鳳凰單叢茶樹內生拮抗芽孢桿菌zf04及在生防中應用
【專利摘要】本發明公開一種鳳凰單叢茶樹內生拮抗芽孢桿菌ZF04及在生防中應用，通過從鳳凰單叢茶樹根中取樣，分離純化、篩選和培養，獲得一株有較好生防效果的芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC No：60014，菌種在生理生化特性和分子水平方面與常見的芽孢桿菌具有明顯的差異，是一種典型的新菌種，ZF04菌株對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌和立枯絲核菌有較好的抑菌作用，菌絲生長抑制率分別為77.55％、83.30％、74.52％和75.19％，ZF04對瓜果腐霉菌絲生長抑制率為31.60％，是一種典型性突出、專一性強的生防菌，在生防中具有廣泛的應用價值。GDMCC No.6001420160310
【專利說明】
鳳凰單叢茶樹內生拮抗芽孢桿菌ZF04及在生防中應用
技術領域
[0001] 本發明涉及農業生物生防技術領域，具體涉及一種從鳳凰單叢茶樹內生拮抗菌及 其在生物防治中應用的技術領域。
【背景技術】
[0002] 植物內生菌(Endophyte)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物各種 組織內部或細胞間隙，而不使宿主產生明顯病理癥狀的微生物。拮抗內生菌是指能夠產生 拮抗作用的微生物。植物體是一個復雜的微生態系統，健康植物體內含有大量的內生細菌 (Endophytic Bacteria)，已從小麥、棉花、水稻、花生、馬鈴薯、番前、梓檬、柑桔等50多種植 物體內分離鑒定出內生細菌50多個屬，幾乎所有健康植物體內均含有內生細菌。
[0003] 在農業種植業中，梨、核桃、紅棗、棉花等農作物遭受梨果黑斑病菌、核桃葉枯病 菌、梨腐爛病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核病菌等的侵害嚴重，化學殺菌劑是控制以上病害 常用的方法，但化學殺菌劑污染環境，誘導病菌產生抗藥性，破壞生態平衡，它的殘留問題 令人擔憂，因此植物病害的生物防治研究越來越受到重視。
[0004] 目前植物病害的生物防治是利用有益微生物和微生物代謝產物對農作物病害進 行有效防治的技術與方法。單叢茶是我國重要的茶樹品種，從單叢茶樹內生細菌中篩選出 對植物病原菌有抑菌作用的拮抗菌株，對開發生物防腐劑及抑菌劑，保障食品和環境安全 具有重要的意義。
[0005] 國外已有報道從不同的植物中分離出Acinotobacter、Agrobacterium、 Alcaligenes、Bacillus、Clavibacter、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、 Phyl lobacterium、Pseudomonas和Serratia等屬的內生細菌。國內黃曉琴，張麗霞等從茶樹 內生菌中進行了冰核細菌拮抗菌的篩選，得到菌株Y1，通過對其進行形態學觀察、生理生化 指標測定及16SrDNA序列測定，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。羅 明對新疆棉花植株組織中的內生細菌進行分離，共得到102個菌株，初步鑒定分屬于芽孢桿 菌屬(Bacillus sp·)、黃單抱菌屬(Xanthomonas sp·)、假單抱菌屬(Pseudomonas sp·)、歐 文氏菌屬(Erwinia sp.)及短小桿菌屬(Curtobacterium sp·)，從中篩選出對棉花枯萎病 菌有體外拮抗活性的菌株22個，對立枯絲核菌有體外拮抗活性的菌株15株。
[0006] 生物防治不僅可降低對環境的影響，還不易產生抗藥性。芽孢桿菌營養簡單，在自 然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環境，可研究其用于植物病害的生物防治，為研 究開發生物防控菌殺菌劑奠定基礎。
[0007] 鳳凰單叢茶產于潮州市鳳凰山，素以滋味濃醇鮮爽，香氣似天然花果香著稱，種植 歷史悠久，種質資源豐富，已達80多個品系。目前對鳳凰單叢茶的研究主要集中在品種鑒 定、遺產多樣性分析、品質化學特性、生理活性、質量安全和做青工藝的研究，對于鳳凰單叢 茶樹內生菌的研究不多。因此對鳳凰單叢茶樹內生菌進行分離，從中篩選出具有抑菌活性 的拮抗菌株都具有重要的意義。

【發明內容】

[0008] 針對現有技術中關于鳳凰單叢茶樹內生細菌對常見細菌腐敗菌和梨果黑斑病菌、 核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌的研究未見報道，本 發明旨在于提供一種新的鳳凰單叢茶樹內生拮抗芽孢桿菌ZF04及在生防中應用，通過試驗 證明獲得新的菌種對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉 菌等植物病原菌具有相對高防治能力且性能穩定，表明本發明提供一種新的抗性菌株，作 為植物病原菌的生物防治材料，無論開發新的生物農藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很 好的應用前景。
[0009] 本發明采用的主要技術方案：
[0010] 本發明通過鳳凰單叢茶樹根中分離篩選出一株對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、 紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌有較高抑制效果的細菌菌株ZF04， 是與常見的芽孢桿菌(Bacillus)不同的新菌種，通過利用分離出的新菌種對梨果黑斑病 菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌進行抑菌試驗， 并提供一種利用芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014進行植物病原菌生物防治 中應用技術方案，ZF04菌株對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌和立枯絲核菌有 較好的抑菌作用，菌絲生長抑制率分別為77.55%、83.30%、74.52%和75.19%，2?04對瓜 果腐霉菌絲生長抑制率為31.60%，作為植物病原菌的生物防治材料，無論開發新的生物農 藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好的應用前景。
[0011] 本發明通過從鳳凰單叢茶樹根中取樣，進行分離、篩選和培養，從中篩選出一株編 號為ZF04的菌株，經微生物學分類與鑒定，該菌株從其分類學角度屬于芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株。本發明采用菌株編號為ZF04的細菌菌株，通過對所獲菌株進行形態特征、生理生 化特性及總DNA的提取、16SrDNA的PCR擴增和序列測定及系統發育分析，獲得一種與常見的 芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株存在明顯不同特性的芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株，從科學角 度證明了是一株新菌，并確定其分類地位。同時，利用篩選出的菌株ZF04對梨果黑斑病菌、 核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌進行抑菌試驗，ZF04菌株對梨果黑 斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌和立枯絲核菌有較好的抑菌作用，菌絲生長抑制率分 別為77.55%、83.30%、74.52%和75.19%，ZF04對瓜果腐霉菌絲生長抑制率為31.60%，是 一種典型性突出、專一性強的生防菌。
[0012] 本發明具體提供一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04GDMCC N〇:60014,通過從鳳凰 單叢茶樹根中分離、篩選和培養，獲得一批芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，從中篩選出一株對 防治梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌方面具有突出 功效的芽孢桿菌ZF04,經微生物學分類與鑒定，屬于芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株。
[0013] 具體的，本發明通過從鳳凰單叢茶樹根中取樣，樣本是鳳凰單叢茶樹根，采集于廣 東省潮州饒平縣浮濱鎮，樹齡15、25和50年，種植海拔高度750m，茶樹品種為鳳凰單叢茶水 仙，進行分離、篩選和培養，從中篩選出一株編號為ZF04的菌株，經微生物學分類與鑒定，該 菌株屬于芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株。本發明采用菌株編號為ZF04的細菌菌株，該菌株 已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：廣東省微生物菌種保藏中心 (GDMCC)。地址:廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所，郵編:510075。 保藏日期為2016年3月10日，菌種保藏號為⑶MCC N〇:60014。該菌株最適生長條件為:溫度 37°C，培養基采用常見的牛肉膏蛋白胨液體培養基、營養瓊脂培養基。
[0014] 本發明提供的ZF04菌株，經20h培養后，在營養瓊脂培養基上菌落為白色，干燥，不 透明，中間褶皺凸起，周邊放射狀，邊緣不整齊。將菌種ZF04通過鏡檢觀察，該菌株屬革蘭氏 染色陽性，在顯微鏡下個體形態為短桿狀，單個或成鏈狀排列，產芽孢。根據以上形態特征， 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版及《常見細菌鑒定手冊》對菌株進行分類鑒定，并結合分 子生物學測序，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌(Bacillus sp.)。經分子測序結果表明，芽孢桿 菌（Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014的 16SrDNA基因序列為 1492bp，與NCBI數據庫 Bacillus cereus ATCC 14579(NR_074540.1)同源性最高，最高相似性為94%，但本發明提 供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014與常見的芽孢桿菌存在明顯的生理生 化特性差異和分子水平的差異性，依據菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統分類 學的綜合鑒定，編號為ZF04的菌種是一種典型的新菌種，有別于常見的芽孢桿菌 (Bacillus)，與常見的細菌菌種相比，其對鹽的耐受能力更強，對梨果黑斑病菌、核桃葉枯 病菌和紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌有較好的抑制作用，但是依據菌種生理生 化特性分析，分子水平分析及系統分類學的綜合鑒定，將編號為ZF04的菌種大致分類歸屬 為芽抱桿菌(Bacillus sp.)。
[0015] 本發明進而提供芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014的分離和培養方 法。
[0016] (1)分離培養基采用：牛肉膏蛋白胨液體培養基為牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉 5g、蒸餾水1000mL，pH 7.0-7.2，營養瓊脂培養基為蛋白胨1(^、牛肉膏38、氯化鈉58、瓊脂 15區、蒸饋水100〇111匕
[0017] (2)分離和篩選條件：
[0018] 根中內生細菌的分離:采用組織塊培養法，將表面消毒后的根剪成0.5X0.5cm的 組織塊，根采用樹齡15、25和50年，種植海拔高度750m，茶樹品種為鳳凰單叢茶水仙，每三個 組織塊為一組置于20mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 °C下培養20h，取80yL涂布于營養瓊 脂平板，37°C培養18h。待長出細菌菌落后，挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線涂 布于營養瓊脂平板，37°C培養18h，反復在營養瓊脂平板上劃線分離純化，直至得到單個純 菌落。
[0019] 經培養篩選確定的芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZR)4 GDMCC No.60014在營養瓊脂培 養基上菌落為白色，干燥，不透明，中間褶皺凸起，周邊放射狀；營養瓊脂培養基：蛋白胨 l〇g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL，pH自然。
[0020] 進一步，本發明提供一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014在生防 中的應用，通過將芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014在防治梨果黑斑病菌、核 桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌中應用，ZF04菌株對梨 果黑斑病菌、核桃葉枯病菌和紅棗黑斑病菌和立枯絲核菌有較好的抑菌作用，菌絲生長抑 制率分別為77.55 %、83.30 %、74.52 %和75.19%，ZF04對瓜果腐霉菌絲生長抑制率為 31.60%，是一種典型性突出、專一性強的生防菌。
[0021] 通過實施本發明具體技術指標，實現本
【發明內容】
，可以達到以下有益效果：
[0022] (1)本發明提供了一種新的鳳凰單叢茶樹內生詰抗菌-芽孢桿菌(Bacillus sp.) ZF04 GDMCC No:60014〇
[0023] (2)本發明提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014可高效抑制梨 果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌等植物病原菌，菌絲 生長抑制率分別為77.55%、83.30%、74.52%、75.19%和31.60%，經測定，ZF04對梨果黑 斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌有很強的抑制效果;作為 植物病原菌的生物防治材料，無論開發新的生物農藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好 的應用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1所示為芽孢桿菌(Bacillus sp. )ZF04 GDMCC N〇:60014的菌落形態和個體形 態圖。
[0025] 圖2所示為芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0026] 圖3所示為芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014系統發育樹狀圖。
[0027] 圖4所示為芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04GDMCC N〇:60014對大腸桿菌的抑制效果 圖。
[0028] 圖5所示為芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014對植物致病菌的抑菌 效果圖，圖中：D為梨果黑斑病菌，E為核桃葉枯病菌，G為紅棗黑斑病菌，X為瓜果腐霉，Y為立 枯絲核菌。
【具體實施方式】
[0029] 下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。本發明中選用 的所有原輔材料，以及選用的菌種培養方法都為本領域熟知選用的，本發明中涉及到的％ 都為重量百分比，除非特別指出除外。
[0030] 牛肉膏蛋白胨液體培養基：由溶劑和溶質組成，溶質為牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉，溶 劑為蒸餾水；加入牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL，在pH 7.0-7.2，在溫度 121°C的條件下滅菌15min。
[0031] 營養瓊脂培養基：由溶劑和溶質組成，溶質為牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂，溶劑 為蒸餾水;加入蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL，12rC條件下滅菌 15min〇
[0032] 水瓊脂培養基:加入瓊脂25g、蒸餾水1000mL，121°C條件下滅菌15min;
[0033] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA):由溶劑和溶質組成，溶質為馬鈴薯浸出粉、葡萄 糖、瓊脂，溶劑為蒸餾水;加入馬鈴薯浸出粉6g、葡萄糖20g、瓊脂12g、蒸餾水1000mL，12rC 條件下滅菌15min。
[0034] 采用主要設備儀器:LD2X-30KA型立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋、DHP-9162型電熱恒溫 培養箱武漢諾貝思機械制造有限公司；TGRADIENT型PCR儀、PowerPac型電泳儀、Fluorchem Xplor型熒光-可見光凝膠成像分析系統北京弘圖科技有限公司。
[0035] 采用的試驗指示細菌:A大腸桿菌(Escherichia coli)、B枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、C金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、P白色念珠球菌（Monilia albican)屬于常見的對照菌。
[0036] 采用的D梨果黑斑病菌（Alternaria alternate)、E核桃葉枯病菌（Walnut Blight)、F梨腐爛病菌(Valsa ambiens Pers)、G紅率黑斑病菌(Alternaria sp.)、H前腐鐮 刀病菌（Fusarium solani)、X 瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum)、Y 立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)為常見的植物病原菌，本領域普通技術人員可以通過病害作物梨、 核桃、紅棗、棉花、茄科植物中分離;細菌基因組DNA快速提取試劑盒、引物27F、引物1492R、2 XTapPCRMaster mix，生物生工(上海)有限責任公司。
[0037] 本發明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養方法都為本領域熟知選用 的，本發明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。
[0038] 實施例一:芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014的分離、篩選及鑒定 [0039] 1、菌種的分離和篩選
[0040]本發明所使用的芽孢桿菌(Bacillus sp.)由韓山師范學院從廣東省潮州饒平縣 浮濱鎮中鳳凰單叢茶樹根中取樣，根樣本采用鳳凰單叢茶樹根，采集于廣東省潮州饒平縣 浮濱鎮，樹齡15、25和50年，種植海拔高度750m，茶樹品種為鳳凰單叢茶水仙，有機種植。經 過采用組織塊培養法分離出根中內生細菌，以不同的培養溫度、pH值、培養基為富集條件， 經過優化篩選出一批生長良好的細菌菌株，從中優選出一株編號為ZF04的菌株。
[0041 ] 分離步驟：
[0042] (1)分離培養基采用：牛肉膏蛋白胨液體培養基為牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉 5g、蒸餾水1000mL，pH 7.0-7.2)，營養瓊脂培養基為蛋白胨1(^、牛肉膏38、氯化鈉58、瓊脂 15區、蒸饋水100〇111匕
[0043] 表面消毒:先將根剪成約5cm長，用75 %乙醇浸泡根4min，無菌水沖洗7次，用3.0 % 的雙氧水浸泡3min，再用無菌水沖洗10次。
[0044] (2)分離純化：
[0045] 根中內生細菌的分離:采用組織塊培養法，將上述步驟表面消毒后的鳳凰單叢茶 樹根剪成0.5X0.5cm的組織塊，每三個組織塊為一組置于20mL牛肉膏蛋白胨液體培養基 中，37 °C下培養20h，取80yL涂布于營養瓊脂平板，37 °C培養18h。待長出細菌菌落后，挑取形 狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線涂布于營養瓊脂平板，37°C培養18h反復在營養瓊脂 平板上劃線分離純化，直至得到單個純菌落。
[0046] 2、菌株的培養條件
[0047] (1)編號為ZF04的菌株的生長培養基牛肉膏蛋白胨液體培養基，牛肉膏5g、蛋白胨 1 〇g、氯化鈉5g、蒸餾水 1 OOOmL，pH 7 · 0-7 · 2，經37 °C、20h培養。
[0048] (2)編號為ZF04的菌株在37°C_45°C條件下均能生長，最適生長溫度為37°C，培養 時間為20h。
[0049] (3)編號為ZF04的菌株的生長pH為7 · 0-7 · 2。
[0050]上述采用菌株編號為ZF04的細菌菌株，該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約 微生物國際保藏單位:廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)。地址:廣州市先烈中路100號大 院59號樓5樓，廣東省微生物研究所，郵編:510075。保藏日期為2016年3月10日，菌種保藏編 號為GDMCC No: 60014。該菌株最適生長條件為:溫度37°C，培養基采用牛肉膏蛋白胨液體培 養基(牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL，pH 7.0-7.2)、營養瓊脂培養基(蛋白 胨l〇g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15g、蒸餾水lOOOmL)。經20h培養后，在營養瓊脂培養基上 菌落為白色，干燥，不透明，中間褶皺凸起，周邊放射狀。將菌種ZF04通過鏡檢觀察，該菌株 屬革蘭氏染色陽性，在顯微鏡下個體形態為短桿狀，單個或成鏈狀排列，產芽孢。芽孢桿菌 (Baci 1 lus sp ·)ZF04菌落和個體形態參見附圖1。
[0051]本發明采用的菌株ZF04可在常見的牛肉膏蛋白胨固體培養基或液體培養基中進 行增殖培養。利用常規固體斜面培養、低溫保藏的方法，每次傳代可保藏3個月以上；以干燥 冷凍法制做的長期保藏菌種，可保藏1年以上;或是以甘油管進行長期保藏。
[0052] 3、菌株ZF04的生理生化鑒定
[0053]生理生化特征：該菌株ZF04在牛肉膏蛋白胨液體培養基、營養瓊脂培養基上生長 良好，經試驗，選擇v-ρ試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、接觸酶試驗、4 °C生長試驗、酪氨酸水解 試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、10%NaCl生長試驗、檸檬酸鹽利用試 驗、糖類產酸試驗對拮抗細菌進行鑒定，結果表明菌株ZF04可以利用葡萄糖、檸檬酸鹽、淀 粉、明膠，耐受10 % NaCl，菌株ZF04生理生化特性見表1。
[0054] 表1:菌株ZF04的生理生化特性
[0056] 通過上述對于菌種芽孢桿菌(Bacillus sp. )ZF04 GDMCC N〇:60014的菌體形態、 培養特征觀察及生理生化指標測定，即通過菌體形態觀察、菌株培養特征觀察、生長溫度測 定、耐性試驗等試驗，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版及《常見細菌鑒定手冊》的方法進 行，編號為ZF04的菌種盡管與常見的芽孢桿菌相比，具有共性的一些屬性，但是與常見的芽 孢桿菌菌種存在明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明ZF04菌株是一種典型 的新菌種，從菌種分類角度將菌種編號為ZF04的菌株綜合鑒定為芽孢桿菌（Bacillus sp.) 〇
[0057] 實施例二:芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014分子水平鑒定
[0058] 利用細菌DNA基因組快速提取試劑盒提取目標菌系DNA。
[0059] 引物選用細菌通用引物，細菌16SrDNA通用引物序列：
[0060] 27F：57-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-37
[0061 ] 1492R：57-GGTTACCTTGTTACGACTT-37
[0062] 本申請所用引物27F、引物1492R、2XTapPCRMaster mix均購自生物生工(上海)有 限責任公司。
[0063] 提取基因組DNA采用的20yLPCR擴增體系：引物27F和引物1492R各1.0yL、2X TapPCRMaster mix7. OyL、內生細菌的DNA混合液 1. OyL、雙蒸水 10.0 yL。
[0064] PCR擴增程序:94°C預變性5min、94°C變性3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：延伸4〇8，從變性 到延伸30個循環，72 °C延伸7min，保溫4min 1CR產物經1.8 %瓊脂糖電泳，EB染色后由熒光-可見光凝膠成像分析系統檢測。
[0065]以提取的ZF04總DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，將擴增產 物回收并進行測序，測得的序列是具有序列表的核苷酸序列。菌種ZF04的16SrDNA擴增產物 的瓊脂凝膠電泳約在1500bp處出現熒光條帶，參見附圖2。
[0066] 經測定，芽孢桿菌（Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014的 16SrDNA基因片段為 149 2bp，序列提交GenBank數據庫，具體序列參見附后的SEQUENCE LI ST ING。
[0067] 將測序得到的16S rDNA序列輸入NCBI，與NCBI數據庫中已知序列進行比對，采用 MEGA5.0軟件、Clustal W程序進行多重比對，然后以各菌株在NCBI上查詢的相近各個種的 16S rDNA序列，采用Neighbour-joining方法構建系統發育樹，并進行bootstrap分析，重復 次數為1000次，參見附圖3JF04菌株16S rDNA序列與NCBI數據庫Bacillus cereus ATCC 14579(NR_074540.1)同源相似性為94%，與該屬其他標準菌株序列比對同源性分別為94% (Bacillus thuringiensis IAM 12077(NR_043403.1))n94%(Bacillus pseudomycoides NBRC 101232(NR_113991.1))、94%(Bacillus toyonensis BCT-7112(NR_121761.1))及 94%(Bacillus weihenstephanensis DSM 11821(NR_024697.1))。初步斷定為該屬潛在新 種。結合ZF04的形態結構特征及生理生化特性，經序列比對表明，初步鑒定為芽孢桿菌 (Bacillus sp.)〇
[0068] 實施例三:芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014的生長因子
[0069] 表3:溫度、pH、NaCl對菌株ZF04生長的影響
[0071] 按照如上方式將芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014進行培養，菌種 的培養條件為:培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基和營養瓊脂培養基，培養條件:PH7.0，溫 度37°C條件下培養20h。
[0072] 由表3得出，菌株ZF04最適合生長因子通過以上結果得出將芽孢桿菌（Bacillus sp.)ZR)4 GDMCC N〇:60014的最佳培養溫度為37°C，最適生長pH為7.0,耐受10%NaCl。
[0073] 實施例四：芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014對試驗指示細菌的抑 菌作用
[0074] 采用雙層平板法測定芽孢桿菌(Bacillus sp. )ZF04對以下試驗指示細菌的抑制 作用:A大腸桿菌(Escherichia coli)、B枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、C金黃色葡萄 球菌（Staphylococcus aureus)、P 白色念珠球菌(Monilia albican):
[0075] (1)菌株的活化:分別挑取一環保存于營養瓊脂平板上的試驗指示細菌和ZF04,分 別劃線于營養瓊脂平板上，37°C下培養20h。
[0076] (2)挑取ZF04純菌落三環接種于50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37°C、150r/min 培養72h，將培養后的菌液經5000r/min離心10min，取上清液，經0.22μπι濾膜過濾，去除菌 體，制成ZF04無菌發酵濾液。
[0077] (3)滅菌后的水瓊脂15mL倒在直徑為9cm的培養皿內，待其凝固，將滅菌的100mL營 養瓊脂培養基冷卻到50°C左右，加入1.25mL含有1 X 104-1 X 105cfu/mL試驗指示細菌的菌 液，搖均，取5mL加到水瓊脂平板上;凝固后用打孔器(外徑8mm)打孔，孔中加入ZF04菌株無 菌發酵濾液240yL，同時在孔中加入240yL無菌水作對照，在4°C冰箱放置2h使無菌發酵濾液 擴散，37 °C培養18h，測量抑菌圈直徑。
[0078] 由測定結果可知，參見附圖4，ZF04菌株對大腸桿菌有抑菌作用，其抑菌圈直徑為 14.36mm;對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠球菌沒有抑菌作用。
[0079] 實施例五:芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014對植物病原菌的抑菌 作用
[0080] 采用對峙培養法測定芽孢桿菌(Bacillus sp. )ZF04對以下植物病原菌的抑制作 用，D梨果黑斑病菌(Alternaria alternate)、E核桃葉枯病菌(Walnut Blight)、F梨腐爛病 菌（Valsa ambiens Pers)、G紅率黑斑病菌（Alternaria sp.)、H前腐鏡刀病菌（Fusarium solani)、X瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum)、Y立枯絲核菌（Rhizoctonia solani):
[0081] (1)菌株的活化:挑取一環保存于營養瓊脂平板上的ZF04劃線于營養瓊脂平板上， 37 °C下培養20h，挑取一環植物病原菌劃線于PDA培養基上，28 °C下培養5d。
[0082] (2)挑取步驟（1)中得到的ZF04純菌落三環接種于50mL牛肉膏蛋白胨液體培養基 中，37°C、150r/min培養72h，將培養后的菌液經5000r/min離心10min，取上清液，經0.22μπι 濾膜過濾，去除菌體，制成ZF04無菌發酵濾液。
[0083] (3)將內生細菌ZF04無菌發酵濾液200yL涂布于PDA平板上，對照為涂布200yL無菌 水，取直徑為1 X 1 cm的植物病原菌菌塊放于PDA平板正中央，28 °C培養5d，測量菌落直徑，計 算菌絲生長抑制率。
[0084]菌絲生長抑制率的計算公式如下：
[0086]式中，B為對照植物病原菌菌落生長直徑(mm) ;T為涂內生細菌發酵濾液后植物病 原菌菌落生長直徑(mm)。
[0087]由測定結果可知，參見附圖5，ZF04菌株對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑 病菌和立枯絲核菌有較好的抑菌作用，菌絲生長抑制率分別為77.55%、83.30%、74.52% 和75.19%，ZR)4對瓜果腐霉菌絲生長抑制率為31.60%，經測定，ZF04對梨果黑斑病菌、核 桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌和立枯絲核菌均有很強的抑制效果。
[0088]通過上述系列實施例，根據由韓山師范學院從廣東省潮州饒平縣浮濱鎮中鳳凰單 叢茶樹根中取樣，樣品為茶樹的根，采集于廣東省潮州饒平縣浮濱鎮，樹齡15、25和50年，種 植海拔高度750m，茶樹品種為鳳凰單叢茶水仙，有機種植，經過采用組織塊培養法分離出根 中內生細菌，以不同的培養溫度、pH值、培養基為富集條件，篩選出一批生長良好的細菌菌 株，從中優選出一株編號為ZF04的菌株。根據以上形態特征，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第 八版及《常見細菌鑒定手冊》對菌株進行分類鑒定，并結合分子生物學測序，初步鑒定該菌 株為芽孢桿菌(Bacillus sp.)。分子測序結果表明，芽孢桿菌(Bacillus sp.)ZF04 GDMCC N〇:60014的 16SrDNA基因序列為 1492bp，與NCBI數據庫Bacillus cereus ATCC 14579(NR_ 074540.1)同源性最高，最高相似性為94%，但本發明提供的芽孢桿菌(Bacillus sp. )ZF04 GDMCC No:60014與常見的細菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，依據 菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統分類學的綜合鑒定，編號為ZF04的菌種在生 理生化特性和分子水平方面與常見的芽孢桿菌具有明顯的差異，是一種典型的新菌種，有 別于常見的芽孢桿菌(Bacillus)，與常見的細菌菌種相比，其對鹽的耐受能力更強，對梨果 黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌有較好的抑制作用，但 是依據菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統分類學的綜合鑒定，編號為ZF04的菌 種為芽孢桿菌(Bacillus sp.)。
[0089]上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。 對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化 或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見的變化 或變動仍處于本發明的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種鳳凰單叢茶樹內生詰抗芽孢桿菌(Bacillus sp. )ZF04,其特征在于，所述的芽 抱桿菌(Bacillus sp.)ZF04菌種保藏號為GDMCC N〇:60014。2. 如權利要求1所述鳳凰單叢茶樹內生詰抗芽孢桿菌(Bacillus sp. )ZF04在防治梨果 黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌和瓜果腐霉菌中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK105969682SQ201610297834
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月28日
【發明人】傅力, 蔡麗, 王忠合, 王軍, 侯小楨
【申請人】韓山師范學院