du)癥、全身性(xing)(xing)炎(yan)癥或(huo)膿毒(du)性(xing)(xing)休(xiu)克的(de)(de)治(zhi)療中有(you)效和/或(huo)有(you)益。

本發明的(de)額外的(de)治療(liao)活性化(hua)合(he)物優選選自另一種PPARγ拮抗(kang)(kang)劑(ji)、免疫(yi)抑制(zhi)劑(ji)、抗(kang)(kang)生素、血(xue)管加壓(ya)藥、皮(pi)質類固醇或活化(hua)的(de)蛋白C。

本發明(ming)化合物的(de)(de)(de)(de)治(zhi)療活性或有效劑量通常(chang)(chang)將(jiang)在每(mei)天(tian)0.1至100mg/kg患(huan)者體(ti)重，優(you)選每(mei)天(tian)0.5-20mg/kg的(de)(de)(de)(de)范圍(wei)內，確(que)切劑量由臨床(chuang)(chuang)醫師根(gen)據通用(yong)標準(zhun)，考(kao)慮(lv)待治(zhi)疾患(huan)的(de)(de)(de)(de)性質和嚴重程(cheng)度、患(huan)者特性等來(lai)確(que)定。劑量的(de)(de)(de)(de)確(que)定在本領(ling)域普通技術水平范圍(wei)內。本發明(ming)的(de)(de)(de)(de)化合物通常(chang)(chang)將(jiang)施用(yong)長達(da)28天(tian)。更(geng)常(chang)(chang)見(jian)的(de)(de)(de)(de)是，蛋白質將(jiang)施用(yong)一周(zhou)或更(geng)少，常(chang)(chang)常(chang)(chang)施用(yong)一至三天(tian)。一般而言，本發明(ming)化合物的(de)(de)(de)(de)治(zhi)療有效量是足以(yi)引起膿(nong)毒癥(zheng)的(de)(de)(de)(de)低(di)炎癥(zheng)反應期在臨床(chuang)(chuang)上顯著減少的(de)(de)(de)(de)量。

通常，施(shi)(shi)用的(de)本(ben)發(fa)明的(de)PPARγ拮抗劑(ji)的(de)量(liang)(liang)將根(gen)據諸如患者年齡(ling)、體重、身高、性別、總體健康狀況(kuang)和既(ji)往(wang)病史(shi)等因素改變。通常，雖然依情況(kuang)而定也可(ke)以施(shi)(shi)用較低(di)或(huo)較高劑(ji)量(liang)(liang)，但(dan)期望為受(shou)者提供劑(ji)量(liang)(liang)在1pg/kg至10mg/kg(試劑(ji)的(de)量(liang)(liang)/患者體重)范(fan)圍內的(de)本(ben)發(fa)明的(de)PPARγ拮抗劑(ji)。下文提供了本(ben)發(fa)明藥(yao)物組合物的(de)具體實(shi)施(shi)(shi)方(fang)案(an)。

另外通過包含(a)PPARγ拮抗(kang)劑(ji)和(b)在膿(nong)毒癥或全身(shen)性炎癥的(de)(de)治療(liao)中(zhong)有效的(de)(de)第(di)二化合物的(de)(de)組合解決(jue)了本發(fa)明(ming)的(de)(de)目的(de)(de)。

本發(fa)明的組合優選(xuan)包含作為試劑(ji)(ji)(ji)(a)的如上文(wen)所述的PPARγ拮抗劑(ji)(ji)(ji)，最優選(xuan)MTTB或(huo)其(qi)衍生物。試劑(ji)(ji)(ji)(b)，在膿毒癥(zheng)(zheng)或(huo)全(quan)身性炎癥(zheng)(zheng)的治療中(zhong)有效的第(di)二化合物，優選(xuan)選(xuan)自另一種PPARγ拮抗劑(ji)(ji)(ji)、免疫抑(yi)制劑(ji)(ji)(ji)、抗生素、血管加(jia)壓(ya)藥、皮質類固醇或(huo)活(huo)化的蛋白(bai)C。

本發明的(de)組合用于治療如上文所述的(de)免疫(yi)性疾(ji)病。

此外提供(gong)了一種抑制細胞中的PPARγ的體外(在活體外)方法(fa)。該方法(fa)包括使細胞與(yu)本文先前所述的化(hua)合物接觸的步(bu)驟。

疾病和疾患

本(ben)(ben)發明提供了一類新的(de)PPARγ拮抗(kang)劑，其用作治療劑用于治療或預防免疫(yi)相關性(xing)疾(ji)病(bing)(bing)或病(bing)(bing)理(li)性(xing)細胞凋(diao)亡，如(ru)特(te)征在于細胞過(guo)度凋(diao)亡的(de)疾(ji)病(bing)(bing)，例如(ru)慢性(xing)HIV、EBV或HCV感(gan)染(ran)、阿爾茨海默(mo)病(bing)(bing)、帕金森氏病(bing)(bing)(Parkinson's disease)或缺血性(xing)心(xin)臟(zang)病(bing)(bing)。根(gen)據本(ben)(ben)發明所(suo)述化合物和(he)(he)組合物對于治療和(he)(he)或預防特(te)征在于病(bing)(bing)理(li)性(xing)激活的(de)免疫(yi)或炎癥(zheng)反應的(de)疾(ji)患特(te)別(bie)有用。具體而言本(ben)(ben)發明設法提供對膿毒(du)癥(zheng)、膿毒(du)性(xing)休克和(he)(he)全(quan)身性(xing)炎癥(zheng)的(de)治療。

治療或預防免(mian)疫相(xiang)關性疾病的(de)組合物和試劑盒

本(ben)(ben)發明的(de)(de)另(ling)一(yi)方面涉及用于治療或預防(fang)免(mian)疫相關性疾病(bing)的(de)(de)組(zu)(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)、藥(yao)物(wu)(wu)組(zu)(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)和試劑盒。在一(yi)個實施方案中，所述組(zu)(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)包含如本(ben)(ben)文(wen)所述的(de)(de)化合(he)(he)物(wu)(wu)、組(zu)(zu)(zu)合(he)(he)或組(zu)(zu)(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)，任(ren)選地連同藥(yao)學上可接受的(de)(de)載體。

如本文中(zhong)所(suo)用，用語(yu)“藥(yao)(yao)學上可接受的(de)(de)載體(ti)”旨在(zai)包括與藥(yao)(yao)物(wu)(wu)施用相容的(de)(de)任何及所(suo)有溶劑(ji)(ji)、增溶劑(ji)(ji)、填(tian)料、穩定劑(ji)(ji)、粘合劑(ji)(ji)、吸收劑(ji)(ji)、基質(zhi)、緩沖劑(ji)(ji)、潤(run)滑(hua)(hua)劑(ji)(ji)、控釋(shi)媒介(jie)物(wu)(wu)、納米顆粒、脂質(zhi)體(ti)、稀釋(shi)劑(ji)(ji)、乳化劑(ji)(ji)、濕(shi)潤(run)劑(ji)(ji)、潤(run)滑(hua)(hua)劑(ji)(ji)、分散介(jie)質(zhi)、包衣(yi)、抗(kang)(kang)菌(jun)或(huo)抗(kang)(kang)真菌(jun)劑(ji)(ji)、等(deng)滲和吸收延遲劑(ji)(ji)等(deng)。此(ci)類介(jie)質(zhi)和試劑(ji)(ji)作為藥(yao)(yao)物(wu)(wu)活性物(wu)(wu)質(zhi)的(de)(de)用途是本領域公知的(de)(de)。除非任何常規(gui)介(jie)質(zhi)或(huo)試劑(ji)(ji)與活性化合物(wu)(wu)不相容，否則還(huan)考慮到了其在(zai)所(suo)述組(zu)合物(wu)(wu)中(zhong)的(de)(de)用途。也可向(xiang)組(zu)合物(wu)(wu)中(zhong)摻入補充試劑(ji)(ji)。在(zai)某些(xie)實施方案中(zhong)，藥(yao)(yao)學上可接受的(de)(de)載體(ti)包含(han)血清(qing)白蛋白。

本發(fa)明(ming)的藥物組(zu)合物配制成與其預期施(shi)用(yong)(yong)途(tu)徑相容。施(shi)用(yong)(yong)途(tu)徑的實例包(bao)括(kuo)腸(chang)胃外，例如鞘(qiao)內(nei)、動脈(mo)內(nei)、靜脈(mo)內(nei)、皮內(nei)、皮下、口服(fu)、經(jing)皮(局部)和經(jing)粘膜施(shi)用(yong)(yong)。

用于腸胃外、皮(pi)內或(huo)(huo)(huo)皮(pi)下(xia)施加的溶液(ye)或(huo)(huo)(huo)混懸液(ye)可(ke)(ke)包括以(yi)下(xia)組分：無菌稀(xi)釋劑(ji)(ji)如(ru)注射用水、鹽水溶液(ye)、不(bu)揮發性油(you)、聚乙(yi)二醇、甘油(you)；丙二醇或(huo)(huo)(huo)其它合成溶劑(ji)(ji)；抗(kang)菌劑(ji)(ji)如(ru)苯甲醇或(huo)(huo)(huo)對羥基苯甲酸甲酯；抗(kang)氧化(hua)劑(ji)(ji)如(ru)抗(kang)壞血(xue)酸或(huo)(huo)(huo)硫(liu)酸氫鈉；螯合劑(ji)(ji)如(ru)乙(yi)二胺四乙(yi)酸；緩沖劑(ji)(ji)如(ru)乙(yi)酸鹽、檸檬(meng)酸鹽或(huo)(huo)(huo)磷酸鹽及用于調(diao)節(jie)張力的試劑(ji)(ji)如(ru)氯化(hua)鈉或(huo)(huo)(huo)右旋(xuan)糖。可(ke)(ke)用酸或(huo)(huo)(huo)堿，如(ru)鹽酸或(huo)(huo)(huo)氫氧化(hua)鈉調(diao)節(jie)pH。腸胃外制劑(ji)(ji)可(ke)(ke)封裝(zhuang)在(zai)由玻璃或(huo)(huo)(huo)塑料制成的安瓿(bu)、一次性注射器或(huo)(huo)(huo)多劑(ji)(ji)量小瓶(ping)中。

適于注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(可溶于水時)或分散物及用于臨時制備無菌注射液或分散物的無菌粉末。對于靜脈施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、克列莫佛EL(Cremophor EL^TM,BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸(suan)鹽(yan)緩沖鹽(yan)水(shui)(PBS)。在(zai)(zai)所(suo)有情況(kuang)下(xia)，可(ke)注射組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)都應(ying)是無菌(jun)(jun)(jun)的并(bing)且應(ying)是流動性的，達到(dao)易于(yu)注射的程度。在(zai)(zai)生產和(he)儲存(cun)條件下(xia)必(bi)須穩定并(bing)且必(bi)須受到(dao)保護免受微(wei)生物(wu)(wu)如(ru)細菌(jun)(jun)(jun)和(he)真(zhen)菌(jun)(jun)(jun)的污(wu)染作用(yong)(yong)。載體可(ke)以是含有(例(li)如(ru))水(shui)、乙醇(chun)(chun)、多(duo)元醇(chun)(chun)(例(li)如(ru)，丙三醇(chun)(chun)、丙二(er)醇(chun)(chun)和(he)液體聚(ju)乙二(er)醇(chun)(chun)等(deng)(deng)(deng))及(ji)其合(he)(he)(he)適混合(he)(he)(he)物(wu)(wu)的溶劑(ji)(ji)(ji)或分散介(jie)質(zhi)。例(li)如(ru)，可(ke)以通(tong)(tong)過(guo)使(shi)用(yong)(yong)包(bao)(bao)衣如(ru)卵磷脂，在(zai)(zai)分散物(wu)(wu)的情況(kuang)下(xia)通(tong)(tong)過(guo)維持(chi)所(suo)需粒度及(ji)通(tong)(tong)過(guo)使(shi)用(yong)(yong)表(biao)面活性劑(ji)(ji)(ji)來維持(chi)適當的流動性。對微(wei)生物(wu)(wu)作用(yong)(yong)的預防可(ke)通(tong)(tong)過(guo)各種(zhong)抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)和(he)抗(kang)真(zhen)菌(jun)(jun)(jun)劑(ji)(ji)(ji)來實現(xian)，例(li)如(ru)對羥基苯(ben)甲(jia)酸(suan)酯類、氯(lv)丁醇(chun)(chun)、苯(ben)酚、抗(kang)壞血酸(suan)、硫柳汞等(deng)(deng)(deng)。在(zai)(zai)許多(duo)情況(kuang)下(xia)，將優選在(zai)(zai)組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)中包(bao)(bao)括(kuo)等(deng)(deng)(deng)滲(shen)劑(ji)(ji)(ji)，例(li)如(ru)糖、多(duo)元醇(chun)(chun)(如(ru)甘(gan)露(lu)醇(chun)(chun)、山(shan)梨(li)醇(chun)(chun))和(he)氯(lv)化鈉(na)。可(ke)通(tong)(tong)過(guo)在(zai)(zai)組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)中包(bao)(bao)括(kuo)延遲吸(xi)收的試劑(ji)(ji)(ji)，例(li)如(ru)單(dan)硬(ying)脂酸(suan)鋁和(he)明膠(jiao)而(er)引起(qi)可(ke)注射組合(he)(he)(he)物(wu)(wu)的延時吸(xi)收。

可通過在根(gen)據(ju)需(xu)要具有(you)(you)上(shang)面列舉的(de)一種成(cheng)分或(huo)組合的(de)適當溶劑中按(an)所需(xu)量摻入活性(xing)化合物(例如，神經(jing)調節蛋(dan)白(bai))，接著過濾(lv)滅菌(jun)(jun)來(lai)制備(bei)(bei)(bei)無菌(jun)(jun)注(zhu)射液(ye)(ye)。通常，通過將活性(xing)化合物摻入到含有(you)(you)基(ji)本(ben)分散(san)介(jie)質和(he)來(lai)自以上(shang)列舉的(de)那些其它所需(xu)成(cheng)分的(de)無菌(jun)(jun)媒(mei)介(jie)物中來(lai)制備(bei)(bei)(bei)分散(san)物。在用于制備(bei)(bei)(bei)無菌(jun)(jun)注(zhu)射液(ye)(ye)的(de)無菌(jun)(jun)粉末的(de)情況下，優選的(de)制備(bei)(bei)(bei)方法是真空(kong)干(gan)燥(zao)和(he)冷凍干(gan)燥(zao)，這樣產生活性(xing)成(cheng)分加(jia)上(shang)來(lai)自其先前經(jing)無菌(jun)(jun)過濾(lv)的(de)溶液(ye)(ye)的(de)任何所需(xu)額外成(cheng)分的(de)粉末。

口服(fu)(fu)組(zu)合物通常包括惰性稀釋劑(ji)(ji)或(huo)(huo)可(ke)食(shi)用(yong)(yong)(yong)載(zai)體。可(ke)將其封裝在明膠(jiao)膠(jiao)囊(nang)中或(huo)(huo)壓縮成片(pian)劑(ji)(ji)。為了口服(fu)(fu)治療(liao)施用(yong)(yong)(yong)的(de)目的(de)，活性化合物可(ke)以和賦形(xing)劑(ji)(ji)一起(qi)摻入并(bing)且呈片(pian)劑(ji)(ji)、錠劑(ji)(ji)或(huo)(huo)膠(jiao)囊(nang)形(xing)式使(shi)用(yong)(yong)(yong)。也(ye)可(ke)以使(shi)用(yong)(yong)(yong)用(yong)(yong)(yong)作漱口水(shui)的(de)液(ye)體載(zai)體制備口服(fu)(fu)組(zu)合物，其中液(ye)體載(zai)體中的(de)化合物口服(fu)(fu)施加并(bing)且被漱洗和咳出或(huo)(huo)咽下(xia)。藥學上(shang)相(xiang)容的(de)粘(zhan)合劑(ji)(ji)和/或(huo)(huo)輔(fu)助(zhu)材料可(ke)作為組(zu)合物的(de)一部分(fen)被包括在內(nei)。片(pian)劑(ji)(ji)、丸(wan)劑(ji)(ji)、膠(jiao)囊(nang)、錠劑(ji)(ji)等(deng)可(ke)含有以下(xia)任何成分(fen)或(huo)(huo)類似性質的(de)化合物：粘(zhan)合劑(ji)(ji)如(ru)微晶纖維素(su)、黃蓍膠(jiao)或(huo)(huo)明膠(jiao)；賦形(xing)劑(ji)(ji)如(ru)淀(dian)粉(fen)或(huo)(huo)乳糖；崩(beng)解劑(ji)(ji)如(ru)藻酸(suan)、普萊默膠(jiao)(Primogel)或(huo)(huo)玉米淀(dian)粉(fen)；潤滑劑(ji)(ji)如(ru)硬脂酸(suan)鎂(mei)或(huo)(huo)斯(si)特(te)爾特(te)斯(si)(Stertes)；助(zhu)流(liu)劑(ji)(ji)如(ru)膠(jiao)體二氧化硅；甜味劑(ji)(ji)如(ru)蔗糖或(huo)(huo)糖精；或(huo)(huo)調味劑(ji)(ji)如(ru)薄荷(he)、水(shui)楊酸(suan)甲酯或(huo)(huo)橙香精。

對于通(tong)過(guo)吸入(ru)施用，化合物(wu)呈(cheng)氣(qi)溶(rong)膠噴霧的形式從(cong)含有(you)合適推進劑，例如氣(qi)體(如二氧化碳)的容器(qi)(qi)或分配(pei)器(qi)(qi)中或從(cong)噴霧器(qi)(qi)中遞送(song)。

全身性(xing)施(shi)用(yong)(yong)也可以通過經(jing)粘(zhan)膜(mo)(mo)或(huo)經(jing)皮方式。對(dui)于(yu)(yu)經(jing)粘(zhan)膜(mo)(mo)或(huo)經(jing)皮施(shi)用(yong)(yong)，在配(pei)制劑(ji)中使(shi)用(yong)(yong)適于(yu)(yu)待透(tou)過的(de)(de)屏障的(de)(de)滲透(tou)劑(ji)。此(ci)類滲透(tou)劑(ji)通常(chang)是本領(ling)域(yu)(yu)已知的(de)(de)，并且包(bao)括，例(li)如，對(dui)于(yu)(yu)經(jing)粘(zhan)膜(mo)(mo)施(shi)用(yong)(yong)，去垢劑(ji)、膽汁鹽和梭(suo)鏈孢酸(suan)衍生物(wu)。經(jing)粘(zhan)膜(mo)(mo)施(shi)用(yong)(yong)可通過使(shi)用(yong)(yong)鼻噴(pen)霧或(huo)栓(shuan)劑(ji)實現(xian)。對(dui)于(yu)(yu)經(jing)皮施(shi)用(yong)(yong)，將(jiang)藥物(wu)組(zu)合物(wu)配(pei)制成本領(ling)域(yu)(yu)通常(chang)所知的(de)(de)軟膏、藥膏、凝膠或(huo)乳霜。

在某些實施(shi)方(fang)案中，藥物(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)經配制(zhi)用于持續或控制(zhi)釋(shi)放(fang)活性成分。可(ke)以使用生(sheng)物(wu)(wu)可(ke)降解(jie)、生(sheng)物(wu)(wu)相容性聚(ju)合(he)物(wu)(wu)，如(ru)乙(yi)烯醋酸乙(yi)烯酯、聚(ju)酸酐、聚(ju)乙(yi)醇酸、膠原(yuan)蛋白(bai)、聚(ju)原(yuan)酸酯和聚(ju)乳(ru)酸。制(zhi)備此類制(zhi)劑的(de)(de)方(fang)法(fa)對于本領(ling)域的(de)(de)技(ji)術(shu)人員而言是顯(xian)而易見的(de)(de)。所述材料也(ye)可(ke)以從(cong)(例如(ru))阿爾(er)扎公司(si)(Alza Corporation)和諾華制(zhi)藥公司(si)(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商(shang)業性獲得。脂(zhi)質體(ti)懸浮(fu)液(包(bao)(bao)括靶向具有(you)病毒抗原(yuan)的(de)(de)單克隆抗體(ti)的(de)(de)受感染細胞(bao)的(de)(de)脂(zhi)質體(ti))或納米顆粒，包(bao)(bao)括用聚(ju)(dl-丙交(jiao)酯-co-乙(yi)交(jiao)酯)制(zhi)備的(de)(de)物(wu)(wu)質，也(ye)可(ke)用作藥學(xue)上可(ke)接受的(de)(de)載體(ti)。這些可(ke)根(gen)據本領(ling)域技(ji)術(shu)人員已知的(de)(de)方(fang)法(fa)制(zhi)備。

為了易于(yu)(yu)施用和劑量(liang)均勻性，特別有利的(de)(de)(de)是將口服或腸胃外組合(he)(he)(he)物(wu)配制成劑量(liang)單(dan)位(wei)(wei)形(xing)(xing)式。如本文中所(suo)用的(de)(de)(de)劑量(liang)單(dan)位(wei)(wei)形(xing)(xing)式包括適合(he)(he)(he)作為待(dai)治(zhi)受試者(zhe)的(de)(de)(de)單(dan)位(wei)(wei)劑量(liang)的(de)(de)(de)物(wu)理離散單(dan)元；每個(ge)單(dan)元含有經(jing)計算連同所(suo)需藥物(wu)載體(ti)一起會產生預(yu)期(qi)療(liao)(liao)效的(de)(de)(de)預(yu)定(ding)量(liang)的(de)(de)(de)活性化合(he)(he)(he)物(wu)。本發(fa)明(ming)的(de)(de)(de)劑量(liang)單(dan)位(wei)(wei)形(xing)(xing)式的(de)(de)(de)規格由以(yi)(yi)下(xia)因(yin)素決定(ding)并(bing)直接取決于(yu)(yu)以(yi)(yi)下(xia)因(yin)素：活性化合(he)(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)獨(du)特特征和要達到(dao)的(de)(de)(de)特定(ding)療(liao)(liao)效，及使此類(lei)活性化合(he)(he)(he)物(wu)化合(he)(he)(he)用于(yu)(yu)治(zhi)療(liao)(liao)個(ge)體(ti)的(de)(de)(de)領域中固有的(de)(de)(de)限制。

此類化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)的(de)毒(du)性和(he)治(zhi)(zhi)療功效可以通過(guo)標準制藥過(guo)程在細(xi)胞培養物(wu)或(huo)實(shi)驗動物(wu)中(zhong)測(ce)定(ding)，例如測(ce)定(ding)LD50(群(qun)(qun)體(ti)50％致死的(de)劑(ji)量)和(he)ED50(在群(qun)(qun)體(ti)50％中(zhong)治(zhi)(zhi)療有效的(de)劑(ji)量)。毒(du)性和(he)療效之間(jian)的(de)劑(ji)量比(bi)為治(zhi)(zhi)療指數并且(qie)可表(biao)(biao)示為LD50/ED50比(bi)率。優選表(biao)(biao)現出(chu)(chu)大治(zhi)(zhi)療指數的(de)化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)。雖然可以使(shi)用(yong)表(biao)(biao)現出(chu)(chu)毒(du)副作用(yong)的(de)化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)，但(dan)是應該仔(zi)細(xi)設計使(shi)此類化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)靶向受影響組織部位(wei)的(de)遞(di)送系統以便(bian)將對未受感染的(de)細(xi)胞的(de)潛在損傷降到最低，從而減少副作用(yong)。

由細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)測(ce)定法(fa)和動物(wu)研究獲得(de)的(de)(de)數據(ju)可(ke)(ke)用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)配(pei)(pei)制用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)人(ren)類(lei)(lei)的(de)(de)各(ge)種(zhong)劑(ji)(ji)量。此類(lei)(lei)化(hua)合物(wu)的(de)(de)劑(ji)(ji)量優選(xuan)在(zai)包括具(ju)有很少或(huo)無毒性(xing)的(de)(de)ED50的(de)(de)循環濃(nong)度范(fan)圍內(nei)。該劑(ji)(ji)量可(ke)(ke)根(gen)據(ju)采用(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)劑(ji)(ji)量形式和利(li)用(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)施(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)途徑在(zai)這個范(fan)圍內(nei)變(bian)化(hua)。對于(yu)本發明(ming)方法(fa)中(zhong)所用(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)任何化(hua)合物(wu)而言，最(zui)初可(ke)(ke)由細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)測(ce)定法(fa)估(gu)計治療有效劑(ji)(ji)量。在(zai)動物(wu)模(mo)型中(zhong)可(ke)(ke)將劑(ji)(ji)量配(pei)(pei)制成達到包括在(zai)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)物(wu)中(zhong)測(ce)定的(de)(de)IC50(即，實現癥狀半最(zui)大(da)抑制的(de)(de)試驗化(hua)合物(wu)濃(nong)度)的(de)(de)循環血漿濃(nong)度范(fan)圍。此類(lei)(lei)信息可(ke)(ke)用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)更精確(que)地確(que)定在(zai)人(ren)類(lei)(lei)中(zhong)的(de)(de)有用(yong)(yong)(yong)(yong)劑(ji)(ji)量。可(ke)(ke)將藥物(wu)組合物(wu)連同施(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)說明(ming)書一起包括在(zai)容器、包裝或(huo)分配(pei)(pei)器中(zhong)。

現將在以下(xia)實施例中(zhong)參考附圖和序列(lie)，然而不(bu)限于此，對本發明(ming)(ming)做(zuo)進一步描述。為了(le)本發明(ming)(ming)的目的，本文所引(yin)用的所有(you)參考文獻通過引(yin)用整體(ti)并(bing)入(ru)。圖中(zhong)：

圖1：MTTB的化學結(jie)構和(he)(he)(he)計算模(mo)型。相應(ying)的配體并入了MTTB(A)的所(suo)有(you)結(jie)構特征：酸性(xing)端基、相鄰親脂性(xing)部分(fen)和(he)(he)(he)在相對位點上具有(you)芳香族取代基的中(zhong)心(xin)芳香核。對接方案集中(zhong)于產生一個單結(jie)合模(mo)式(B)。羧(suo)基部分(fen)參(can)與(yu)和(he)(he)(he)賴(lai)氨酸265的離子相互(hu)(hu)作用和(he)(he)(he)與(yu)絲氨酸323主鏈酰胺的氫鍵中(zhong)。芳香族部分(fen)和(he)(he)(he)α烷基鏈占據疏(shu)水位點，表明是有(you)利(li)的相互(hu)(hu)作用。

圖2：PPARγ激(ji)(ji)動(dong)劑(ji)、PPARγ拮(jie)抗劑(ji)和(he)SPPARγM在(zai)HEK293T細胞中(zhong)的(de)(de)動(dong)力(li)學表征。使(shi)用(yong)(yong)PPARγ依(yi)(yi)賴性反式激(ji)(ji)活(huo)(transactivation)測定法來檢驗(yan)PPARγ激(ji)(ji)動(dong)劑(ji)羅格(ge)列酮(rosiglitazone)、拮(jie)抗劑(ji)GW9662和(he)兩種(zhong)SPPARγM FMOC-L-亮氨酸和(he)MCC-555在(zai)用(yong)(yong)不同濃度(du)(0.01μΜ-10μΜ)的(de)(de)化合(he)物(A)刺激(ji)(ji)24小時之后(hou)的(de)(de)激(ji)(ji)動(dong)作用(yong)(yong)。為(wei)確定在(zai)對激(ji)(ji)動(dong)劑(ji)(1μΜ羅格(ge)列酮)刺激(ji)(ji)(B)反應(ying)的(de)(de)時間進(jin)程中(zhong)使(shi)用(yong)(yong)10μΜ GW9662及FMOC-L-亮氨酸和(he)MCC-555的(de)(de)激(ji)(ji)動(dong)作用(yong)(yong)，再(zai)次使(shi)用(yong)(yong)PPARγ依(yi)(yi)賴性反式激(ji)(ji)活(huo)測定法。值是四(si)次實(shi)(shi)驗(yan)的(de)(de)平均(jun)值±SEM。每項實(shi)(shi)驗(yan)進(jin)行(xing)四(si)次。

圖3：針(zhen)對(dui)體外(wai)遞增(zeng)濃(nong)度的(de)(de)羅(luo)格(ge)(ge)(ge)列(lie)(lie)(lie)(lie)酮(tong)(tong)，MTTB拮(jie)抗作(zuo)(zuo)用(yong)與GW9662拮(jie)抗作(zuo)(zuo)用(yong)的(de)(de)比較。為檢驗MTTB(A和(he)C)和(he)參考PPARγ拮(jie)抗劑(ji)GW9662(B和(he)D)在(zai)(zai)HEK293T細(xi)胞(bao)(A和(he)B)和(he)Jurkat T細(xi)胞(bao)(C和(he)D)中(zhong)的(de)(de)激(ji)(ji)動(dong)和(he)拮(jie)抗作(zuo)(zuo)用(yong)，使用(yong)PPARγ依(yi)賴性(xing)(xing)反式激(ji)(ji)活測(ce)定(ding)(ding)法(fa)。用(yong)遞增(zeng)劑(ji)量(0.1μΜ-10μΜ)的(de)(de)羅(luo)格(ge)(ge)(ge)列(lie)(lie)(lie)(lie)酮(tong)(tong)、MTTB或GW9662單(dan)獨地或在(zai)(zai)MTTB和(he)GW9662(1μΜ或10μΜ)的(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)下(xia)用(yong)相同(tong)濃(nong)度的(de)(de)羅(luo)格(ge)(ge)(ge)列(lie)(lie)(lie)(lie)酮(tong)(tong)培養細(xi)胞(bao)系24小時(shi)。為測(ce)定(ding)(ding)在(zai)(zai)HEK293T細(xi)胞(bao)中(zhong)MTTB對(dui)羅(luo)格(ge)(ge)(ge)列(lie)(lie)(lie)(lie)酮(tong)(tong)反應的(de)(de)拮(jie)抗作(zuo)(zuo)用(yong)的(de)(de)IC50值，使用(yong)PPARγ依(yi)賴性(xing)(xing)反式激(ji)(ji)活測(ce)定(ding)(ding)法(fa)(E)構造MTTB拮(jie)抗作(zuo)(zuo)用(yong)的(de)(de)劑(ji)量-反應曲線。數據顯示在(zai)(zai)遞增(zeng)濃(nong)度的(de)(de)MTTB(0.1μ-50μΜ)的(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)下(xia)對(dui)1μΜ激(ji)(ji)動(dong)劑(ji)(羅(luo)格(ge)(ge)(ge)列(lie)(lie)(lie)(lie)酮(tong)(tong))刺(ci)激(ji)(ji)反應24小時(shi)。所有值均為四次實驗的(de)(de)平均值±SEM。每(mei)項實驗在(zai)(zai)HEK293T細(xi)胞(bao)中(zhong)進(jin)行四次并且在(zai)(zai)Jurkat T細(xi)胞(bao)中(zhong)進(jin)行三次。在(zai)(zai)HEK293T細(xi)胞(bao)和(he)Jurkat T細(xi)胞(bao)中(zhong)在(zai)(zai)濃(nong)度為xμΜ和(he)yμΜ(p<0.05)的(de)(de)MTTB的(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)下(xia)，在(zai)(zai)對(dui)羅(luo)格(ge)(ge)(ge)列(lie)(lie)(lie)(lie)酮(tong)(tong)(1-10μΜ)的(de)(de)反應中(zhong)獲得與單(dan)獨的(de)(de)拮(jie)抗劑(ji)在(zai)(zai)統計上顯著(zhu)的(de)(de)差異。

圖4：體外競爭性(xing)(xing)PPARγ拮(jie)(jie)抗劑(ji)MTTB和(he)PPARγ拮(jie)(jie)抗劑(ji)GW9662的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)毒性(xing)(xing)。在用不(bu)同(tong)濃度(0.1μΜ-30μΜ)的(de)(de)MTTB(A)或PPARγ拮(jie)(jie)抗劑(ji)GW9662(B)刺激(ji)24小時之后通過(guo)MTT測定法測定HEK293T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)、HuT-78細(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)Jurkat T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)活力。由以下方程式計算細(xi)胞(bao)(bao)(bao)活力：樣品的(de)(de)MTT光密度(OD)值/對(dui)照(zhao)的(de)(de)MTT OD值(細(xi)胞(bao)(bao)(bao)經DMSO處理(li))。數據顯示為溶劑(ji)DMSO對(dui)照(zhao)的(de)(de)百分比并呈(cheng)現為三次單獨實驗(yan)的(de)(de)平(ping)均值±SEM。每項實驗(yan)進行八次。

圖5：體外MTTB和GW9662的胞內累積。用10μΜMTTB(A)或10μΜGW9662(B)刺激HEK293T細胞、HuT-78細胞和Jurkat T細胞24小時。在不同時間點收獲細胞并且將累積表示為通過LC-MS/MS測定的每5x10⁵個(ge)細胞(bao)按μmol計胞(bao)內(I)與胞(bao)外(E)濃度的(de)百分比。值是三次(ci)實(shi)驗的(de)平均值±SEM。

圖6：用MTTB處理之后膿毒癥模型中小鼠的存活(huo)。

實施例

材料和方法

化學藥品和試劑

所有化(hua)學藥品(pin)和試劑(ji)都是最高純度等級的并(bing)且(qie)如(ru)果沒有另(ling)外說明，則可從(cong)應用化(hua)學GmbH(AppliChem GmbH,達木(mu)斯(si)特,德(de)(de)國(guo))、卡爾(er)洛斯(si)GmbH(Carl Roth GmbH,卡爾(er)斯(si)魯厄,德(de)(de)國(guo))、阿(a)法(fa)埃莎GmbH(Alfa Aesar GmbH,卡爾(er)斯(si)魯厄,德(de)(de)國(guo))、阿(a)波羅科技(ji)(Apollo Scientific,曼(man)徹斯(si)特,英國(guo))和西(xi)格(ge)(ge)瑪奧(ao)德(de)(de)里奇化(hua)學GmbH(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,德(de)(de)國(guo))商(shang)購獲(huo)得。PPARγ拮抗劑(ji)GW9662、SPPARγM N-(9-芴(wu)基甲(jia)氧羰基)-L-亮氨酸(suan)(FMOC-L-亮氨酸(suan))和萘格(ge)(ge)列酮(tong)(netoglitazone)(MCC-555)從(cong)凱曼(man)化(hua)工(gong)公司(Cayman Chemical Company,安娜堡,USA)獲(huo)得并(bing)且(qie)PPARγ激動劑(ji)羅格(ge)(ge)列酮(tong)從(cong)恩佐生命科學GmbH(Enzo Life Sciences GmbH,德(de)(de)國(guo))獲(huo)得。細胞培養基和補充劑(ji)購自PAA實驗室GmbH(德(de)(de)國(guo))和西(xi)格(ge)(ge)瑪奧(ao)德(de)(de)里奇化(hua)學GmbH。

細胞培養

從LGC標準GmbH(韋(wei)澤爾(er),德國)獲得人T細(xi)(xi)胞(bao)-78(HuT-78)(Gazdar等(deng)人，1980)、Jurkat T細(xi)(xi)胞(bao)(Schneider等(deng)人，1977)和穩(wen)定(ding)表(biao)達猿猴空泡病毒40的(de)大(da)T抗原(yuan)的(de)人胚腎293細(xi)(xi)胞(bao)(HEK293T細(xi)(xi)胞(bao))(Graham等(deng)人，1977)。HuT-78細(xi)(xi)胞(bao)和Jurkat T細(xi)(xi)胞(bao)在勞斯維爾(er)帕克記憶研(yan)究所(Roswell Park Memorial Institute(RPMI))1640培(pei)養(yang)基中并且(qie)HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)在杜(du)爾(er)貝(bei)科改(gai)良伊格爾(er)培(pei)養(yang)基(DMEM)中，在37℃下于(yu)加濕(shi)5％二氧(yang)化碳環境中培(pei)養(yang)。

兩(liang)種(zhong)培養基均含(han)10％(v/v)熱滅(mie)活胎牛(niu)血清(qing)、100單位(wei)/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈(lian)霉素(streptomycin)。培養基每周更(geng)換三(san)次并(bing)且在(zai)達到融(rong)合(he)之前使(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)傳代。使(shi)用DMSO時，在(zai)所有情況下，DMSO的最終濃度不超過(guo)0.1％并(bing)且在(zai)所用細(xi)(xi)胞(bao)(bao)系中未發現有細(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒(du)性。

培養的細胞系的瞬時轉染

對于PPARγ依賴性反(fan)式激活測(ce)定法(fa)(fa)而言，在96孔(kong)板中每(mei)孔(kong)接種1x104個(ge)HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)并(bing)且(qie)如上所述培(pei)(pei)養(yang)過夜以允許(xu)HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)附著。第二天，使(shi)用(yong)(yong)JetPRIMETM轉染試劑(PEQLAB Biotechnologie GmbH,埃爾(er)朗根,德國)，如制造商所述，用(yong)(yong)0.01μg/孔(kong)由Manfred Schubert-Zsilavecz博士(shi)教授(shou)(Institute of Pharmaceutical Chemistry,Department of Biochemistry,Chemistry and Pharmacy,Goethe-University Frankfurt am Main,德國)友好提供的pFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD，0.09μg/孔(kong)pFR-Luc(Stratagene,拉(la)荷亞,USA)和0.0005μg/孔(kong)pRL-CMV(Promega GmbH,Mannheim,德國)瞬時轉染HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。4小時后，更(geng)換轉染培(pei)(pei)養(yang)基并(bing)且(qie)再在新(xin)(xin)鮮(xian)生長(chang)培(pei)(pei)養(yang)基中培(pei)(pei)養(yang)HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)24小時。對于每(mei)孔(kong)1x106個(ge)HuT-78細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和Jurkat T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的瞬時轉染，使(shi)用(yong)(yong)Super-FectTM轉染試劑(QIAGEN GmbH,希(xi)爾(er)敦,德國)，如生產商所述，用(yong)(yong)0.2μg/孔(kong)pFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD、0.8μg/孔(kong)pFR-Luc和0.05μg/孔(kong)pRL-CMV。24小時后，添加1ml新(xin)(xin)鮮(xian)生長(chang)培(pei)(pei)養(yang)基并(bing)且(qie)再培(pei)(pei)養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)48小時。PPARγ依賴性反(fan)式激活測(ce)定法(fa)(fa)在HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中使(shi)用(yong)(yong)96孔(kong)板形式進(jin)行(xing)四次并(bing)且(qie)在HuT-78細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和Jurkat T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中使(shi)用(yong)(yong)12孔(kong)板形式進(jin)行(xing)三次。

培養的細胞系的PPARγ依賴性反式激活測定法

PPARγ依賴性反式激活(huo)測(ce)定法是基(ji)于編碼雜交蛋(dan)白(bai)PPARγ-LBD-GAL4-DBD的載(zai)體pFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD和在(zai)螢火蟲熒光(guang)(guang)素酶(mei)基(ji)因的前面(mian)攜(xie)帶GAL4響應元(yuan)件的報告(gao)載(zai)體pFR-Luc。這兩種載(zai)體，如上所述，與(yu)編碼海(hai)腎熒光(guang)(guang)素酶(mei)的對照載(zai)體pRL-CMV組合(he)(he)共同轉(zhuan)(zhuan)染，以將螢火蟲熒光(guang)(guang)素酶(mei)活(huo)性歸一化為轉(zhuan)(zhuan)染效率。轉(zhuan)(zhuan)染之后，用MTTB、FMOC-L-亮(liang)氨酸(suan)、MCC-555、GW9662和羅格列酮并且在(zai)遞增濃度下(0.01-10μΜ)，有或(huo)無羅格列酮(0.01-10μΜ)孵育(yu)細胞不(bu)同時間(2-48小(xiao)時)。使(shi)用96孔板(ban)形式在(zai)密(mi)特拉(la)斯(Mithras)LB940多(duo)模式酶(mei)標(biao)儀(Berthold Technologies,Bad Wildbad,德(de)國)中分(fen)析反式激活(huo)。通過使(shi)用圖像(xiang)平(ping)板(ban)軟件普(pu)利(li)姆(GraphPad Software Prism,拉(la)荷亞,USA)將數據擬合(he)(he)為S形劑量-反應曲線測(ce)定MTTB的IC50值。

細胞活力研究

按(an)每孔5x104個細(xi)(xi)胞(bao)的密度(du)將HuT-78細(xi)(xi)胞(bao)、Jurkat T細(xi)(xi)胞(bao)和HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)接種在(zai)96孔板(ban)中(zhong)并且(qie)如上(shang)所述培養過夜以允許HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)附著。第二(er)天，將培養基(ji)更(geng)換為含有(you)不(bu)同濃度(du)的MTTB(1-30μΜ)和GW9662(1-30μΜ)的新鮮細(xi)(xi)胞(bao)特異性生(sheng)長培養基(ji)。使用(yong)單獨的DMSO作為對照。24小(xiao)時刺激(ji)后(hou)，添加(jia)3-(4,5-二(er)甲(jia)基(ji)噻唑-2-基(ji))-2,5-二(er)苯基(ji)溴化(hua)四唑(MTT)溶液(5mg/ml于磷酸鹽(yan)緩沖鹽(yan)水(PBS)中(zhong))并且(qie)在(zai)37℃下(xia)再孵育細(xi)(xi)胞(bao)兩小(xiao)時(Mosmann,1983)。之(zhi)后(hou)，用(yong)MTT裂(lie)解(jie)緩沖液裂(lie)解(jie)細(xi)(xi)胞(bao)。細(xi)(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)后(hou)，在(zai)560nm吸光度(du)下(xia)在(zai)密特拉斯(Mithras)LB940多(duo)模式酶(mei)標儀中(zhong)測量(liang)細(xi)(xi)胞(bao)活力(li)。使用(yong)96孔板(ban)形(xing)式的細(xi)(xi)胞(bao)活力(li)研究進(jin)行八次。

胞內MTTB和GW9662累積的測定

為(wei)測定MTTB和GW9662的(de)(de)胞(bao)內累積(ji)(ji)，按每孔5x104個細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)密度(du)將(jiang)HuT-78細(xi)(xi)胞(bao)、Jurkat T細(xi)(xi)胞(bao)和HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)接種在12孔板中并且如(ru)上所述培養(yang)(yang)過(guo)夜以允許HEK293T細(xi)(xi)胞(bao)附著(zhu)。第二天將(jiang)培養(yang)(yang)基更換為(wei)含(han)有10μΜMTTB和10μΜ GW9662的(de)(de)新鮮細(xi)(xi)胞(bao)特異性生長培養(yang)(yang)基。用(yong)MTTB和GW9662處理24小時后，收獲細(xi)(xi)胞(bao)和上清液并通過(guo)LC-MS/MS分(fen)析(xi)。將(jiang)累積(ji)(ji)表示(shi)為(wei)胞(bao)內與胞(bao)外濃度(du)比率(lv)(I/E)的(de)(de)百(bai)分(fen)比。

計算模型

使用(yong)分子操作環境(Molecular Operating Environment)軟件套件2012.10(Chemical Computing Group Inc.,蒙特(te)利爾,加拿大)進行計(ji)算對接。結構中氫的分配使用(yong)普勞特(te)耐特(te)3D(Protonate3D)程(cheng)序(Labute,2009)進行。

統計分析

所有(you)數據(ju)均呈現為平均值±標準(zhun)平均誤差(SEM)。每項實驗(yan)至(zhi)少進行三次。統計分析用分別經(jing)邦弗倫尼(Bonferroni)多重比較檢(jian)驗(yan)或(huo)非配(pei)對(dui)和配(pei)對(dui)學生t檢(jian)驗(yan)改良(liang)的(de)單(dan)或(huo)雙因素方差分析來進行。當(dang)：p<0.05時，視為差異顯著。

實施例1：MTTB的合成

本發明的化合物，尤其(qi)是(shi)MTTB在一(yi)個四階段過程中合成。在下(xia)文(wen)中E是(shi)指反應(ying)物，P是(shi)指反應(ying)產物。

階段1：

在具有回流冷凝器、氬氣源、隔膜和磁攪拌器的三頸反應釜中，使E1(1個當量)和Cs₂CO₃(1.3個當量)在惰性氣體下懸浮于二甲基甲酰胺(DMF)中并略微加熱(約60℃約15分鐘)。冷卻至室溫(RT)后，經由隔膜在幾毫升DMF中迅速添加E2(1個當量)并且在攪拌下反應，無需加熱。約1.5小時后在真空下去除溶劑直至幾乎完全干燥。為50ml的H₂O添加50ml乙酸乙酯以分相。水相用乙酸乙酯萃取三次，而有機相在MgSO₄上干燥并(bing)蒸發(fa)至完全(quan)干燥。殘余物進行柱(zhu)色譜法并(bing)且在分(fen)離后使產物重結晶兩次(己(ji)烷/乙酸乙酯)。

階段2：

在具有回流冷凝器、氬氣源、隔膜和磁攪拌器的三頸反應釜中，使P1(1個當量)和Cs₂CO₃(1.3個當量)在惰性氣體下懸浮于二甲基甲酰胺(DMF)中并略微加熱(約60℃約15分鐘)。冷卻至室溫(RT)后，經由隔膜在幾毫升DMF中迅速添加E3(1個當量)并且在攪拌下反應，無需加熱。約1.5小時后在真空下去除溶劑直至幾乎完全干燥。為50ml的H₂O添加50ml乙酸乙酯以分相。水相用乙酸乙酯萃取三次，而有機相在MgSO₄上干燥(zao)并(bing)蒸發(fa)至完全干燥(zao)。殘余(yu)物(wu)進(jin)行柱色譜(pu)法(fa)并(bing)且(qie)在分離后使產(chan)物(wu)重結晶(jing)兩(liang)次(己烷(wan)/乙酸乙酯)。

階段3：

在(zai)具有回流冷凝(ning)器、氬氣源、隔膜和磁攪(jiao)拌(ban)(ban)器的(de)三頸反(fan)應釜中，首先在(zai)氬氣下添加NaH(1.3個(ge)當(dang)量(liang))，然后(hou)用(yong)四氫呋喃(nan)(THF)使(shi)其懸浮。攪(jiao)拌(ban)(ban)并冷卻約15分鐘后(hou)在(zai)幾分鐘之(zhi)內滴加于(yu)THF中的(de)E4(1.3個(ge)當(dang)量(liang))。E4可(ke)經由(you)(you)艾(ai)伯佐夫(Arbuzov)反(fan)應制(zhi)備，通過使(shi)各自的(de)α-溴(xiu)代(dai)-酯(zhi)在(zai)亞磷(lin)酸三乙(yi)酯(zhi)中回流并蒸(zheng)餾得到E4。然后(hou)于(yu)冰浴中攪(jiao)拌(ban)(ban)混合物30至(zhi)(zhi)60分鐘。經由(you)(you)隔膜滴加于(yu)THF中的(de)醛(1個(ge)當(dang)量(liang))。經由(you)(you)TLC觀察反(fan)應。完成反(fan)應(約1至(zhi)(zhi)3小時)后(hou)，去除溶(rong)劑并且使(shi)反(fan)應經受(shou)柱色譜法。使(shi)純化產物P3重結晶(己烷(wan)/乙(yi)酸乙(yi)酯(zhi))。

階段4：

在具有回流冷凝器和熱浴的反應釜中，使于THF中的酯與溶于H₂O中(zhong)的LiOH一水(shui)(shui)合(he)物(10個當量)合(he)并(bing)。添加(jia)甲醇直至溶液只有一個相并(bing)且邊攪拌邊在40-60℃下加(jia)熱直至完全水(shui)(shui)解。約12-72小時后在真(zhen)空下蒸(zheng)發THF和甲醇。用(yong)2NHCl使酸(suan)沉淀(dian)。從沉淀(dian)中(zhong)去(qu)除溶劑并(bing)干燥后，通過重(zhong)結晶(jing)獲得最終產(chan)物。

實施例2：MTTB與PPARγ-LBD對接

在先前的(de)研究(jiu)中已經證(zheng)實，由于(yu)對PPARγ已知的(de)明顯誘(you)導契合，共晶配體(ti)的(de)相似性對于(yu)受體(ti)結合的(de)配體(ti)構象的(de)預測模型至(zhi)關重要(Weber等人，2012)。因此，發明人選擇比較與PPARγ-LBD(PDB代碼：2HFP)復合的(de)有效磺酰基甲酰胺(an)拮抗劑(ji)的(de)X-射線結構(Hopkins等人，2006)。

相應的(de)(de)配體并入(ru)了(le)MTTB的(de)(de)所(suo)有結(jie)構特(te)征(zheng)(圖1A)：酸(suan)性(xing)端基、相鄰親脂性(xing)部(bu)分(fen)(fen)和在(zai)相對(dui)位點(dian)(dian)上(shang)具(ju)有芳(fang)(fang)香族(zu)取代基的(de)(de)中心芳(fang)(fang)香核。如圖1B所(suo)示，對(dui)接(jie)方案集(ji)中于(yu)(yu)產生一個(ge)單結(jie)合(he)模式。羧(suo)基部(bu)分(fen)(fen)參(can)與和賴氨酸(suan)265的(de)(de)離子相互(hu)作(zuo)用(yong)和與絲氨酸(suan)342主(zhu)鏈(lian)酰胺的(de)(de)氫(qing)鍵中。芳(fang)(fang)香族(zu)部(bu)分(fen)(fen)和α烷基鏈(lian)占據疏水位點(dian)(dian)，表明是(shi)有利的(de)(de)相互(hu)作(zuo)用(yong)。位于(yu)(yu)共(gong)晶(jing)(見上(shang)文)配體部(bu)分(fen)(fen)上(shang)的(de)(de)藥效特(te)征(zheng)用(yong)于(yu)(yu)配體布置。水分(fen)(fen)子留在(zai)結(jie)合(he)位點(dian)(dian)中。將(jiang)經(jing)證實(shi)非(fei)常適合(he)在(zai)PPARγ-LBD中對(dui)接(jie)的(de)(de)αHB分(fen)(fen)數(Weber等人，2012)用(yong)于(yu)(yu)初(chu)始評分(fen)(fen)GBVI/WSA dG(基于(yu)(yu)力場的(de)(de)函數)，以用(yong)于(yu)(yu)改進。

實施例(li)3：MTTB抑制羅格列(lie)酮誘(you)導(dao)的PPARγ反式(shi)激活

為分析細胞(bao)(bao)水平(ping)下(xia)PPARγ拮抗(kang)劑GW9662(Leesnitzer等人，2002)、SPPARγM FMOC-L-亮氨酸(Rocchi等人，2001)和(he)(he)MCC-555(Reginato等人，1998)及(ji)PPARγ激動劑羅(luo)格列酮(Willson等人，1996)的(de)激動和(he)(he)拮抗(kang)作用(yong)，在HEK293T細胞(bao)(bao)中(zhong)使用(yong)PPARγ依賴性反式(shi)激活(huo)測(ce)定(ding)法。測(ce)定(ding)每份(fen)樣品(pin)中(zhong)的(de)螢火(huo)蟲熒光(guang)(guang)素酶發光(guang)(guang)值(zhi)(zhi)和(he)(he)對照海(hai)腎熒光(guang)(guang)素酶發光(guang)(guang)值(zhi)(zhi)。使用(yong)螢火(huo)蟲與(yu)海(hai)腎熒光(guang)(guang)素酶發光(guang)(guang)值(zhi)(zhi)之比歸一(yi)化熒光(guang)(guang)素酶活(huo)性值(zhi)(zhi)。

在(zai)刺(ci)(ci)激(ji)(ji)24小時后激(ji)(ji)動劑濃度(du)相(xiang)對于(yu)PPARγ受體(ti)相(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)劑的(de)(de)(de)曲線表(biao)現出(chu)不同的(de)(de)(de)進程(cheng)(圖(tu)2A)。僅羅格列酮顯(xian)(xian)示出(chu)高(gao)(gao)激(ji)(ji)動作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)并(bing)且以劑量依賴方式(shi)反(fan)式(shi)激(ji)(ji)活(huo)PPARγ。令(ling)人驚訝的(de)(de)(de)是，作(zuo)(zuo)為不可逆性完全PPARγ拮(jie)(jie)抗(kang)劑的(de)(de)(de)GW9662，顯(xian)(xian)示出(chu)激(ji)(ji)動作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)并(bing)且與DMSO對照處理相(xiang)比，導致非劑量依賴性、高(gao)(gao)3倍的(de)(de)(de)PPARγ反(fan)式(shi)激(ji)(ji)活(huo)。更(geng)高(gao)(gao)濃度(du)(高(gao)(gao)于(yu)1μΜ)的(de)(de)(de)SPPARγM MCC-555反(fan)式(shi)激(ji)(ji)活(huo)PPARγ。在(zai)所有情(qing)況下，FMOC-L-亮氨(an)(an)酸均未顯(xian)(xian)示出(chu)激(ji)(ji)動作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)。如(ru)圖(tu)2B所示，僅PPARγ拮(jie)(jie)抗(kang)劑GW9962抑制(zhi)對激(ji)(ji)動劑(1μΜ羅格列酮)刺(ci)(ci)激(ji)(ji)反(fan)應的(de)(de)(de)時間進程(cheng)。SPPARγM，FMOC-L-亮氨(an)(an)酸和MCC-555在(zai)HEK293T細胞中都未顯(xian)(xian)示出(chu)任何(he)拮(jie)(jie)抗(kang)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)。FMOC-L-亮氨(an)(an)酸和MCC-555極弱的(de)(de)(de)激(ji)(ji)動作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)和不存在(zai)的(de)(de)(de)拮(jie)(jie)抗(kang)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)促使(shi)我(wo)們(men)使(shi)用(yong)(yong)GW9662進行(xing)以下實驗并(bing)且作(zuo)(zuo)為參考(kao)化(hua)合物(wu)來分析(xi)。

為檢驗提(ti)出(chu)的(de)MTTB與PPARγ-LBD的(de)相互作(zuo)用(yong)(圖(tu)1B)并(bing)且測試在(zai)(zai)HEK293T細(xi)(xi)胞和(he)Jurkat T細(xi)(xi)胞中(zhong)的(de)潛在(zai)(zai)激(ji)(ji)(ji)(ji)動和(he)拮(jie)抗(kang)作(zuo)用(yong)，也在(zai)(zai)PPARγ依賴(lai)性(xing)(xing)反(fan)式(shi)激(ji)(ji)(ji)(ji)活測定法中(zhong)試驗了該化(hua)合物。細(xi)(xi)胞用(yong)不同劑量的(de)單獨或組合的(de)MTTB和(he)羅(luo)格(ge)(ge)列(lie)酮(tong)(tong)(tong)培養24小時。如圖(tu)3A和(he)C所示(shi)(shi)，MTTB在(zai)(zai)HEK293T細(xi)(xi)胞和(he)Jurkat T細(xi)(xi)胞中(zhong)未表現出(chu)激(ji)(ji)(ji)(ji)動作(zuo)用(yong)。在(zai)(zai)兩種細(xi)(xi)胞系中(zhong)，MTTB導(dao)(dao)致劑量依賴(lai)性(xing)(xing)抑制(zhi)羅(luo)格(ge)(ge)列(lie)酮(tong)(tong)(tong)誘導(dao)(dao)的(de)PPARγ反(fan)式(shi)激(ji)(ji)(ji)(ji)活，具(ju)有(you)競爭性(xing)(xing)拮(jie)抗(kang)/部分激(ji)(ji)(ji)(ji)動特征。參(can)考化(hua)合物GW9662在(zai)(zai)HEK293T細(xi)(xi)胞和(he)Jurkat T細(xi)(xi)胞中(zhong)顯示(shi)(shi)出(chu)完全(quan)拮(jie)抗(kang)作(zuo)用(yong)并(bing)且非劑量依賴(lai)性(xing)(xing)地抑制(zhi)羅(luo)格(ge)(ge)列(lie)酮(tong)(tong)(tong)介導(dao)(dao)的(de)PPARγ反(fan)式(shi)激(ji)(ji)(ji)(ji)活(圖(tu)3B和(he)D)。然而，單獨的(de)GW9662激(ji)(ji)(ji)(ji)活PPARγ并(bing)且在(zai)(zai)在(zai)(zai)兩種細(xi)(xi)胞系中(zhong)的(de)反(fan)式(shi)激(ji)(ji)(ji)(ji)活測定法中(zhong)顯示(shi)(shi)出(chu)驚人高的(de)激(ji)(ji)(ji)(ji)動作(zuo)用(yong)。如圖(tu)3E所示(shi)(shi)，MTTB能夠抑制(zhi)羅(luo)格(ge)(ge)列(lie)酮(tong)(tong)(tong)(1μΜ)的(de)激(ji)(ji)(ji)(ji)動活性(xing)(xing)，在(zai)(zai)HEK293T細(xi)(xi)胞中(zhong)24小時后(hou)IC50值為4.3μΜ。

實施例4：MTTB和GW9662對細胞存活的影響

為研究MTTB和參考化合物GW9662對HEK293T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)、HuT-78細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和Jurkat T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)存(cun)活(huo)的(de)(de)影(ying)響，使細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)經(jing)受(shou)遞增(zeng)劑量(liang)(1-30μΜ)的(de)(de)MTTB或GW9662，持續24小時。通過MTT測(ce)定(ding)法分析細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)力(li)(li)。MTTB在(zai)高(gao)達10μΜ的(de)(de)濃度(du)(du)下(xia)無細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性(xing)作用(yong)(圖(tu)4A)。在(zai)全部三種細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系中MTTB展示(shi)出(chu)同等活(huo)力(li)(li)損失。相反，GW9662在(zai)所用(yong)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系中顯(xian)示(shi)出(chu)不同的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性(xing)(圖(tu)4B)。在(zai)HEK293T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中，高(gao)達30μΜ的(de)(de)濃度(du)(du)，未檢(jian)測(ce)到活(huo)力(li)(li)損失。然(ran)而，在(zai)HuT-78細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和Jurkat T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中，GW9662分別(bie)在(zai)高(gao)于(yu)20μΜ和30μΜ的(de)(de)濃度(du)(du)下(xia)明(ming)顯(xian)有細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性(xing)。

實施例(li)5：MTTB顯示出高(gao)胞內累積

通過LC-MS/MS分析(xi)MTTB(10μΜ)和(he)參考PPARγ拮(jie)抗(kang)劑GW9662(10μΜ)的百分比(bi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)累(lei)(lei)積(ji)(ji)的時(shi)間(jian)(jian)進(jin)程。如圖(tu)5A所示，MTTB在(zai)HuT-78細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)Jurkat T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)24小(xiao)時(shi)后(hou)顯示出(chu)約10％的快速持續時(shi)間(jian)(jian)非依賴性(xing)胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)累(lei)(lei)積(ji)(ji)。在(zai)HEK293T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)，看到(dao)(dao)胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)MTTB濃度(du)的時(shi)間(jian)(jian)依賴性(xing)增加，24小(xiao)時(shi)后(hou)達到(dao)(dao)胞(bao)(bao)(bao)(bao)外濃度(du)的約25％。如圖(tu)5B所示，GW9662與(yu)MTTB相比(bi)顯示出(chu)低10倍(bei)的胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)積(ji)(ji)累(lei)(lei)率，在(zai)HEK293T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)隨時(shi)間(jian)(jian)而減少。在(zai)HuT-78細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)Jurkat T細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)，GW9662的胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)累(lei)(lei)積(ji)(ji)比(bi)MTTB低約100倍(bei)(圖(tu)5A)。尤其是在(zai)HuT-78細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)，胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)GW9662累(lei)(lei)積(ji)(ji)存在(zai)快速的時(shi)間(jian)(jian)依賴性(xing)降低。

實(shi)施例6：MTTB顯著增強膿毒(du)癥小(xiao)鼠模型中的(de)存(cun)活

在(zai)(zai)先前公(gong)開的膿毒(du)癥小(xiao)(xiao)鼠(shu)模型中測試(shi)MTTB的活(huo)性(Rittirsch D,Huber-Lang MS,Flierl MA,Ward PA.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.Nat Protoc 2009；4:31-36)。簡言之，盲腸結(jie)(jie)扎和穿刺模型(CLP)如Rittirsch等(deng)人所述(shu)，使用20號口徑穿刺針進(jin)行或對于佯裝(zhuang)小(xiao)(xiao)鼠(shu)而言無(wu)需結(jie)(jie)扎和穿刺。在(zai)(zai)結(jie)(jie)扎和穿刺3小(xiao)(xiao)時后(hou)腹膜(mo)內施加(jia)負載MTTB的納米顆(ke)粒。圖6示出(chu)了與對照納米顆(ke)粒相比(bi)，經MTTB處理的膿毒(du)癥小(xiao)(xiao)鼠(shu)的體內顯(xian)著存活(huo)率。這是本(ben)發明化合物在(zai)(zai)免疫性疾(ji)病如膿毒(du)癥治療中的適用性的驚人證明。

討論和結論

對PPARγ分子相(xiang)互作(zuo)用和信(xin)號轉導途徑，及(ji)其在分子、細胞和臨床情況下(xia)的(de)激活(huo)的(de)大(da)量(liang)闡(chan)釋(shi)，已經提供了(le)設計(ji)治療上(shang)有用的(de)PPARγ激動劑和SPPARγM的(de)寶貴見解(Willson等(deng)人(ren)(ren)，2000；Sporn等(deng)人(ren)(ren)，2001；Balint等(deng)人(ren)(ren)，2006)。雖然(ran)(ran)PPARγ受天然(ran)(ran)和合成配(pei)體的(de)激活(huo)是(shi)非常確實的(de)(Forman等(deng)人(ren)(ren)，1995；Kliewer等(deng)人(ren)(ren)，1995)，但是(shi)關(guan)于(yu)PPARγ拮抗(kang)作(zuo)用知之(zhi)甚(shen)少。然(ran)(ran)而，增進對PPARγ拮抗(kang)作(zuo)用的(de)生(sheng)物(wu)相(xiang)關(guan)性的(de)理解強調了(le)對發現不(bu)產生(sheng)已知副作(zuo)用的(de)新的(de)治療上(shang)有用的(de)PPARγ拮抗(kang)劑的(de)關(guan)鍵性需求。

目前(qian)，GW9662是(shi)最熟知且最突出的(de)(de)PPARγ拮抗劑(ji)(Leesnitzer等人，2002)，但是(shi)其顯示出不(bu)良性(xing)質，包括不(bu)可逆性(xing)PPARγ拮抗作用(yong)。因此，發明人已經(jing)從(cong)結構相(xiang)關的(de)(de)化合物篩選中鑒定并(bing)表征MTTB，為有前(qian)景的(de)(de)新(xin)一類競爭性(xing)PPARγ拮抗劑(ji)的(de)(de)原型(xing)。與可商購獲得的(de)(de)PPARγ拮抗劑(ji)GW9662相(xiang)比，MTTB提供(gong)了調節PPARγ抑制(zhi)和免(mian)疫反應的(de)(de)可能性(xing)并(bing)且可能非常(chang)適合在炎癥情況下的(de)(de)受控治療使用(yong)。

與Leesnitzer和(he)(he)其同事一致，發明人(ren)用(yong)GW9662觀察到(dao)非競(jing)爭不可(ke)逆(ni)性(xing)拮抗作(zuo)(zuo)用(yong)(Leesnitzer等(deng)人(ren)，2002)，使得羅格列(lie)酮(tong)介導的(de)(de)(de)PPARγ反式激(ji)活(huo)(huo)完全受抑制。用(yong)羅格列(lie)酮(tong)和(he)(he)GW9662共同處(chu)(chu)理HEK293T細胞和(he)(he)Jurkat T細胞顯(xian)示出預計的(de)(de)(de)拮抗作(zuo)(zuo)用(yong)。有(you)趣的(de)(de)(de)是，單(dan)獨的(de)(de)(de)GW9662導致非劑(ji)量依賴性(xing)、約3倍(bei)的(de)(de)(de)PPARγ反式激(ji)活(huo)(huo)，就發明人(ren)所知這(zhe)在(zai)之(zhi)前尚(shang)未被(bei)報道。這(zhe)些(xie)結(jie)果表明在(zai)HEK293T細胞和(he)(he)Jurkat T細胞中GW9662不是典型(xing)的(de)(de)(de)完全PPARγ拮抗劑(ji)，而是起到(dao)具有(you)強(qiang)拮抗活(huo)(huo)性(xing)和(he)(he)不同的(de)(de)(de)非劑(ji)量依賴性(xing)激(ji)動活(huo)(huo)性(xing)的(de)(de)(de)SPPARγM的(de)(de)(de)作(zuo)(zuo)用(yong)(Olefsky等(deng)人(ren)，2000；Knouff等(deng)人(ren)，2004)。由(you)于GW9962在(zai)PPARγ蛋白質處(chu)(chu)的(de)(de)(de)不可(ke)逆(ni)性(xing)結(jie)合(he)和(he)(he)非劑(ji)量依賴性(xing)激(ji)動作(zuo)(zuo)用(yong)，它不適(shi)合(he)治療使用(yong)。

已經報(bao)道(dao)稱GW9962在(zai)無(wu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和(he)(he)基(ji)于(yu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)測定(ding)法中(zhong)(zhong)(IC50為3.3nM)和(he)(he)在(zai)人(ren)(ren)乳腺腫瘤細(xi)(xi)(xi)胞(bao)系中(zhong)(zhong)通(tong)過共價(jia)修飾PPARγ的(de)(de)(de)配體結合位(wei)點中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)半胱氨酸285殘基(ji)而(er)起(qi)到(dao)具(ju)有高(gao)親和(he)(he)力(li)和(he)(he)選擇(ze)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)有效PPARγ拮抗(kang)劑的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)(Leesnitzer等人(ren)(ren)，2002；Seargent等人(ren)(ren)，2004)。因此，GW9662完全且不可逆(ni)地消除PPARγ激活和(he)(he)信號傳遞。發明人(ren)(ren)僅(jin)觀察(cha)到(dao)SPPARγM，FMOC-L-亮氨酸和(he)(he)MCC-555的(de)(de)(de)溫和(he)(he)或微弱(ruo)作(zuo)用(yong)(yong)，而(er)GW9662和(he)(he)MTTB在(zai)HEK293T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和(he)(he)Jurkat T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)強有力(li)地抑制羅格列酮的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)。在(zai)HEK293T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)IC50為4.3μΜ，MTTB在(zai)低于(yu)對(dui)(dui)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)系中(zhong)(zhong)PPARγ受GW9662的(de)(de)(de)拮抗(kang)作(zuo)用(yong)(yong)所報(bao)道(dao)的(de)(de)(de)濃度下(xia)表現出溫和(he)(he)的(de)(de)(de)劑量依賴性(xing)(xing)、競(jing)爭性(xing)(xing)拮抗(kang)活性(xing)(xing)。在(zai)Jurkat T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)也檢驗(yan)了MTTB對(dui)(dui)羅格列酮介導的(de)(de)(de)PPARγ反式激活的(de)(de)(de)這種競(jing)爭性(xing)(xing)拮抗(kang)效力(li)。與GW9662相(xiang)反，MTTB在(zai)HuT-78細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和(he)(he)Jurkat T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)兩者中(zhong)(zhong)顯示出更低的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)毒性(xing)(xing)，表明在(zai)試驗(yan)濃度下(xia)，很可能對(dui)(dui)炎癥細(xi)(xi)(xi)胞(bao)發揮藥理(li)(li)而(er)非毒理(li)(li)作(zuo)用(yong)(yong)。發明人(ren)(ren)觀察(cha)到(dao)與GW9662相(xiang)比，MTTB向HuT-78細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和(he)(he)Jurkat T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)胞(bao)內累積高(gao)約100倍，與HEK293T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)相(xiang)反，其中(zhong)(zhong)MTTB攝(she)取量僅(jin)比GW9662高(gao)10倍，表明對(dui)(dui)淋巴細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)潛在(zai)選擇(ze)性(xing)(xing)。

有趣的(de)(de)是，MTTB的(de)(de)結構和計算對接分析(xi)強(qiang)調(diao)了MTTB對PPARγ-LBD的(de)(de)潛在親和力(li)并且(qie)著重(zhong)指出了在PPARγ處MTTB、拮抗劑GW9662和激動劑羅格列酮之間的(de)(de)結合特征的(de)(de)差異(Chandra等人，2008)。

因此MTTB將(jiang)用(yong)作(zuo)先導(dao)化(hua)合物用(yong)于(yu)通(tong)過(guo)修飾其外部殘基(ji)而增(zeng)強PPARγ結合親(qin)和力。考慮到正如已經對結構相(xiang)似的PPARγTZD完(wan)全(quan)激(ji)動劑羅格列酮和吡格列酮(pioglitazone)所示(Berger等人(ren)，2005；Nissen等人(ren)，2007)，配體(ti)(ti)受(shou)體(ti)(ti)相(xiang)互作(zuo)用(yong)的微小變化(hua)導(dao)致藥理學性質(zhi)上(shang)的差異，結構修飾可進一步(bu)提高MTTB的拮抗作(zuo)用(yong)。

由(you)于(yu)GW9662的(de)(de)強拮抗(kang)活性(xing)(xing)，所(suo)以在(zai)(zai)細胞(bao)(bao)培養(yang)體(ti)系和動(dong)(dong)物(wu)(wu)模型中將(jiang)其廣(guang)泛用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)作(zuo)(zuo)研究(jiu)(jiu)工具用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)研究(jiu)(jiu)PPARγ在(zai)(zai)生物(wu)(wu)過(guo)程中的(de)(de)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)。與GW9662結(jie)合的(de)(de)不可逆性(xing)(xing)相反(fan)，MTTB似乎與PPARγ蛋白可逆性(xing)(xing)結(jie)合。總的(de)(de)來說，競爭性(xing)(xing)拮抗(kang)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)、低的(de)(de)部分(fen)激動(dong)(dong)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)、低的(de)(de)細胞(bao)(bao)毒(du)性(xing)(xing)和高的(de)(de)胞(bao)(bao)內攝取量是將(jiang)允許MTTB安全重復給藥以供潛在(zai)(zai)治(zhi)療使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)性(xing)(xing)質。計劃在(zai)(zai)動(dong)(dong)物(wu)(wu)模型中進一步(bu)研究(jiu)(jiu)。這(zhe)里用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)MTTB呈現的(de)(de)結(jie)果(guo)表明，它是新(xin)一類競爭性(xing)(xing)PPARγ拮抗(kang)劑的(de)(de)原型，及炎癥和免(mian)疫性(xing)(xing)病癥受控治(zhi)療廣(guang)泛適(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)治(zhi)療方法的(de)(de)有前景的(de)(de)候選(xuan)方法。