一種抗cd16a抗原和抗muc1抗原的雙特異性抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，尤其設及一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特 異性抗體。
【背景技術】 W02]CD16A(Fc丫RIIIA)是一種跨膜結構的IgGFc受體，有190AA的胞外區和25AA的胞內區，屬于Ig超家族成員，主要分布于NK(naturalkiller,自然殺傷）細胞、巨隧 細胞和嗜酸性粒細胞表面。抗體依賴性細胞毒性（antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，簡稱ADCC)是抗體的一種重要的效應功能，當抗體與祀細胞（比如腫瘤細 胞)結合W后，抗體的Fc端可通過Fc受體（CD16A)與NK細胞結合并激活NK細胞，后者通過 釋放顆粒酶及穿孔素等將祀細胞殺死。CD16A介導NK細胞和單核巨隧細胞的ADCC作用，在 特異性和非特異性免疫中具有重要作用，是機體清除免疫復合物和腫瘤細胞的關鍵受體。 因此WCD16A分子為祀標的BsAb(雙特異性抗體）對于引導NK(naturalkiller,自然殺 傷）細胞和巨嗜細胞可能具有優勢。
[0003] MUCK粘蛋白1)是一種具有跨膜序列的附膜糖蛋白，其cDNA克隆是通過篩選從乳 腺癌、膜腺癌等細胞系構建的cDNA表達文庫而得到的。MUC1在乳腺正常及瘤組織中均有表 達，但在正常腺細胞表達很低，主要分布于腺細胞表面，呈頂端表達，或W分泌形式存在于 腺腔內，不被免疫系統識別。MUC1在癌組織中存在崎形糖基化和糖基化不完全，使MUC1的 核屯、蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，分布于整個癌細胞表面，可為免疫系統識別， 成為腫瘤特異的抗原，大約90%W上的乳腺癌有MUC1的過度表達。Rahn和Soares等采 用免疫組化對乳腺癌及良性乳腺病變進行了研究，結果表明，正常乳腺上皮細胞可見MUC1 弱陽性表達，MUC1在乳腺癌組織中的高表達與乳腺良性病態組織及乳腺正常低表達之間存 在顯著性差異。而乳腺良性病變組織中MUC1表達無顯著差異，證實了MUC1基因的編碼產 物是重要的癌標志物。此外，最近的研究還發現，腫瘤細胞MUC1可抑制嗜酸粒細胞對祀細 胞的ADCC作用。Ogata等報道含有S化表位的MUC1可大大提高錠離子對NK細胞的抑制作 用；隨后又有報道轉染MUC1cDNA的腫瘤細胞對殺傷細胞的敏感性降低，腫瘤細胞分泌的 MUC1可抑制T細胞的增殖，使其處于G0/G1期，運些研究均表明MUC1對抗腫瘤的細胞免疫 應答具有抑制作用。因此，MUC1是腫瘤特異性免疫治療理想的祀分子。目前，已有多家研 究機構制備了多種MUC1單克隆抗體，其中56株已得到國際腫瘤生物醫學協會（IS0BM)的 確認，但由于療效有限，遠不能滿足現實需求。
[0004] 雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb)是具有兩個抗原結合位點，可選擇 性募集效應細胞到祀細胞周圍，介導特異性殺傷作用的新型人工抗體。通過BsAb介導免疫 細胞殺死腫瘤細胞是當前腫瘤免疫治療應用研究的熱點，其主要作用機理是BsAb能同時 結合腫瘤相關抗原和免疫細胞上的祀分子，直接觸發免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺 傷。目前雙特異性抗體的結構主要WScFv為主，僅由兩種抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區 構成。由于ScFv構型的雙特異性抗體分子量小，結構不穩定，導致在體內半衰期短，易被清 除，難w達到有效殺傷腫瘤細胞的目的。

【發明內容】
陽005] 針對W上技術問題，本發明公開了 一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗 體，基于現有技術中的單一識別在腫瘤治療中療效不足的問題，本發明公開了一種能夠同 時結合腫瘤相關抗原和免疫細胞祀分子的雙特異性抗體，在識別肝癌細胞MUC1抗原，誘導 ADCC的同時，識別免疫效應細胞的CD16A抗原，有效地引導免疫效應細胞對腫瘤細胞的特 異性殺傷。
[0006] 對此，本發明采用的技術方案為： 一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體，包含： 特異性識別免疫效應細胞的CD16A抗原的第一功能域， 特異性識別肝癌細胞MUC1抗原的第二功能域，和 連接上述功能域的接頭。 陽007] 作為本發明的進一步改進，抗CD16A抗體的輕鏈可變區（VL)與抗MUC1抗體的重鏈 可變區（VH)通過G4S序列連接構成第一ScFv區，抗MUC1抗體的化和抗CD16A抗體的VH通過G4S序列連接構成第二ScFv區，所述第一ScFv區和第二ScFv區通過longlinker串 聯；其中，所述抗CD16A抗體的化氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示，抗MUC1抗體的VH氨基 酸序列如SEQIDN0:2所示、抗MUC1抗體的化氨基酸序列如SEQIDN0:3所示和抗CD16A 抗體的VH氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，具體如下： 沈QIDNO:1 : DTVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVD抑細SFMNWYQQKPGQPP化LIYTTSNLESGIPASFSASGSGT DFTLNIHPVE邸DTATYYCQQS肥DPYTFGGGTKLEIK ; 沈QIDNO:2 : QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGHYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPVTGGTKYAQNFQGWVTMT畑TSIRTAYMELS化RS孤TAMYYCAREVTGDRGQ抑KWGQGTLVTVAS; 沈QIDNO:3 : QSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGG順IGSKSV冊YQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGI陽RFSGSNSGNTATLT ISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDWVFGGGTKLTTL ; 沈QIDNO:4 : QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGF化STSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWW孤DKRYNPALKS化TISK DTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSSo
[0008] 作為本發明的進一步改進，所述longlinker的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
[0009]沈Q ID NO :5 :GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS。
[0010] 作為本發明的進一步改進，所述第二ScFv區同時與IgGl的C肥域和C冊域連接， IgG的前導膚序列為信號膚。 1] 采用此技術方案，將ScFv與Fc進行結合，采用ScFv-Fc構型，增加雙抗的穩定性， 有效延長雙抗的半衰期，并通過Fc結構域介導的ADCC途徑，有效的增強雙抗殺瘤能力。 [0012] 作為本發明的進一步改進，所述抗MUC1抗體為巧95,所述抗CD16A抗體為 EPR4333〇
[0013] 本發明還公開了如上所述的抗CD16A抗原和抗MUCl抗原的雙特異性抗體的核巧 酸序列。
[0014] 本發明還公開了包含上述核巧酸序列的載體。 陽015] 本發明還公開了如上所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體在制備 治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
[0016] 本發明的有益效果為： 第一，采用本本發明的技術方案，克服了現有技術中的單一識別在腫瘤治療中療效不 足的問題，同時又克服了ScFv構型的雙特異性抗體分子量小，結構不穩定，半衰期短，易被 清除的技術問題，將ScFv與Fc進行結合，采用ScFv-Fc構型，增加雙抗的穩定性，有效延長 雙抗的半衰期。 陽017] 第二，采用本本發明的技術方案，所述的抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性 抗體在識別肝癌細胞MUC1抗原，誘導ADCC的同時，能識別免疫效應細胞的CD16A抗原，增 強了NK細胞對腫瘤細胞的殺傷能力，有效地引導免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷， 選擇性殺傷腫瘤細胞，副作用小。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發明的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體序列結構示意 圖。
[0019] 圖2是本發明的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體的SDS-PAGE蛋 白電泳圖。
[0020] 圖3是本發明的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體的流式結果圖。 陽02U 圖4是本發明的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體的體外細胞毒 分析圖。
[0022] 圖5是本發明一種實施例在濃度為50nM下的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的 雙特異性抗體與單獨單抗組、同時添加兩種單抗組的體外細胞毒對比分析圖。 陽02引圖6是本發明的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體的細胞因子分 泌水平圖。
[0024]圖7是本發明的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體與生理鹽水組 和單純NK組對照的體內介導NK抑制體內腫瘤增殖的對比圖。 陽025] 圖8是本發明的一種抗CD16A抗原和抗MUC1抗原的雙特異性抗體與生理鹽水組 和單純NK組對照的腫瘤模型鼠生存率對比圖。
【具體實施方式】