一種hbv相關的融合蛋白、其制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，具體地說，本發明涉及一種皿V相關的融合蛋白、其制 備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 人己型肝炎病毒化umanh巧atitisBvirus,皿V)感染是全球性的公共衛生問 題，根據世界衛生組織（(World化alth化ganization，WH0)的統計，全球范圍內有超過20 億人曾感染過皿V，其中，3. 5億正遭受慢性皿V感染之苦（WHO, 2000)。我國為己型肝炎的 高發區。2006年全國病毒性肝炎血清流行病學調查數據顯示，在全部人群中己肝表面抗原 化BsAg)的陽性率為7. 18%。據此估計我國約有9300萬人為皿V攜帶者，其中，3000萬例 為慢性己型肝炎患者。研究還顯示，慢性的皿V感染與肝硬化和肝癌的發病率和死亡率密 切相關。
[0003] 機體清除皿V的關鍵在于誘導活化出有效的特異性CD8+細胞毒性T淋己細胞，并 通過MHC-I類分子遞呈途徑誘導感染病毒的細胞自溶。目前本領域中，仍然缺乏有效的誘 導機體清除體內皿V的技術。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種能夠誘導皿V特異性的CTL反應的皿V相關的融合蛋 白、其制備方法及其應用。
[0005] 本發明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白具有式la、式Ib或式Ic 所述結構：
[0006]T-U-H-C (la),
[0007]T-C-U-H (扣），
[0008]T-H-U-C (Ic),或
[000引 其中，
[0010] T為任選的標簽序列和/或信號膚序列；
[0011]C為包括CTP的多膚元件；
[0012] U為包括化的多膚元件；
[0013] Η為包括皿cAg的多膚元件；
[0014]"-"表示連接上述各元件的膚鍵或膚接頭。
[0015] 在另一優選例中，所述多膚元件C選自下組：
[001引 （A)具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多膚；
[0017] 度）具有與SEQIDNO: 2中任一所示氨基酸序列> 80%同源性（優選地，> 90% 的同源性；等優選地> 95%的同源性；最優選地，> 97%的同源性）的多膚；
[0018](C)將SEQIDN0:2或4中任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的衍生多膚。
[0019] 在另一優選例中，所述多膚元件C的長度為11個氨基酸。
[0020] 在另一優選例中，所述多膚元件U選自下組：
[0021] (A)具有SEQIDNO: 4所示氨基酸序列的多膚；
[0022] 度）具有與SEQIDNO: 4中任一所示氨基酸序列> 80%同源性（優選地，> 90% 的同源性；等優選地> 95%的同源性；最優選地，> 97%的同源性）的多膚；
[0023] (C)將SEQIDN0:4中任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多膚。
[0024] 在另一優選例中，所述多膚元件U的長度為76個氨基酸。
[0025] 在另一優選例中，所述多膚元件Η選自下組：
[002引 （Α)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多膚；
[0027] 度）具有與SEQIDNO: 6中任一所示氨基酸序列> 80%同源性（優選地，> 90% 的同源性；等優選地> 95%的同源性；最優選地，> 97%的同源性）的多膚；
[0028] (C)將SEQIDNO:6中任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多膚。
[0029] 在另一優選例中，所述多膚元件Η的長度為160-200個氨基酸。
[0030] 在另一優選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. :8或10所示。
[0031] 在另一優選例中，所述融合蛋白具有W下特性：
[0032]a)具有穿透細胞膜的能力；
[0033]b)刺激T淋己細胞增殖；
[0034]C)誘導T淋己細胞分泌Thl型細胞因子；
[003引 d)誘導皿V特異性的CTL反應。
[0036] 在另一優選例中，所述標簽序列為MBP標簽序列。
[0037] 本發明的第二方面，提供了一種分離的多核巧酸，所述多核巧酸編碼本發明第一 方面所述的融合蛋白。
[0038] 在另一優選例中，所述多核巧酸選自下組：
[00測 （a)編碼如SEQIDNO. :8或10所示多膚的多核巧酸；
[0040] 化）序列如SEQIDNO. : 7或9所示的多核巧酸；
[0041](C)核巧酸序列與化）所示序列的同源性> 95% (較佳地> 98% )的多核巧酸；
[0042] (d)如化）所示多核巧酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60個（較佳地1-30， 更佳地1-10個）核巧酸的多核巧酸；
[004引（e)與（a)-(d)任一所述的多核巧酸互補的多核巧酸。
[0044] 在另一優選例中，所述的多核巧酸序列如SEQIDN0:7或9所示。
[0045] 本發明的第Η方面，提供了一種載體，所述載體包括本發明第二方面所述的多核 巧酸。
[0046] 在另一優選例中，所述載體WPCDNA3. 1(-)-Ub-冊cAg質粒為骨架。
[0047] 本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞表達本發明第一方面所 述的融合蛋白；和/或
[0048] 所述宿主細胞基因組中整合有本發明第二方面所述的多核巧酸；和/或
[0049] 所述宿主細胞含有本發明第Η方面所述的載體。
[0050] 在另一優選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞（如酵母細胞）。
[0051] 在另一優選例中，所述的宿主細胞包括大腸桿菌、酵母、果觸S2細胞、010細胞、DC 細胞等。
[0052] 在另一優選例中，所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選為大腸桿菌化21 0E3)。
[0053] 本發明的第五方面，提供了一種制備融合蛋白的方法，包括步驟：
[0054] 在適合表達的條件下，培養本發明第四方面所述的宿主細胞，從而表達出本發明 第一方面所述的融合蛋白；和
[00巧]分離所述融合蛋白。
[0056] 在另一優選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。優選地，所述宿主細胞為 大腸桿菌細胞。更優選地，所述大腸桿菌為大腸桿菌化21 0E3)。
[0057] 本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含；本發明第一方面所 述的融合蛋白、本發明第二方面所述的多核巧酸或本發明第Η方面所述的載體，W及藥學 上可接受的載體或賦形劑。
[0058] 在另一優選例中，所述藥物組合物包括疫苗組合物。
[0059] 本發明的第走方面，提供了一種疫苗組合物，所述組合物包含；本發明第一方面所 述的融合蛋白、本發明第二方面所述的多核巧酸或本發明第Η方面所述的載體，W及免疫 學上可接受的載體和/或輔料。
[0060] 在另一優選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。
[0061] 在另一優選例中，所述的佐劑包括氧化鉛、皂巧、quilΑ、胞壁醜二膚、礦物油或 植物油、基于囊泡的佐劑、非離子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、細胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、比-6、比-12 和CpG)。
[0062] 本發明的第八方面，提供了本發明第一方面所述的融合蛋白的用途，用于制備藥 劑或試劑，所述藥劑或試劑用于：
[006引 （1)治療皿V感染；和/或
[0064]似誘導皿V特異性的CTL反應；和/或
[006引做誘導T淋己細胞分泌Thl型細胞因子；和/或
[0066] (4)刺激T淋己細胞增殖。
[0067] 本發明的第九方面，提供了一種治療皿V感染或皿V感染相關疾病的方法，包括步 驟；給需要的對象施用本發明第一方面所述的融合蛋白。
[0068] 在另一優選例中，所述的融合蛋白W單體和/或二聚體形式施用。
[0069] 在另一優選例中，所述的對象是人。
[0070] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可W互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0071] 圖1顯示了融合蛋白表達的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0072] 圖2顯示了免疫英光檢測結果。
[0073] 圖3顯示了Westernblot檢測結果。
[0074] 圖4顯示了體外活性檢測中流式細胞術檢測結果。
[0075] 圖5顯示了體外活性檢測中ELISA法檢測的結果。
[0076] 圖6顯示了體內活性檢測中流式細胞術（FCM)檢測T淋己細胞內的細胞因子。
[0077] 圖7顯示了體內活性檢測中酶聯免疫吸附法巧LISA)檢測T淋己細胞分泌細胞因 子。
[0078] 圖8顯示了體內活性檢測中細胞計數試劑盒（CCK-8)檢測T淋己細胞增殖活性。
[0079] 圖9顯示了皿V轉基因小鼠體內活性檢測中流式細胞儀檢測脾細胞中CTL水平。
[0080] 圖10顯示了體內活性檢測中肝臟組織的檢測結果，其中圖A顯示了皿V轉基因小 鼠常規肥染色，圖B顯示了皿sAg免疫組織化學染色，圖C顯示了皿cAg免疫組織化學染 色。
[0081] 圖11顯示了英光定量聚合酶鏈反應（PCR)檢測血清中皿V DNA水平。
[0082] 圖12顯示了微粒子酶免疫分析法（MEIA)檢測己型肝炎表面抗原（皿sAg)水平。
[0083] 圖13顯示了體內活性檢測中ALT水平的檢測結果。
[0084] 圖14顯示了體內活性檢測中特異性CTL的表達水平的檢測結果。
【具體實施方式】
[0085] 本發明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種皿V相關的融合蛋白，實驗結果表明， 所述融合蛋白能夠穿過細胞膜并誘導皿V特異性的CTL反應。本發明還提供了上述融合蛋 白的制備方法及其用途。
[0086] CTP
[0087] 胞漿轉導膚（切toplasmic trans化ctio噸巧tide, CT巧是一種可攜帶生物活性大 分子（蛋白、多膚、核酸等